BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng - 2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng - 2005 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com i LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trường Các Thầy Cô anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nơng Lâm TP.Hồ Chí Minh tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực tập tốt nghiệp Cơ Bích Liên, Thầy Ngọc, chị Trang Thầy Cô khoa Chăn Nuôi Thú Y tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt trình thực tập tốt nghiệp Các bạn lớp Công Nghệ Sinh học 27 động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS Nguyễn Ngọc Hải PGS.TS Trần Thị Dân tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, người sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ bên thời điểm Thủ Đức, ngày 25 tháng 08 năm 2005 Nguyễn Nhất Bảo Quốc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii TÓM TẮT NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Đề tài: “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN” Đề tài thực từ ngày 10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Hội đồng hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải PGS.TS Trần Thị Dân Mục tiêu đề tài thăm dị khả sử dụng quy trình RT-PCR để phát virus gây bệnh PRRS lợn Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Xây dựng quy trình RT-PCR mẫu RNA chuẩn virus gây bệnh PRRS đồng thời kiểm tra khả ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start công ty Promega, Taq polymerase công ty Biorad, Taq polymersa cơng ty ABgene) - Ly trích RNA mẫu phổi quy trình dùng TRIzol điện di RNA tổng số nhằm kiểm tra khả sử dụng quy trình việc ly trích RNA virus - Ly trích RNA từ mẫu huyết dịch nuôi cấy tế bào từ lợn nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết ELISA Sau thực phản ứng RT-PCR để kiểm tra diện RNA virus gây bệnh PRRS mẫu Kết quả, thành công việc xây dựng quy trình phát RNA chuẩn virus gây bệnh PRRS áp dụng thành công việc sử dụng TRIzol để ly trích RNA Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ mẫu thu nhận hai quy trình sử dụng kit sử dụng TRIzol, kết thu nhận tất mẫu xét nghiệm khơng có diện virus thời điểm xét nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii MỤC LỤC Tên mục Trang LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix Phần I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.1 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Lịch sử bệnh 2.1.3 Dịch tễ học 2.1.4 Các đường lây nhiễm 2.1.4.1 Sự lây truyền dọc 2.1.4.2 Sự lây truyền ngang 2.1.5 Triệu chứng lâm sàng 2.1.6 Bệnh tích Các phương pháp dùng chẩn đóan bệnh virus PRRS gây 2.2 2.2.1 Phân lập virus sống 2.2.2 Phân lập virus kháng nguyên virus 2.2.3 Phương pháp phát kháng thể huyết 10 2.2.4 Phương pháp RT- PCR để phát virus gây bệnh PRRS 12 2.3 Phương pháp PCR 13 2.3.1 Nguyên tắc 13 2.3.2 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 13 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 14 2.3.4 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv Phương pháp RT-PCR 16 2.4 2.4.1 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR 16 2.4.2 Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược 16 2.4.3 Các primer phiên mã ngược 18 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 3.3 Vật liệu hóa chất 20 3.3.1 Mẫu xét nghiệm 20 3.3.2 Cặp primer phản ứng RT-PCR 20 3.3.3 Vật liệu hóa chất cho chiết tách RNA 21 3.3.4 Vật liệu hóa chất cho điện di RNA 21 3.3.5 Vật liệu hóa chất cho RT-PCR 21 3.3.6 Vật liệu hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 22 3.4 Thiết bị dụng cụ 22 3.5 Các phương pháp 22 3.5.1 Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào 22 3.5.2 Chẩn bị bảo quản mẫu huyết 23 3.5.3 Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào huyết theo quy trình sử dụng TRIzol 23 3.5.4 Phương pháp điện di RNA gel biến tính 24 3.5.5 Phương pháp RT-PCR RNA virus 25 3.5.6 Điện di sản phẩm RT-PCR 27 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết RT-PCR mẫu chuẩn PRRSV 28 4.1.1 RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) 28 4.1.2 RT-PCR với Taq polymerase Biorad ABgene 29 4.2 Kết RT-PCR mẫu RNA ly trích 30 4.2.1 RT-PCR với Taq beat hot start RNA ly trích từ huyết phương pháp sử dụng TRIzol 30 4.2.2 RT-PCR với Taq polymerase Biorad ABgene mẫu ly trích từ dịch ni cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo kit 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v 4.3 Điện di RNA mẫu ly trích 32 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer 33 4.5 RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 33 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT - AMV: Avian myeloblastosis virus - DEPC: Diethyl pyrocarbonate - dNTP: Deoxynucleotide triphosphate - EAV: Equine arteritis virus - EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide - ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay - FAb: Fluorescent antibody - FA: Formaldehyde agarose - IHC: Immunohistochemistry staining - IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay - LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus - MDS: Mystery swine disease - MOPS: 3- morpholine propane sulphonate - ORF: Open reading fraction - PAMs: Pulmonary alveolar macrophage - PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus - RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction - SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus - SNV: Serum neutralization virus - TBE: Tris borate EDTA - TE: Tris EDTA - μl: Micro lit LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Tên mục Trang Sơ đồ 2.1 Quá trình hoặt động primer phiên mã ngược 19 Bảng 3.1 Cặp primer sử dụng phản ứng 21 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR 25 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR 26 Hình 4.1 Sản phẩm RT-PCR mẫu RNA chuẩn dùng với Taq Beat Hot Start 28 Hình 4.2 Sản phẩm RT-PCR mẫu RNA chuẩn dùng Taq polymerase công ty Biorad Abgene 29 Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat mẫu chuẩn mẫu ly trích theo TRIzol 30 Hình 4.4 Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene mẫu chuẩn mẫu ly trích theo kit 31 Hình 4.5 Sản phẩm điện di RNA sau ly trích 32 Hình 4.6 Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 mẫu RNA chuẩn mẫu huyết ly trích theo quy trình dùng TRIzol 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... tài: ? ?ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT- PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN” Đề tài thực từ ngày 10 /03/2005 đến ngày 15 /08/2005 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***00*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN Giáo viên... HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix Phần I: MỞ ĐẦU 1. 1 Đặt vấn đề 1. 2 Mục đích yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn