Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát hiện vi rút hanta trên chuột tại một số điểm ở hà nội, năm 2015 – 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Hà Mỵ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR PHÁT HIỆN VI RÚT HANTA TRÊN CHUỘT TẠI MỘT SỐ ĐIỂM Ở HÀ NỘI, NĂM 2015 - 2016 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Hà Mỵ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR PHÁT HIỆN VI RÚT HANTA TRÊN CHUỘT TẠI MỘT SỐ ĐIỂM Ở HÀ NỘI, NĂM 2015 - 2016 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS Nguyễn Thị Kiều Anh PGS TS Võ Thị Thương Lan Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:  TS BS Nguyễn Thị Kiều Anh, Phó Giám Đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội Cơ truyền đạt cho tơi kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học, trực tiếp hướng dẫn tận tình suốt trình nghiên cứu Cô xây dựng ý tưởng, cung cấp kinh phí tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn  PGS TS Võ Thị Thương Lan, Trưởng phòng thí nghiệm Sinh Y, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Cô tạo điều kiện cho tiếp xúc với kiến thức khoa học, hướng dẫn tơi từ thí nghiệm khoa học  Ths Nguyễn Tuyết Thu, Ths Nguyễn Vĩnh Đông - phòng thí nghiệm dại lyssavirus, khoa Vi rút hỗ trợ tơi suốt q trình thực luận văn  PGS TS Nguyễn Thị Lan Anh, Trưởng khoa Miễn dịch Sinh học phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, bảo ngày trưởng thành cách sống, tư khoa học từ ngày đầu bước chân vào Viện Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị đồng nghiệp phòng thí nghiệm Chẩn đốn phân tử - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương giúp đỡ, ủng hộ tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng tri ân tới Bố Mẹ – người có cơng sinh thành ni dưỡng, dạy dỗ, hết lòng ủng hộ để tơi có thành hơm gửi lời cảm ơn đến Chồng – người bên động viên, chia sẻ khó khăn hạnh phúc sống hàng ngày Hà Nội, tháng 09 năm 2017 Phan Hà Mỵ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược lịch sử phát vi rút Hanta 1.2 Vi rút Hanta 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thái 1.2.3 Cấu trúc 1.2.4 Quá trình nhân lên vi rút Hanta 1.2.5 Phương thức khả gây bệnh 1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh vi rút Hanta 10 1.3.1 Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) 10 1.3.2 Hội chứng phổi vi rút Hanta (HPS) 12 1.4 Dịch tễ học bệnh vi rút Hanta 13 1.4.1 Tình hình dich ̣ tễ bệnh vi rút Hanta giới Việt Nam .13 1.4.2 Ổ chứa nguồn truyền bệnh .14 1.5 Chẩn đoán bệnh vi rút Hanta phòng thí nghiệm 19 1.5.1 Phương pháp chẩn đoán huyết học .20 1.5.2 Các phương pháp sinh học phân tử .22 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu .25 2.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1 Mẫu chứng 25 2.2.2 Sinh phẩm, hóa chất 26 2.2.3 Trang thiết bị, dụng cụ 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu .27 2.3.1 Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát vi rút Hanta xác định số thông số kỹ thuật 27 2.3.2 Áp dụng quy trình RT-PCR tối ưu hóa để phát vi rút Hanta trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng 29 CHƯƠNG - KẾT QUẢ 36 3.1 Kết tối ưu quy trình RT-PCR chẩ n đoán vi rút Hanta xác nhận số thông số kỹ thuật phương pháp .36 3.1.1 Kết tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta .36 3.1.2 Một số đặc điểm quy trình phát vi rút Hanta sử dụng kỹ thuật RT-PCR 38 3.2 Kết chẩn đoán vi rút Hanta chuô ̣t thu thâ ̣p ở mô ̣t số điạ điể m ta ̣i Hà Nô ̣i, năm 2015 - 2017 41 3.2.1 Mô ̣t số đă ̣c điể m về mẫu nghiên cứu 41 3.2.2 Kết chẩn đoán vi rút Hanta chuô ̣t .44 3.3.3 Kết phân tích đặc điểm di truyền đoạn gen M chủng phân lập năm 2015 năm 2016 49 CHƯƠNG - BÀN LUẬN 56 4.1 Tối ưu quy trình RT-PCR phát vi rút Hanta 56 4.2 Sự lưu hành vi rút Hanta chuột số điểm Hà Nội, năm 2015 2016 59 4.3 Phân loài đặc điểm phân tử đoạn gen M số chủng phân lập Hà Nội, năm 2015 - 2016 .61 KẾT LUẬN 71 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 80 DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Tên bảng Các giai đoạn điển hình, triệu chứng biến chứng bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) Sự phân bố địa lý vi rút Hanta gây bệnh cho người vật chủ tương ứng thuộc lồi gặm nhấm Trình tự mồi kỹ thuật RT-PCR phát vi rút Hanta Phân loại chuột thu thập số địa điểm nghiên cứu năm 2015 – 2017 Phân bố chuột theo thời gian thu thập Kết chẩn đoán vi rút Hanta theo loài chuột, năm 2015 - 2017 Kết chẩn đốn vi rút Hanta theo lồi chuột, năm 2015 - 2017 Trang 11 16 26 43 44 45 46 Độ tương đồng nucleotide axit amin chủng lưu Bảng 3.5 hành Hà Nội năm 2015, năm 2016 so với chủng 53 Việt Nam khu vực Trình tự axit amin (vị trí 629 – 769) gen M 02 chủng Bảng 3.6 phân lập nghiên cứu so sánh với chủng tham chiếu phân lập Việt Nam số nước lân cận 55 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét vi rút Sin Nombre Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hạt vi rút Hanta Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc hệ gen vi rút Hanta Hình 1.4 Chu kỳ nhân lên vi rút Hanta Hình 1.5 Hình 2.2 Phân bớ trường hợp bệnh lâm sàng nhiễm vi rút Hanta thế giới, năm 2000 Sơ đồ cặp mồi SEO-MF 1936 SEO-MR 2353 đoạn trình tự gen M 14 26 Hình 3.1 Hình ảnh xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu phương pháp 36 Hình 3.2 Hình ảnh xác định số chu kỳ nhiệt tối ưu phương pháp 37 Hình 3.3 Hình ảnh xác định thời gian kéo dài tối ưu phương pháp 38 Hình 3.4 Hình ảnh xác định giới hạn phát phương pháp 39 Hình 3.5 Hình ảnh xác định độ lặp lại phương pháp 40 Hình 3.6 Hình ảnh xác định độ đặc hiệu phương pháp 41 Hiǹ h 3.7 Bản đồ thu thâ ̣p mẫu chuô ̣t, năm 2015 -2017 42 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 4.1 Hình 4.2 Hình 4.3 Hình ảnh điê ̣n di sản phẩ m PCR chẩn đoán vi rút Hanta từ mô phổ i của chuô ̣t Bản đồ phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta địa điểm nghiên cứu, năm 2015 – 2017 Cây gia hệ vi rút Hanta lưu hành Việt Nam số nước châu Á Cây gia hệ vi rút Hanta lưu hành giới xây dựng dựa trình tự axit amin protein N Cây gia hệ vi rút hanta dựa trình tự nucleotide gen S Cây gia hệ xây dựng trình tự gen S vi rút Hanta có biểu lâm sàng khác 45 48 50 63 64 65 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Biểu đồ 3.1 Biểu đồ 3.2 Tên biểu đồ Kết chẩn đoán chuột nhiễm vi rút Hanta theo điạ điể m nghiên cứu Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo tháng, năm 2015 – 2017 Trang 47 49 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Axit Deoxyribonucleic ARN : Axit Ribonucleic ELISA : Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzyme) HFRS : Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome (Sốt xuất huyết hội chứng thận) HPS : Hantavirus Pulmonary Syndrome (Hội chứng phổi vi rút Hanta) ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban Quốc tế Phân loại Vi rút) IgG : Immunoglobin G (Kháng thể miễn dịch lớp G) IgM : Immunoglobin M (Kháng thể miễn dịch lớp M) RT-PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi men chép ngược) MỞ ĐẦU Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae gây bệnh cho người khắp giới, không gây bệnh cho lồi gặm nhấm Người bị nhiễm bệnh hít phải khí dung từ chất thải (phân, nước tiểu) hay vết cắn động vật gặm nhấm có chứa vi rút Vi rút Hanta gây hai thể bệnh với tỷ lệ tử vong cao Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS - Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome) Hội chứng phổi vi rút Hanta (HPS - Hantavirus Pulmonary Syndrome) Thể bệnh vi rút Hanta ghi nhận tất châu lục Tuy nhiên, loài vi rút Hanta truyền bệnh cho người thông qua vật chủ định chúng phân bố theo các vùng địa lý khác nhau, gây bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu khác nhau, phân bố HFRS HPS bị giới hạn theo phân bố địa lý loài động vật gặm nhấm Vi rút thuộc phân họ Neotominae Sigmodontinae là nguyên nhân gây HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao lưu hành ở loài gặm nhấm khác phân bố khắp Bắc Nam Mỹ Do vậy, vùng ca bệnh nhiễm vi rút Hanta chủ yếu báo cáo HPS Tại Mỹ có vi rút Araraquara lưu hành ở vật chủ loài Necromys lasiurus, chúng nguyên nhân gây các ca HPS ở nước này Trong vi rút Dobrava-Belgrade truyền bệnh cho người qua loài chuột rừng Apodemus ponticus, bệnh chủ yếu biểu HFRS với tỉ lệ cao châu Âu Điển hình lồi Rattus norvegicus (ch ̣t cố ng) vật chủ vi rút Seoul có phân bố địa lý tồn giới, gây nên bệnh cảnh chủ yếu HFRS Châu Á châu lục có lịch sử lâu đời nhiễm vi rút Hanta Một số ý kiến cho HFRS tồn lâu khoảng 1.000 năm trước Trung Quốc Anh Quốc thời kỳ Trung Cổ, thực tế, HFRS lần phát khoảng thời gian chiến tranh Triều Tiên khiến 3.000 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện Tại châu Á, vi rút Haantan vi rút Seoul tác nhân gây HFRS Ở Việt Nam, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với vi rút từ 14-34% Cụ thể, khu vực phía Bắc, huyết dương tính với vi rút Hanta mà chủ yếu vi rút KẾT LUẬN Tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đốn vi rút Hanta mơ phổi chuột Quy trình sử dụng cặp mồi SEO-MF 1936 SEO-MR 2353 (Hua Wang cộng năm 2000); sinh phẩm tách chiết ARN từ mô ARN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit – QIAGEN; sinh phẩm khuếch đại One step RT-PCRQIAGEN với nhiệt độ bắt cặp 52oC, 35 chu kỳ, thời gian kéo dài chuỗi phút Quy trình có ̣ đă ̣c hiê ̣u cao, giới hạn phát 1x103 copy/phản ứng Tỷ lệ chuột nhiễm vi rút Hanta số điểm nghiên cứu 3,13%, toàn chuột nhiễm vi rút Hanta th ̣c lồi chuột cống Rattus novergicus Hai chủng vi rút Hanta phân lập năm 2015, 2016 thuộc lồi vi rút Seoul Có hai nhóm vi rút Hanta lưu hành Hà Nội, chủng phân lập năm 2015 nằm chung nhóm với vi rút lưu hành Việt Nam; chủng phân lập năm 2016 nằm chung nhóm với chủng lưu hành Trung Quốc Xuất đột biến axít amin đặc trưng chủng phân lập 2015 2016 tương ứng I20V K53R so với chủng vi rút Seoul, chủng lưu hành Việt Nam số nước lân cận Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Hàn Quốc 71 KIẾN NGHỊ Tăng cường giám sát vi rút Hanta phòng thí nghiệm Hà Nội mở rộng địa bàn khác có nguy để thực sớm biện pháp can thiệp phòng chống lây truyền vi rút Hanta từ chuột sang người Phân tích đủ 10 chủng vi rút Hanta phân lập để có tranh toàn diện mối liên hệ chủng lưu hành địa bàn Hà Nội với chủng xác định nghiên cứu trước Thực nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi rút Hanta Việt Nam để hiểu rõ nguồn gốc vi rút, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống bệnh vi rút Hanta hiệu 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y Tế (2003), "Quyết định số 33/2003/QĐ-BY - Thường quy giám sát phòng, chống bệnh dịch hạch", Hà Nội Trần Đức (2011), Nghiên cứu đặc điểm nhiễm virus Hanta số yếu tố liên quan cảng Hải Phòng giai đoạn 2003-2005, Luận án Tiến sĩ, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, Hà Nội Trần Đức (2009), "Nghiên cứu vi rút Hanta chuột Rattus Novergicus Hải Phòng mặt huyết thanh, giai đoạn 2003-2005", Tạp chí Y học Dự phòng, 6(105), tr 36-42 Trần Đức, Arikawa J., Trương Thừa Thắng (2009), "Phát vi rút Seoul chuột R novergicus Thành phố Hải Phòng, 2003-2005", Tạp chí Y học thực hành, 9(678), tr 5-7 Đặng Huy Huỳnh (2007), Động vật chí Việt Nam - Lớp Thú Mammalia, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Võ Thị Thương Lan, (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia, Hà Nội Vũ Thị Quế Hương (2015), "Điều tra giám sát vi rút hanta người động vật gặm nhấm khu vực miền nam Việt Nam 2012-2014", Tạp chí Y học Dự phòng, 5(165), tr Trương Thừa Thắng (2008), Nghiên cứu huyết học nhiễm virút Hanta số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Y học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, Hà Nội Tạ Đình Văn, (2010), Nguyên lý ứng dụng PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học - Bộ Y tế, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 10 Ake L., Plyusnin A., (2002), The molecular epidemiology of human viruses, Kluwer Academic Publishers, Boston 73 11 Arikawa J., Yoshimatsu K., Thang T U (2007), "Hantavirus Infection typical rodent-borne viral zoonosis", Tropical Medicine and Health, 35(2), pp 55-59 12 Cao S., Ma J., Cheng C (2016), "Genetic characterization of hantaviruses isolated from rodents in the port cities of Heilongjiang, China, in 2014", BMC Vet Res, 12, pp 69 13 Carleton Gajdusek M D D (1962), "Virus hemorrhagic fevers ", The Journal of Pediatrics, 60, pp 841-857 14 Dastgheib S., Irajie C., Assaei R (2014), "Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue", Iran J Med Sci, 39(3), pp 282-288 15 Dupinay T., Pounder K C., Ayral F (2014), "Detection and genetic characterization of Seoul virus from commensal brown rats in France", Virol J, 11, pp 32 16 Elgh F., Lundkvist A., Alexeyev O A (1997), "Serological diagnosis of hantavirus infections by an enzyme-linked immunosorbent assay based on detection of immunoglobulin G and M responses to recombinant nucleocapsid proteins of five viral serotypes", J Clin Microbiol, 35(5), pp 1122-1130 17 Evander M., Eriksson I., Pettersson L (2007), "Puumala hantavirus viremia diagnosed by real-time reverse transcriptase PCR using samples from patients with hemorrhagic fever and renal syndrome", J Clin Microbiol, 45(8), pp 2491-2497 18 Fauquet C M., Maniloff J (2005), Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Viruses, Elsevier Academic Press: San Diego 19 Firth C., Tokarz R., Simith D B (2012), "Diversity and distribution of hantaviruses in South America", Journal of Virology, 86(24), pp 13756 – 13766 20 Gregory J M., Hjelle B., Crowley M (2006), "Diagnosis and treatment of new world hantavirus infections", Current Opinion in Infectious Diseases, 19, pp 437–442 74 21 Hart C A.Bennett M (1999), "Hantavirus infections: epidemiology and pathogenesis", Microbes and Infection, 1, pp 1229−1237 22 Hepojoki J., Lankinen H (2012), "Hantavirus structure molecular interactions behind the scene", J Gen Virol, 93(Pt 8), pp 1631-1644 23 Hujakka H., Koistinen V., Kuronen I (2003), "Diagnostic rapid tests for acute hantavirus infections: specific tests for Hantaan, Dobrava and Puumala viruses versus a hantavirus combination test", J Virol Methods, 108(1), pp 117-122 24 Huong V T Q., Yoshimatsu K (2010), "Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, Vietnam", Emerging Infectious Diseases, 16(2), pp 363-365 25 Jiang H., Wang L M (2016), "Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome: Pathogenesis and Clinical Picture", Front Cell Infect Microbiol, 6, pp 26 Johansson P., Yap G (2010), "Molecular characterization of two hantavirus strains from different rattus species in Singapore", Virol J, 7, pp 15 27 Jonsson C B.Figueiredo L T.Vapalahti O (2010), "A global perspective on hantavirus ecology, epidemiology, and disease", Clin Microbiol Rev, 23(2), pp 412-441 28 Judith D E.Sabra L K (2008), "Immunological Mechanisms Mediating Hantavirus Persistence in Rodent Reservoirs", PLoS Pathogens, 4(11) 29 Kariwa H.Yoshimatsu K.Arikawa J (2007), "Hantavirus infection in East Asia", Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 30(5-6), pp 341-356 30 Kenneth H R (2009), "Optimization and Troubleshooting in PCR", PCR Primer: A Laboratory Manual, 4(4) 31 Klein S L., Bird B H., Nelson R J (2002), "Environmental and physiological factors associated with Seoul virus infection among urban populations of Norway rats", Journal of Mammalogy, 83(2), pp 478–488 32 Koma T., Yoshimatsu K., Yasuda S P (2013), "A survey of rodent-borne pathogens carried by wild Rattus spp in Northern Vietnam", Epidemiology & Infection, 141, pp 1876-1884 75 33 Korva M a., Duh D., Saksida A (2009), "The hantaviral load in tissues of naturally infected rodents", Microbes and Infection, 11, pp 344 - 351 34 Kramski M., Meisel H., Klempa B (2007), "Detection and typing of human pathogenic hantaviruses by real-time reverse transcription-PCR and pyrosequencing", Clin Chem, 53(11), pp 1899-1905 35 Kruger D H., Figueiredo L T., Song J W (2015), "Hantaviruses globally emerging pathogens", J Clin Virol, 64, pp 128-136 36 Lagerqvist N., Hagstrom A., Lundahl M (2016), "Molecular Diagnosis of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Caused by Puumala Virus", J Clin Microbiol, 54(5), pp 1335-1339 37 Lednicky J A (2003), "Hantaviruses - A Short Review", Arch Pathol Lab Med., 127(30), pp 30–35 38 Lee H W.Lee P W.Johnson K M (1978), "Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever", J Infect Dis, 137(3), pp 298-308 39 LUAN V D., YOSHIMATSU K., ENDO R (2012), "Studies on Hantavirus Infection in Small Mammals Captured in Southern and Central Highland Area of Vietnam", Journal of Veterinary Medical Science, 74(9), pp 1155–1162 40 McCaughey C.Hart C A (2000), "Hantaviruses ", J Med Microbiol, 49(7), pp 587-599 41 Meyer B J.Schmaljohn C S (2000), "Persistent hantavirus infections: characteristics and mechanisms", Trends Microbiol, 8(2), pp 61-67 42 Mir M A (2010), "Hantaviruses", Clin Lab Med, 30(1), pp 67-91 43 Muranyi W.Bahr U.Zeier M (2005), "Hantavirus infection", J Am Soc Nephrol, 16(12), pp 3669-3679 44 Muyangwa M., Martynova E V., Khaiboullina S F (2015), "Hantaviral Proteins: Structure,Functions, and Role in Hantavirus Infection", Frontiers in Microbiology, 76 45 Palma R E., Polop J J., Owen R D (2012), "Ecology of rodent-associated hantaviruses in the Southern Cone of South America: Argentina, Chile, Paraguay, and Uruguay", J Wildl Dis, 48(2), pp 267-281 46 Peters C J.Khan A S (2002), "Hantavirus Pulmonary Syndrome: The New American Hemorrhagic Fever", Clin Infect Dis, 34(9), pp 1224-1231 47 Peters C J.Simpson G L.Levy H (1999), "SPECTRUM OF HANTAVIRUS INFECTION: Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavirus Pulmonary Syndrome", Annu Rev Med., 50, pp 531–545 48 Pettersson L., Klingstrom J., Hardestam J (2008), "Hantavirus RNA in saliva from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome", Emerg Infect Dis, 14(3), pp 406-411 49 QIAGENE, QIAGEN OneStep RT-PCR Kit - Quick-Start Protocol 2011 50 QIAGENE, RNeasy® Lipid Tissue Handbook 2009 51 Renata Carvalho de Oliveira, Alexandro Guterres, Jorlan Fernandes (2014), "Hantavirus Reservoirs: Current Status with an Emphasis on Data from Brazil", Viruses, 6, pp 1929-1973 52 Ridgeway J A (2014), "Comparison of RNA isolation methods from insect larvae", J Insect Sci, 14 53 Salim MattarCamilo Guzma´nFigueiredo L T (2015), "Diagnosis of hantavirus infection in humans", Expert Rev Anti Infect Ther., pp 1-8 54 Schmaljohn C S.Hjelle B (1997), "Hantaviruses: A Global Disease Problem", Emerging Infectious Diseases, 3(2), pp 95-104 55 Shi X., Liang M., Hang C (1998), "Nucleotide sequence and phylogenetic analysis of the medium (M) genomic RNA segments of three hantaviruses isolated in China", Virus Res, 56(1), pp 69-76 56 Shu-Yuan XiaoLiang M.Schmaljohn C S (1993), "Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with haemorrhagic fever with renal syndrome in China", Journal of General Virology, 74, pp 1657-1659 77 57 TRUONG T T., YOSHIMATSU K., ARAKI K (2009), "Molecular Epidemiological and Serological Studies of Hantavirus Infection in Northern Vietnam", J Vet Med Sci., 71(10), pp 1357–1363 58 Vaheri A.Vapalahti O.Plyusnin A (2008), "How to diagnose hantavirus infections and detect them in rodents and insectivores", Rev Med Virol, 18(4), pp 277-288 59 Vapalahti O., Lundkvist A., Fedorov V (1999), "Isolation and characterization of a hantavirus from Lemmus sibiricus: evidence for host switch during hantavirus evolution", J Virol, 73(7), pp 5586-5592 60 Wang H., Yoshimatsu K., Ebihara H (2000), "Genetic Diversity of Hantaviruses Isolated in China and Characterization of Novel Hantaviruses Isolated from Niviventer confucianus and Rattus rattus", Virology 278, pp 332–345 61 Wang Y P., Zhang X L., Zhang J M (2015), "Complete Genome Sequence of a Novel Mutation of Seoul Virus Isolated from Suncus murinus in the Fujian Province of China", Genome Announc, 3(2) 62 Watson D C., Sargianou M., Papa A (2013), "Epidemiology of Hantavirus infections in humans: A comprehensive, global overview", Crit Rev Microbiol, pp 1-12 63 Xiao S Y., Leduc J W., Chu Y K (1994), "Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae", Virology, 198(1), pp 205-217 64 Xiao S Y., Yanagihara R., Godec M S (1991), "Detection of hantavirus RNA in tissues of experimentally infected mice using reverse transcriptase-directed polymerase chain reaction", J Med Virol, 33(4), pp 277-282 65 Yoshimatsu K.Arikawa J (2014), "Serological diagnosis with recombinant N antigen for hantavirus infection", Virus Res, 187, pp 77-83 66 Z B.B F P.E R C (2008), "Hantavirus infection: a review and global update", J Infect Dev Ctries, 2(1), pp 3-23 78 67 Zhang Y.-Z., Zou Y., Fu Z F (2010), "Hantavirus Infections in Humans and Animals, China", Emerging Infectious Diseases, 16(8), pp 1195 - 1203 68 Zou L.-X.Chen M.-J.Sun L (2016), "Haemorrhagic fever with renal syndrome: literature review and distribution analysis in China", International Journal of Infectious Diseases, 43, pp 95–100 Trang web 69 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoPreview.jsp?ID=6196 70 http://vntime.vn/4278/print-article.html 79 PHỤ LỤC Kết giải trình tự chủng CP0815 chiều 5’, sử dụng mồi xuôi SEO-MF 1936 80 Kết giải trình tự chủng CP0815 chiều 3’, sử dụng mồi ngược SEO-MR 2353 81 Kết giải trình tự chủng gp010816 chiều 5’, sử dụng mồi xuôi SEO-MF 1936 82 Kết giải trình tự chủng gp010816 chiều 3’, sử dụng mồi ngược SEO-MR 2353 83 Kết so sánh độ tương đồng trình tự nucleotide sử dụng phần mềm Lasergene 84 Kết so sánh độ tương đồng trình tự axit amin sử dụng phần mềm Lasergene 85 ... vi vâ ̣y, chúng thực hiê ̣n đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT- PCR phát vi rút Hanta chuột số điểm Hà Nội, năm 2015 – 2016 với mục tiêu: Tối ưu hóa kỹ thuật RT- PCR để phát vi rút Hanta. .. HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Hà Mỵ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT- PCR PHÁT HIỆN VI RÚT HANTA TRÊN CHUỘT TẠI MỘT SỐ ĐIỂM Ở HÀ NỘI, NĂM 2015 - 2016 Chuyên... rút Hanta chuột Ứng dụng kỹ thuật RT- PCR để phát vi rút Hanta mẫu phổi chuột thu thập số địa điểm Hà Nội, năm 2015- 2016 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược lịch sử phát vi rút Hanta Vi rút Hanta nằm