NGHIÊN cứu một số đặc điểm PHÂN tử GEN m của VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT tại một số điểm ở hà nội từ 2015 2017

Sự hướng dẫn tận tình và nhữngkiến thức quý báu của các cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trìnhhọc tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này.Em xin gửi cám ơn toà

sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Phạm Hồng Nhung đã hướng dẫntận tình, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình họctập, và nghiên cứu để thực hiện đề tài này Sự hướng dẫn tận tình và nhữngkiến thức quý báu của các cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trìnhhọc tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này.

Em xin gửi cám ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại khoaXét nghiệm, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Thành phố Hà Nội, ThS NguyễnVĩnh Đông, ThS Phan Hà Mỵ - Khoa Virus Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đãgiúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặt trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị kỹ thuật viên, các bác sỹ nội trú

vi sinh khóa 39,40,41 đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, và động viên em trongquá trình học tập và thực hiện luận văn này

Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, các phòngban chức năng của Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuậnlợi cho em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân trong giađình và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình làm đề tài này

Hà Nội, ngày 16 tháng 9 năm 2018

Bùi Thị Huyền My

Tôi là Bùi Thị Huyền My, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y HàNội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Phạm Hồng Nhung

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu.Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực vàchính xác

Hà Nội, ngày 16 tháng 9 năm 2018

Bùi Thị Huyền My

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về virus Hanta 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.2 Bệnh học và dịch tễ học 3

1.1.3 Tình hình dịch tễ thế giới và Việt Nam 4

1.1.4 Đặc điểm virus học 6

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán virus Hanta 13

1.2 Kĩ thuật Sequencing 15

1.3 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta 16

1.3.1 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta trên thế giới 16

1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền và phân loài virus Hanta tại Việt Nam 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Địa điểm nghiên cứu 19

2.3 Thời gian nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.5 Đạo đức nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu 28

3.2 Kết quả phân tích đặc điểm nucleotitde và acid amin của các chủng thu được tại Hà Nội từ 2015-2017 32

3.2.2 Sự xuất hiện đột biến nucleotide, các đa hình đơn nucleotide ở các

chủng virus Hanta lưu hành tại Hà Nội từ 2015 – 2017 353.3 Cây gia hệ của các vi rút Hanta lưu hành tại Việt Nam và một số nước trong khu vực châu Á và trên thế giới 42

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 45

4.1 Một số đặc điểm của mẫu 454.2 Đặc điểm phân tử đoạn gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội từ 2015-2017 474.3 Phân loài và phát sinh loài của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở

Hà Nội từ 2015-2017 dựa vào phân tích đoạn gen M 51

KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DOBV Virus Dobrava/Belgrade

DNA Deoxyribose Nucleic Acid

HFRS Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome

ORF Open Reading Frame

RNA Ribonucleic Acid

RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Bảng 1.1 Sự phân bố địa lý của các virus Hanta và các vật chủ 7

Bảng 1.2 Trình tự mồi của kĩ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta 14

Bảng 3.1 Phân bố mẫu theo địa điểm thu thập 28

Bảng 3.2 Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo loài và năm thu thập 30

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của các chủng thu thập được tại Hà Nội với các chủng trong khu vực 33

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo thời gian trong năm 31

Hình 1.1 Phân bố của các hội chứng do virus Hanta 5Hình 1.2 Virus Hanta dưới kính hiển vi điện tử 9Hình 1.3 Cấu trúc virus và hệ gen của virus Hanta 10Hình 1.4 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào chủ của virus Hanta 12Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100 16Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 21Hình 3.1 Bản đồ phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta tại một số điểm ở Hà

Nội, năm 2015 - 2017 29Hình 3.2 Bản đồ phân bố các đột biến nổi trội của các chủng vi rút Hanta

thu được tại Hà Nội từ 2015-2017 41Hình 3.3 Phân bố đột biến acid amin theo nhóm virus 44Hình 4.1 Cây gia hệ của các vi rút hanta dựa trên trình tự nucleotide gen S 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae truyền bệnh sang

người chủ yếu qua các loài động vật gặm nhấm, đặc biệt là chuột do bị cắn hoặctiếp xúc trực tiếp với các chất tiết (phân, nước tiểu) của các động vật này [1].Thể nặng của bệnh có biểu hiện dưới 2 Hội chứng là Hội chứng Thận (HFRS)với tỷ lệ tử vong là 15% và phổi (HPS) có tỷ lệ tử vong lên tới 50% [2]

Bệnh do virus Hanta đã được ghi nhận ở tất cả các châu lục Mỗi loàivirus truyền bệnh cho người thông qua một vật chủ xác định và phân bố theovùng địa lý khác nhau, chính vì vậy sự phân bố của HFRS và HPS cũng bịgiới hạn theo sự phân bố địa lý của các loài động vật gặm nhấm TheoMohammed Mir, phần lớn virus trong các phân họ Neotominae vàSigmodontinae gây ra HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao (40-50%), những virusnày được phân bố khắp Bắc và Nam Mỹ trong các loài gặm nhấm khác nhau.Châu Á là châu lục có lịch sử lâu đời nhất về nhiễm virus Hanta Virus HTNV

và Seoul (SEOV) là những tác nhân chính gây ra HFRS ở châu Á với khoảng300-500 ca tử vong do HFRS được báo cáo hàng năm, trong đó 1-4% ở HànQuốc [3], [4] Tại Việt Nam và Singapore, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tínhvới virus từ 14-34% [5] Ở nước ta cũng đã có những báo cáo về Hội chứngThận và Phổi do virus Hanta Hà Nội là trung tâm kinh tế, văn hóa, chính trịcủa cả nước,sự giao thương rất lớn do vậy, các quần thể chuột cũng có thể dễdàng xâm nhập và mang theo mầm bệnh khác nhau trong đó có virus Hanta

Vì vậy việc chủ động giám sát bệnh trên chuột trong đó có virus Hanta và làquan trọng để có những biện pháp phòng bệnh chủ động hiệu quả Đồng thời,việc nghiên cứu sâu hơn về phân loài của virus từ đó có thể xác định nguồngốc của virus là nội địa hay xâm nhập là vô cùng quan trọng giúp cho côngtác phòng chống, đồng thời cũng cung cấp cơ sở dữ liệu gen của virus Hanta

trong ngân hàng gen thế giới để các nhà khoa học nghiên cứu và tham khảo.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm

phân tử gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội từ

2015 – 2017” với các mục tiêu sau:

1: Mô tả một số đặc điểm phân tử (nucleotide và acid amin) gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội 2015-2017 2: Phân tích loài, phát sinh chủng loài của virus Hanta phân lập được tại Hà Nội, năm 2015 - 2017 dựa trên phân tích đoạn gen M

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về virus Hanta

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Virus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae Có một số ý kiến

cho rằng một loại bệnh với các triệu chứng tương tự hội chứng HFRS đượcghi chép trong y văn của người Trung Quốc từ những năm 960 [31] Vào thế

kỉ 15 ở Anh, người ta cũng ghi nhận một chứng bệnh bí ẩn và được cho là phùhợp với triệu chứng do virus Hanta gây nên Người bệnh xuất hiện tình trạngmệt mỏi và đổ rất nhiều mồ hôi, dịch bệnh bùng phát với 5 đợt lớn vào cácnăm 1485, 1508, 1517, 1528 và 1551 [6] Thực tế, HFRS lần đầu tiên đượcphát hiện và ghi nhận trong cuộc chiến tranh Triều tiên (1951 – 1954), bệnh

đã khiến hơn 3000 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện Tuy nhiên, tácnhân gây bệnh vẫn chưa được tìm ra mãi cho đến 25 năm sau đó Vào năm

1978, nguyên nhân gây ra HFRS được xác định là virus Hanta, phân lập từ

loài chuột Apodemus agrarius bên bờ sông Hantaan thuộc Nam Triều Tiên,

chính vì vậy tác nhân được đặt theo tên con sông là Hantaan virus

Năm 1993, sự bùng phát các trường hợp suy hô hấp bất thường, sau này gọi

là HPS ở vùng Bắc Mỹ khiến nhiều người tử vong Sau đó, chỉ trong khoảng

thời gian ngắn, virus gây ra HPS được phân lập từ loài Peromyscus maniculatus

và sau đó đặt tên là virus (SNV tên vô danh trong tiếng Tây Ban Nha) [7]

1.1.2 Bệnh học và dịch tễ học

a Nguồn lây và phương thức truyền bệnh

Nguồn lây truyền

Virus Hanta lây truyền bệnh cho người qua vật chủ chứa thường là cácđộng vật gặm nhấm với các loài tiêu biểu có mặt hầu hết ở các nơi trên thế

giới Ngoại trừ virus Puumala được phát hiện ở chuột đồng lông đỏ-nâu thìhầu hết các virus Hanta gây bệnh cho người đều liên quan tới chuột nhắt vàchuột cống [8] Virus Hanta gây ảnh hưởng rất ít đến vật chủ chứa của chúng,các báo cáo thử nghiệm cho thấy virus Hanta hầu như không gây nên triệuchứng bệnh nào trên chuột Mặc dù vậy virus có thể được phát hiện trên rấtnhiều loại mô của cơ thể vật chủ chứa như phổi, lá lách, gan, tụy, tuyến nướcbọt, thận, não [9] Chính vì vậy ổ chứa virus là yếu tố quan trọng trong côngtác kiểm soát dịch bệnh do virus Hanta gây nên

1.1.3 Tình hình dịch tễ thế giới và Việt Nam

Virus Hanta có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau, điển hình cho thểnặng của bệnh là hai hội chứng chính HPS và HFRS HFRS được mô tả lầnđầu vào cuối thế kỉ 20 ở châu Á và châu Âu trong khi HPS được công nhận làmột hội chứng lâm sàng thực thể từ năm 1993 khi xuất hiện dịch ở Tây báncầu Trên toàn thế giới, mỗi năm có khoảng 150.000 đến 200.000 ca nhậpviện, hầu hết xảy ra ở các nước đang phát triển [11] Tỷ lệ tử vong do HFRS

từ 1-12% tùy virus HPS là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng, đặc biệt là ở Nam

Mỹ, nơi có sự gia tăng số ca bệnh HPS được báo cáo mỗi năm Từ khi HPSlần đầu tiên được công nhận do virus Hanta ở vùng Bốn góc của Mỹ vào năm

1993, các trường hợp lâm sàng cũng đã được xác nhận ở châu Mỹ tại

Argentina, Bolivia, Brazil, Canada, Chilê, Panama, Paraguay, Mỹ và Uruguayvới hơn 2.000 các trường hợp HPS được ghi nhận ở khu vực châu Mỹ [12],[13] Mặc dù HPS có tỷ lệ mắc nhỏ hơn nhiều với khoảng 200 trường hợpmỗi năm tại Mỹ nhưng tỷ lệ tử vong tới 40-50% [11], [2] Tại châu Á, cáctrường hợp lâm sàng của hội chứng HFRS chủ yếu do virus HTNV và virusSeoul (SEOV) xảy ra chủ yếu tại Trung Quốc và Hàn Quốc và vùng ViễnĐông của Liên Bang Nga Tại Trung Quốc, mỗi năm có hơn 1.400.000 trườnghợp với khoảng 45.000 người tử vong trong giai đoạn 1950 – 2001 làm chonước này trở thành quốc gia đặc hữu của HFRS, chiếm 70 – 90% các caHFRS trên toàn thế giới [14], [15].

Hình 1.1 Phân bố của các hội chứng do virus Hanta

Ở Việt Nam, năm 1986 Rollin và cộng sự bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnhquang gián tiếp đã tìm thấy 4.5% (8/146) kháng thế kháng virus trên nhómbệnh nhân nghi ngờ nhiễm virus Arbo tại Hà Nội [16] Theo nghiên cứu củaHoàng Thủy Nguyên và cộng sự trong năm 1998- 1999 [17], bằng kĩ thuậtngưng kết hạt (Hantadia) đã thấy 4.03 % (5/124) mẫu huyết thanh người và3.07% (1/27) mẫu huyết thanh chuột có kháng thể kháng với virus Hanta

Theo báo cáo của viện Pasteur, đã có nhiều trường hợp xuất hiện hội chứngHFRS tại thành phố Hồ Chí Minh Virus Hantan cũng đã thấy ở loàichuột Rattus Norvegicus ở một số tỉnh miền Bắc Đã có 11 chủng của ViệtNam được đăng ký tại Ngân hàng gen Quốc tế trong đó 10 chủng có cấu trúcgen thuộc chủng vùng Seoul, đặc biệt năm 2007 đã phát hiện một virus mớitại tỉnh Cao Bằng và được đặt tên là virus CBVN Tại Hà Nội đến nay chưaphát hiện trường hợp nào nhiễm virus Hanta nhưng kết quả nghiên cứu củaviện Vệ Sinh dịch tễ Trung Ương phối hợp với Đại Học Hokaido Nhật Bảntrên quần thể chuột bắt tại chợ Trương Định và Bến xe Giáp Bát có tới 16.3%mẫu huyết thanh chuột có kháng thể kháng virus Hanta [28].

1.1.4 Đặc điểm virus học

a Phân loại

Hantaviruses thuộc họ Bunyavirus, một họ gồm 5 chi: Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus, Phlebovirus và Tospovirus Mỗi loại đều được

tạo thành từ những virus đơn chuỗi RNA Tất cả các chi này bao gồm virus

gây bệnh truyền qua động vật chân khớp, ngoại trừ chi Hantavirus, là loài gây

bệnh truyền qua động vật gặm nhấm Theo Ủy ban Quốc tế về Phân LoạiVirus (ICTV), hiện tại có khoảng 24 loài virus Hanta đã được phát hiện [16].Ngoài ra, virus cũng được phân loại dựa vào vật chủ mang chúng Theo

Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus, mỗi Hanta virus có một ổ chứa khác nhautheo từng loài hoặc dưới loài [16], chúng được chia thành bốn nhóm riêng biệtdựa trên vật chủ của chúng Nhóm đầu tiên chứa các virus gây HFRS chẳnghạn như HTNV, Seoul (SEOV) và virus Dobrava-Belgrade (DOBV), đượcmang bởi chuột và các loài gặm nhấm trong Cựu Thế Giới (Old World rat)[17] Các virus của nhóm thứ hai được mang bởi chuột đồng và lemmut, lànguyên nhân của NE (PUUV) hoặc tác nhân gây ra TULV, Prospect Hill Virus(PHV) Nhóm thứ ba, được mang bởi các loài gặm nhấm thuộc Tân Thế Giới

(New World rat) và chuột bao gồm SNV, Andes (ANDV), nguyên nhân củaHCPS khi truyền sang người [18] Nhóm thứ tư là sự bổ sung gần đây nhất,được mang bởi chuột chù, mặc dù loài đầu tiên của nhóm này được phân lập từnăm 1964 có tên là Thottapalayam Hiện tại không có bệnh cũng như triệuchứng liên quan tới Hanta virus được mang bởi nhóm ăn côn trùng (bảng 1).

Bảng 1.1: Sự phân bố địa lý của các virus Hanta và các vật chủ

Nhóm và phân họ Virus phân lập hoặc chủng

Tên viết tắt Phân bố địa lý Vật chủ chứa Bệnh liên quan Virus Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World)

Virus Sin Nombre

Bộ gen của virus được chia thành các phân đoạn S (nhỏ, từ 1.6 – 2.1 kb),

M (trung bình, 3.7 – 3.8 kb) và L (lớn, 6.5 – 6.6 kb), đây cũng là đặc trưng

của các thành viên trong họ Bunyaviridae [19] Đoạn nhỏ (S) mã hóa cho

nucleocapsid protein (N), N protein tồn tại với mật độ cao trong tế bào chấtcủa tế bào nhiễm virus Biểu hiện của chúng có thể phát hiện được khoảng 6tiếng sau khi tế bào bị nhiễm Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đáp ứngmiễn dịch sớm phần lớn tác động đích đến N protein Đoạn trung bình (M) mãhóa cho 2 glycoprotein bề mặt G1 và G2, chúng tạo điều kiện cho virus có thểgắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ Đoạn lớn (L) mã hóa choRNA phụ thuộc RNA polymerase của virus (Rdrp) [20], [21] RdRp thực hiệnkhá nhiều vai trò: dịch mã, nhân bản, endonuclease, tháo xoắn helix ARN.Trong quá trình dịch mã RdRp tổng hợp mARN từ khuôn là sợi đơn âm ARNvirus và nhân bản vật chất di truyền của virus qua cARN trung gian

Hình 1.3 Cấu trúc virus và hệ gen của virus Hanta

Cấu trúc đoạn gen M

Đoạn gen M của virus Hanta gồm 3 vùng bao gồm vùng 5’ không mãhóa (5’ NCR), một khung đọc mở (ORF) và 3’ không mã hóa (NCR) Vùng5’NCR và 3’NCR có chiều dài lần lượt khoảng 47 nucleotid và 203nucleotide Đoạn M chứa một khung đọc mở đơn (48 – 3448 nucleotide) mã

hóa cho tiền chất của 1133 acid amin quy định các glycoprotein G1 và G2 Glycoprotein bề mặt tiền thân (GPC) của virus Hanta được tổng hợp ởribosome liên kết với màng lưới nội chất (ER) Sau đó trong quá trình chuyểntới ER, GPC được protease nội bào phân chia thành glycoprotein trưởngthành G1 và G2 Các glycoprotein G1 và G2 tạo điều kiện cho virus có thểgắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ Cũng có nghiên cứu chorằng sự biểu hiện của G1 làm giảm sản xuất IFN-β – yếu tố quan trọng trongquá trình đáp ứng miễn dịch chống lại sự xâm nhập của virus [1], [27]

Các glycoprotein G1/G2 có thể tương tác với các protein đặc biệt trên bềmặt tế bào β3-integrins, tạo điều kiện xâm nhập tế bào của hantavirus gây raHPS [22]

c Đặc điểm nhân lên và đáp ứng miễn dịch

Quá trình nhân lên của virus Hanta

Giống như nhiều virus khác, virus Hanta xâm nhập vào các tế bào chủbằng sự tương tác giữa các glycoprotein của virus và các thụ thể đặc hiệu trên

bề mặt tế bào (Hình 3) Virus Hanta gây bệnh và không gây bệnh sử dụng cácthụ thể tích hợp khác nhau để xâm nhập vào tế bào chủ của chúng Cácintergrin của người như αIIaβ3 trên bề mặt tiểu cầu và αvβ3 ở các tế bào nội

mô làm trung gian cho sự xâm nhập tế bào, từ đó gây ra HFRS và HCP [22].Ngược lại, virus Hanta không gây bệnh, chẳng hạn như, PHV và TULV sửdụng thụ thể α5β1 cho việc xâm nhập vào tế bào

Sau khi bám dính vào bề mặt tế bào chủ, virus Hanta xâm nhập vào các

tế bào bằng quá trình nhập bào phụ thuộc Clathrin Sau khi xâm nhập, virusHanta cởi bỏ lớp áo của mình, ba nucleocapsids được giải phóng vào bàotương tế bào cùng với RdRp của virus Sau đó, RdRp bắt đầu được phiên mã

và các mRNA của virus mã hóa cho ba protein virus được tổng hợp Các

mRNA virus có khoảng 100 nucleotide ngắn hơn RNA của virus ban đầu vàthiếu đuôi poly A RdRp của virus sử dụng cơ chế "nắp đậy" để bắt đầu phiên

mã [23], [24] Các mRNA của virus được dịch mã trong tế bào chất nhờ bộmáy dịch mã của tế bào chủ RdRp virus cũng sao chép bộ gen thông quatổng hợp cRNA bổ sung Các cRNA bổ sung là sự bổ sung chính xác củaRNA vi-rút (vRNA), và trở thành như các khuôn mẫu để tổng hợp các bộ gen

âm của virus Virus lắp ráp và trưởng thành trên bề mặt tế bào hoặc trênGolgi Các virion trưởng thành trên Golgi được vận chuyển đến bề mặt tế bàothông qua các con đường túi tiết Cuối cùng, virion mới nảy chồi ra khỏi các

tế bào chủ từ màng tế bào

Hình 1.4 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào chủ của virus Hanta

 Đáp ứng của hệ thống miễn dịch khi bị nhiễm virus Hanta

Sự nhiễm virus hantavirus gây ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong tếbào chủ, trong khi các hantavirus gây bệnh dường như có thể trốn tránh cácphản ứng này ở một mức độ nhất định Các dạng interferon khác nhau đượcbiểu hiện và gen kích thích sản xuất IFN được kích hoạt Sự biểu hiện của

IFN-inducing MxA protein bị trì hoãn trong các tế bào bị nhiễm các virusHanta gây bệnh Tương tự, mức độ các phân tử kháng nguyên trình bày nhưHLA lớp I được nâng cao Tuy nhiên, việc điều hòa tăng chậm hơn sau khinhiễm virus Hanta gây bệnh so với các hantavirus không gây bệnh Các cơchế chống virus bẩm sinh khác được gây ra trong suốt quá trình nhiễmHantavirus bao gồm kích hoạt hệ thống bổ thể theo con đường cổ điển vàthay thế, ví dụ sự tăng phức hợp SC5b-9 và tỷ lệ C4d/C4 cao hơn trong suốt

NE do PUUV [25] Các tế bào giết tự nhiên, được gọi là effector và các tếbào tiết trong hệ thống miễn dịch miễn dịch sản xuất các phân tử gây độc tếbào và tiết cytokine và chemokine di chuyển vào các mô bị nhiễm virus [25],[26]

Cơ thể nhiễm virus, sau khi bệnh khởi phát vài ngày bắt đầu xuất hiệnkháng thể IgM, đạt đỉnh sau 2-3 tuần IgG cũng xuất hiện sớm nhưng có thể tồntại hàng năm

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán virus Hanta

a Phương pháp trực tiếp

Soi trên kính hiển vi điện tử

Đây là một phương pháp hữu hiệu, nhạy và nhanh trong việc quan sátvirus Virus Hantan hơi khác virus khác ở chỗ sự nhân lên của virus Hantanchậm và vắng mặt hình thái tế bào gây nhiễm Tuy nhiên, phương pháp nàyđòi hỏi phải nồng độ virus cao: tốt nhất là từ 106 tới 109/ml

Phân lập virus Hanta

Phải thực hiện trong phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp 3 (BSL3)

- Thu thập mẫu xét nghiệm từ bệnh nhân và ổ chứa virus: ví dụ từ phổi

và lách của chuột nhiễm virus Hanta

- Tiến hành phân lập trên động vật

- Phân lập trên tế bào nuôi (tế bào VERO E6)

RT PCR xác định sự có mặt của virus

Có rất nhiều phương pháp sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu khác nhau đểphát hiện virus Hanta Trong nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng kĩ thuật RTPCR sử dụng cặp mồi khuếch đại gen M mã hóa cho G2 protein của virusHanta, SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353 được Hua Wang và cộng sự công bốnăm 2000 có trình tự nucleotide như sau:

Bảng 1.2 Trình tự mồi của kĩ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta

Kĩ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu

Đây là kỹ thuật tương đối nhạy cảm và đòi hỏi ít trang bị đắt tiền như:kính hiển vi huỳnh quang, các kháng thể Kỹ thuật này gồm các bước tiếnhành như sau:

- Chuẩn bị kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu,

- Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên (HA)

- Tiến hành kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).

Ngoài ra còn một số kĩ thuật như kĩ thuật Western Blot, kĩ thuật trunghòa giảm đám hoại tử, Kĩ thuật ngưng kết hạt (HantaDia)

1.2 Kĩ thuật Sequencing

Nguyên lí: DNA là cơ sở hóa học của gen Phân tử DNA là một chuỗixoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờcác base của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T(thymine) Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xácđịnh Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loạinucleotide này trên phân tử DNA

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phátminh như: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (AlanMaxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzymehay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger)

Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử pháttriển của sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự độngđều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger

Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100

1.3 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta

1.3.1 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta trên thế giới

Virus Hanta là một trong những tác nhân nguy hiểm bởi hậu quả nặng

nề do chúng gây ra và cũng bởi vật chủ mang chúng là những loài vô cùnggần gũi với con người Chính vì vậy, kể từ khi virus Hanta được phân lập từcác loài gặm nhấm Murinae ở Bắc Á và châu Âu và một số vật chủ đặc biệtcủa virus Hanta ở những vùng khác nhau trên trên thế giới, đặc biệt ở ĐôngNam Á, nơi mà có tới hơn 35 loài Murinae sinh sống, hàng vạn câu hỏi đãđược đặt ra Một số virus Hanta đã được ghi nhận từ Đông Nam Á, đặc biệtlà: THAIV được phát hiện năm 1994 ở Thái Lan từ một con chuột túi lớn,Bandicota indica, một số virus Hanta được phân lập tại Campuchia từ Rattusrattus và R Norvegicus [32], [33] Ngoài ra, các cuộc điều tra huyết thanh họccũng cho thấy các mẫu dương tính với virus Hanta ở Thái Lan và Campuchia[34], [35], [36] Từ những kết quả này, các nhà khoa học bắt đầu đặt ra câuhỏi về sự đa dạng di truyền ở các virus Hanta ở Đông Nam Á như thế nào, cómối liên hệ gì giữa virus Hanta ở Đông Nam Á, Nam Á với các khu vực khác.Năm 2006, Jean-Pierre Hugot và cộng sự đã sử dụng kết quả giải trình tự cácphân đoạn gen S và M để xây dựng cây phát sinh loài, kết quả cho thấy cácchủng THAIV có mối quan hệ gần gũi với SEOV, đồng thời cũng phản ánhmối quan hệ gần gũi giữa vật chủ là Bandicota và Rattus [37]

1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền và phân loài virus Hanta tại Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 2005, Trương Thừa Thắng và cộng sự bằng kĩ thuật

RT PCR sử dụng cặp mồi SEOMF1936 và SEOMR2353 bước đầu phát hiệnvirus Seoul trên địa bàn Hà Nội, kết quả cho thấy có 2/160 mẫu chuột dươngtính với virus Hanta [29]

Năm 2011, Trần Đức nghiên cứu trên quần thể chuột tại cảng Hải Phòngthu được 14/165 (8,48%) mẫu chuột cho kết quả dương tính với kĩ thuậtWestern Blot và trong số 14 mẫu đó có 4/14 mẫu phổi chuột cho kết quảdương tính với phương pháp RT PCR Tác giả cũng sử dụng trình tự đoạn gen

M để phân tích và xây dựng cây phả hệ của chủng virus phát hiện được Kếtquả cho thấy virus SEOV tại cảng Hải Phòng có cùng nguồn gốc với virusSEOV tại Nhật Bản và Indonesia [30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- 14 mẫu phổi chuột được chẩn đoán xác định dương tính với vi rútHanta bằng kỹ thuật RT – PCR Các mẫu bệnh phẩm này được lấy từ chuộtthu thập được tại các điểm giám sát thường quy trên địa bàn Hà Nội gồm: bến

xe vận tải, ga Giáp Bát, chợ Thành Công, chợ Thái Hà, bệnh viện Hà Đông,

bệnh viện Đống Đa, nhà máy bia Hà Nội, chợ Đồng Tâm, bệnh viện GiaoThông Vận Tải (GTVT) từ 2015 – 2017

- Trình tự gen M của các chủng so sánh là các chủng đại diện cho một

số khu vực trên thế giới đã được công bố tại ngân hàng gien thế giới(GenBank) tại địa chỉ website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ với các mã đăng

ký và tên chủng như sau:

Nhật Bản

Việt Nam

Chú thích: (-): không có thông tin

2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện phân loại chuột và lấy mẫu phổi chuột: Khoa Sốt rét

kí sinh trùng và Côn trùng – Trung tâm Kiểm soát bệnh tật thành phố Hà Nội

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm RT-PCR: Khoa xét nghiệm - Trung tâm

kiểm soát bệnh tật thành phố Hà Nội

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm giải trình tự gen: Khoa Vi rút - Viện Vệ

sinh Dịch tễ Trung ương

2.3 Thời gian nghiên cứu

Tháng 10/2016- Tháng 3/2018

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu phân tích

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu

-Các mẫu phổi chuột được chẩn đoán dương tính với vi rút hanta bằng

kỹ thuật RT – PCR được tiến hành chọn lọc, tách chiết ARN từ mẫu phổi bằng

bộ sinh phầm sinh phẩm tách chiết ARN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit –QIAGEN Tiếp đó khuếch đại đoạn gen M mã hóa cho protein G2 của vi rútHanta bằng sử dụng cặp mồi SEO-MF (mồi xuôi) và SEO-MR (mồi ngược)

đã được tác giả Hua Wang và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu đa dạng ditruyền của vi rút Hanta tại Trung Quốc năm 2000, sử dụng bộ sinh phẩm Onestep RT-PCR- QIAGEN với nhiệt độ bắt cặp 52oC, 35 chu kỳ, thời gian kéodài là 1 phút Sản phầm PCR sau đó được tinh sạch trực tiếp bằng bộ sinhphẩm Kit PCR Purification QiaGen – Cat No 28104 Giải trình tự gen trựctiếp từ sản phẩm PCR, phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện với bộ sinhphẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) trong

2 phản ứng với lần lượt 2 mồi SEO-MF và SEO-MR nhằm thu được đoạntrình tự có độ dài mong muốn Sản phẩm PCR giải trình tự gen được tinh sạchbằng bộ kít Dye Ex 2.0 Spin để loại bỏ các thành phần thừa Thực hiện giảitrình tự và phân tích kết quả trên máy giải trình tự ABI 3100-AvantTM GeneticAnalyser Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm cácchương trình Larsergene DNA Star – Seqman; Larsergene DNA Star -MeAlign và Mega 7.0 để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide,acid amin của chủng thu được và so sánh trình tự nucleotide, acid amin vớichủng chuẩn Kiểm tra chất lượng trình tự thu được bằng phần mềm DNASequencing Analysis v5.3.1 hoặc phần mềm Sequence Scanner 1.0 Phầnmềm được cung cấp kèm theo máy giải trình tự gen ABI PRISM™ 3100

Đọc kết quả bằng phần mềm DNASTAR, MEGA4, BioEdit

Phân tích kết quả, chỉ ra các đặc điểm nucleotide,

aa, đột biến, xây dựng cây phát sinh loài dựa trên phân tích gen M.

a Quy trình giải trình tự nucleotide của ADN của virus Hanta

Bước 1 Tinh sạch DNA từ sản phẩm PCR dương tính

Bước 2 Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide.Bước 3 Tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide

Bước 4 Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

Sinh phẩm, dụng cụ và thiết bị:

Sinh phẩm:

-Kit one step RT-PCR: Qiagen – Cat No 210212

-Kit PCR Purification : QiaGen – Cat No 28104

-Kit Gel Extraction: QiaGen – Cat No 28704

-Kit Dye Ex 2.0 Spin: QiaGen – Cat No 63204

-Big Dye – Terminator 3.1: ABI prism – Lot No 1301348; Part No

-Agarose - UltraPure : Cat.No 16500-100 - Invitrogen

-TAE 50X: Qiagen – Cat No 129237

-Ethidium bromide

-ADN Marker (Qiagen)

Dụng cụ

- Tuýp eppendorf vô trùng: 2 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;

- Đầu côn lọc các loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;

- Máy chạy điện di: Mupid – 2plus

- Máy chụp gel: UVP - Transilluminator

- Máy giải trình tự gien: ABI 3100-Avant TM Genetic Analyser 4 mao quản(Applied Biosystems; Mỹ)

 Bước 1 Sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu

- Sử dụng kit làm tinh sạch của hãng Qiagen

- Purification kit Qiaquick 250 Cat No 28104

- Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2ml.

- Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm13.000vòng/30-60giây

- Loại bỏ nước ở tuýp thu, đặt lại cột Qiaquick vào tuýp

- Dùng pipet cho 750ul đệm PE vào cột Qiaquick để rửa DNA, ly tâm13.000vòng/30-60giây

- Loại bỏ nước ở tuýp thu, đặt lại cột Qiaquick vào tuýp, ly tâm13.000vòng/60giây

- Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml

- Cho 30ul đệm EB hoặc nước tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cộtQiaquick để tách lấy DNA, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm13.000vòng/60giây DNA tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC

 Bước 2 Chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide – PCR sequencing

- Dùng bộ kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Mã catalog:

- Sinh phẩm được trộn trong từng tube 0.2ul riêng biệt, vortex đều sau đó

ly tâm nhẹ trước khi cho vào máy

Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, tránh

nhiễu trong quá trình giải trình tự

- Sử dụng bộ kít Dye Ex 2.0 Spin Qiagen Mã catalog: 63206

- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1.5ml sạch

- Dùng pipet hút toàn bộ sản phẩm nhỏ vào chính giữa cột gel

- Ly tâm 2800 vòng / 2-3 phút

- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin

- Thu hồi mẫu Trong trường hợp không đưa vào máy ngay, có thể giữmẫu ở -80oC không quá 24h

 Bước 4 Giải trình tự gen bằng điện di mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

- Dùng POP 6 Mã catalog 4316357

- HiDi Formamide ABI 25ml Mã catalog 4311320

- Nhỏ mẫu trực tiếp lên đĩa 96 giếng (dành riêng cho ABI 3130-Avant)

- Đưa đĩa 96 giếng vào máy giải trình tự ABI

- Hiệu chỉnh các thông số để chạy

- Phân tích kết quả thu được

b Cài đặt chương trình chạy, tạo tệp dữ liệu, lưu giữ và phân tích kết quả

Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm cácchương trình Larsergene DNA Star – Seqman; Larsergene DNA Star -MeAlign và Mega 7.0 để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide,acid amin của chủng thu được và so sánh trình tự nucleotide, acid amin vớichủng chuẩn

Kiểm tra chất lượng trình tự thu được bằng phần mềm DNA SequencingAnalysis v5.3.1 hoặc phần mềm Sequence Scanner 1.0 Phần mềm được cungcấp kèm theo máy giải trình tự gen ABI PRISM™ 3100

Ghép các trình tự xác định bởi các mồi khác nhau thành một trình tự hợpnhất và đọc trình tự bằng phần mềm Larsergene DNA Star – Seqman Phầnmềm Seqman được cung cấp bởi công ty DNA Star sử dụng trong ghép nối,phân tích các dữ liệu giải trình tự Sanger

Xác định týp của 14 chủng virus Hanta phân lập trong nghiên cứu bằngphần mềm MEGA 7.0 MEGA (Molecular Evolutionary Gentics Analysis) so

sánh và sắp xếp đa trình tự nucleotide đoạn gen M 418 nucleotide của các chủngvirus Hanta phân lập trong nghiên cứu với các chủng lưu hành trong nước vàmột số nước lân cận Cây gia hệ giữa các chủng của Việt Nam và thế giới bằngphương pháp Neighbour -Joining với giá trị tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tincậy) có độ tin cậy tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần (giá trị bootstrap).

Phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein dựa trên đoạn gen M gồm 418nucleotide để phân tích sự đồng nhất nucleotide và acid amin của các chủngvirus Hanta phân lập trong nghiên cứu với các chủng lưu hành trong nước vàmột số nước lân cận như Singapore, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc,Indonesia Số liệu được làm sạch bằng phần mềm MEGA, sau đó được dùngphương pháp ClustalW để sắp xếp đa trình tự Các chuỗi nucleotide hay acidamin được sắp xếp và tính toán mức độ đồng nhất (identity) và tương đồng(homology) bằng chương trình Lasergene (Germany)

2.5 Đạo đức nghiên cứu

Các chủng virus và số liệu nghiên cứu thuộc đề tài cấp cơ sở của TrungTâm Kiểm soát Bệnh tật Thành phố Hà Nội Nghiên cứu được thực hiện saukhi được sự đồng ý của Ban giám đốc Trung tâm Tất cả các số liệu đều trungthực, khách quan, chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu, ngoài ra không dùngvào mục đích nào khác

CHƯƠNG 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu

Bảng 3.1 Phân bố mẫu theo địa điểm thu thập

Địa điểm

Dương tính/ tổng số

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu dương tính

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu dương tính

Số mẫu xét nghiệm

Số mẫu dương tính