NGHIÊN cứu một số đặc điểm PHÂN tử GEN m của VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT tại một số điểm ở hà nội từ 2015 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN M CỦA VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT TẠI MỘT SỐ ĐIỂM Ở HÀ NỘI TỪ 2015-2017 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN M CỦA VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT TẠI MỘT SỐ ĐIỂM Ở HÀ NỘI TỪ 2015-2017 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 60720115 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.BS Phạm Hồng Nhung TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI, 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Phạm Hồng Nhung hướng dẫn tận tình, giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình học tập, nghiên cứu để thực đề tài Sự hướng dẫn tận tình kiến thức q báu đóng vai trò vơ quan trọng trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn Em xin gửi cám ơn toàn thể anh chị nhân viên, kỹ thuật viên khoa Xét nghiệm, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Thành phố Hà Nội, ThS Nguyễn Vĩnh Đông, ThS Phan Hà Mỵ - Khoa Virus Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện mặt trình thực luận văn Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, chị kỹ thuật viên, bác sỹ nội trú vi sinh khóa 39,40,41 ln giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên em trình học tập thực luận văn Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, phòng ban chức Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình bạn bè ln ủng hộ em suốt trình làm đề tài Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2018 Bùi Thị Huyền My LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Huyền My, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Kiều Anh TS Phạm Hồng Nhung Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin cam đoan điều trình bày hồn tồn trung thực xác Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2018 Bùi Thị Huyền My MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương virus Hanta .3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Bệnh học dịch tễ học 1.1.3 Tình hình dịch tễ giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm virus học 1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán virus Hanta 13 1.2 Kĩ thuật Sequencing 15 1.3 Các nghiên cứu di truyền phân loài virus Hanta 16 1.3.1 Các nghiên cứu di truyền phân loài virus Hanta giới 16 1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền phân loài virus Hanta Việt Nam .17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.3 Thời gian nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 20 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.5 Đạo đức nghiên cứu 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 28 3.2 Kết phân tích đặc điểm nucleotitde acid amin chủng thu Hà Nội từ 2015-2017 32 3.2.1 Mức độ tương đồng nucleotide acid amin chủng thu thập Hà Nội với chủng khu vực 32 3.2.2 Sự xuất đột biến nucleotide, đa hình đơn nucleotide chủng virus Hanta lưu hành Hà Nội từ 2015 – 2017 35 3.3 Cây gia hệ vi rút Hanta lưu hành Việt Nam số nước khu vực châu Á giới 42 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 45 4.1 Một số đặc điểm mẫu 45 4.2 Đặc điểm phân tử đoạn gen M virus Hanta chuột số điểm Hà Nội từ 2015-2017 47 4.3 Phân loài phát sinh loài virus Hanta chuột số điểm Hà Nội từ 2015-2017 dựa vào phân tích đoạn gen M 51 KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DOBV BCCV DNA HFRS HPS HTNV ICTV IFN LANV MCLV NCR NE ORF ORNV PHV PUUP RNA RT PCR SAAV SEOV SNV THAIV Virus Dobrava/Belgrade Virus Black Creek Canal Deoxyribose Nucleic Acid Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Hantavirus Pulmonary Syndrome Virus Hantaan International Committee on Taxonomy of Viruses Interferon Virus Laguna Negra Virus Maciel NonCoding Region Nephropathia Epidemica Open Reading Frame Virus Orán Virus Prospect Hill Virus Puumala Ribonucleic Acid Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Virus Saaremaa Virus Seoul Virus Sin Nombre Virus Thái Lan DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố địa lý virus Hanta vật chủ Bảng 1.2 Trình tự mồi kĩ thuật RT-PCR phát virus Hanta 14 Bảng 3.1 Phân bố mẫu theo địa điểm thu thập 28 Bảng 3.2 Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo loài năm thu thập 30 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide acid amin chủng thu thập Hà Nội với chủng khu vực 33 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta theo thời gian năm 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phân bố hội chứng virus Hanta Hình 1.2 Virus Hanta kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Cấu trúc virus hệ gen virus Hanta 10 Hình 1.4 Quá trình xâm nhập nhân lên tế bào chủ virus Hanta 12 Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100 16 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu .21 Hình 3.1 Bản đồ phân bố chuột nhiễm vi rút Hanta số điểm Hà Nội, năm 2015 - 2017 29 Hình 3.2 Bản đồ phân bố đột biến trội chủng vi rút Hanta thu Hà Nội từ 2015-2017 41 Hình 3.3 Phân bố đột biến acid amin theo nhóm virus 44 Hình 4.1 Cây gia hệ vi rút hanta dựa trình tự nucleotide gen S 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae truyền bệnh sang người chủ yếu qua loài động vật gặm nhấm, đặc biệt chuột bị cắn tiếp xúc trực tiếp với chất tiết (phân, nước tiểu) động vật [1] Thể nặng bệnh có biểu Hội chứng Hội chứng Thận (HFRS) với tỷ lệ tử vong 15% phổi (HPS) có tỷ lệ tử vong lên tới 50% [2] Bệnh virus Hanta ghi nhận tất châu lục Mỗi loài virus truyền bệnh cho người thông qua vật chủ xác định phân bố theo vùng địa lý khác nhau, phân bố HFRS HPS bị giới hạn theo phân bố địa lý loài động vật gặm nhấm Theo Mohammed Mir, phần lớn virus phân họ Neotominae Sigmodontinae gây HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao (40-50%), virus phân bố khắp Bắc Nam Mỹ loài gặm nhấm khác Châu Á châu lục có lịch sử lâu đời nhiễm virus Hanta Virus HTNV Seoul (SEOV) tác nhân gây HFRS châu Á với khoảng 300-500 ca tử vong HFRS báo cáo hàng năm, 1-4% Hàn Quốc [3], [4] Tại Việt Nam Singapore, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với virus từ 14-34% [5] Ở nước ta có báo cáo Hội chứng Thận Phổi virus Hanta Hà Nội trung tâm kinh tế, văn hóa, trị nước,sự giao thương lớn vậy, quần thể chuột dễ dàng xâm nhập mang theo mầm bệnh khác có virus Hanta Vì việc chủ động giám sát bệnh chuột có virus Hanta quan trọng để có biện pháp phòng bệnh chủ động hiệu Đồng thời, việc nghiên cứu sâu phân loài virus từ xác định nguồn gốc virus nội địa hay xâm nhập vô quan trọng giúp cho cơng tác phòng chống, đồng thời cung cấp sở liệu gen virus Hanta KẾT LUẬN Tỷ lệ tương đồng nucleotide acid amin chủng vi rút Hanta phân lập Hà Nội khác so với chủng nước khu vực, tương ứng 66,7%- 99% 71,4 -100% Một số đột biến tìm thấy chủng Hà Nội mà không thấy chủng lưu hành Hà Nội Việt Nam trước số nước lân cận A15P, W13L/G E19K Các chủng vi rút Hanta phân lập Hà Nội từ 2015 -2017 thuộc nhóm SEOV có vật chủ chuột cống Rattus norvegicus chia làm nhóm, nhóm gồm nhóm chủng lưu hành Việt Nam, Hàn Quốc, Singapore, Nhật Bản, Trung Quốc nhóm gồm chủng lưu hành Hà Nội chủng lưu hành Trung Quốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Musalwa Muyangwa, Ekaterina V Martynova, Svetlana F Khaiboullina, Sergey P Morzunov, and Albert A Rizvanov (2015) Hantaviral Proteins: Structure, Functions, and Role in Hantavirus Infection s.l : Front Microbiol, Nov 27 https://www.cdc.gov/hantavirus/technical/hanta/virology.html Song KJ1, Baek LJ, Moon S, Ha SJ, Kim SH, Park KS, Klein TA, Sames W, Kim HC, Lee JS, Yanagihara R, Song JW (2007), Muju virus, a novel hantavirus harboured by the arvicolid rodent Myodes regulus in Korea J Gen Virol Nov, Vols 88(Pt 11):3121-9 Lee HW, Lee PW, Johnson KM (1978) Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever J Infect Dis, Mar, Vols 137(3):298-308 Kruger DH, Figueiredo LT, Song JW, Klempa B (2015) Hantavirusesglobally emerging pathogens J Clin Virol, Vols 64:128-36 Paul Heyman, Leopold Simons and Christel Cochez (2014) Were the English Sweating Sickness and the Picardy Sweat Caused by Hantaviruses? Viruses, Vols 6(1): 151–171 Jonsson, C.B., L.T Figueiredo, and O Vapalahti (2010), A global perspective on hantavirus ecology, epidemiology, and disease Clin Microbiol Rev, Vols 23(2): p 412-41 Watson, D.C., et al (2013) Crit Rev Epidemiology of Hantavirus infections in humans: A comprehensive, global overview Microbiol, Vols p 1-12 Hart, C.A and M Bennett (1999), Hantavirus infections: epidemiology and pathogenesis Microbes and Infection Vol 1: p 1229−1237 10 Kruger, D.H., et al (2015), Hantaviruses globally emerging pathogens J Clin Virol, Vols 64: p 128-36 11 Zhenqiang Bi, Pierre B.H Formenty, Cathy E Roth Hantavirus Infection: a review and global update 2008 12 Padula PJ, Colavecchia SB, Martinez VP, Gonzalez Della Valle MO, Edelstein A, Miguel SD, Russi J, Riquelme JM, Colucci N, Almiron M, Rabinovich RD (2000) Genetic diversity, distribution, and serological features of hantavirus infection in five countries in South America J Clin Microbiol, Vols 38: 3029-3035 13 E., Weir (2005), Hantavirus: 'tis the season CMAJ, Vol 17:147 14 Wu GH (2003), Progress of epidemiological studies on hemorrhagic fever with renal syndrome in China Chin J Epidemiol, Vols 24: 413415 15 Zhang YZ, Xiao DL, Wang Y, Wang HX, Sun L, Tao XX, Qu YG (2004), The epidemic characteristics and preventive measures of hemorrhagic fever with renal syndrome in China Chin J Epidemiol, Vols 25: 466-469 16 King, A M Q., Adams, M J., Carstens, E B & Lefkowitz, E J (2011) Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses Elsevier Academic Press 17 Kruănger, D H., Ulrich, R & Lundkvist A, A (2001) Hantavirus infections and their prevention Microbes Infect, Vols 3, 1129–1144 18 Maes, P., Klempa, B., Clement, J., Matthijnssens, J., Gajdusek, D C., Kruă ger, D H & Van Ranst, M (2009), A proposal for new criteria for the classification of hantaviruses, based on S and M segment protein sequences Infect Genet Evol, Vols 9, 813–820 19 Plyusnin A., Kukkonen S K., Plyusnina A., Vapalahti O., Vaheri A (2002) Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with recombinant S RNA segment EMBO J, Vols 21, 1497–1503 20 Plyusnin, A (2002), Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy Arch Virol, Vols 147, 665–682 21 Plyusnin, A., Vapalahti, O & Vaheri, A (1996), Hantaviruses: genome structure, expression and evolution J Gen Virol, Vols 77, 2677–2687 22 Gavrilovskaya I N., Shepley M., Shaw R., Ginsberg M H., Mackow E R (1998) Beta3 Integrins mediate the cellular entry of Hantaviruses that cause respiratory failure Proc Natl Acad Sci U.S.A.95 7074–7079 22 Gavrilovskaya IN, Gorbunova EE, Mackow NA, Mackow ER (2008), Hantaviruses direct endothelial cell permeability by sensitizing cells to the vascular permeability factor VEGF, while angiopoietin and sphingosine 1-phosphate inhibit hantavirus-directed permeabilit J Virol, Vols 82:5797–806 23 Elliott RM, Schmaljohn CS, Collett MS (1991), Bunyaviridae genome structure and gene expression Curr Top Microbiol Immunol, Vols 169:91–141 24 Mir MA, Duran WA, Hjelle BL, Ye C, Panganiban AT (2008), Storage of cellular 5′ mRNA caps in P bodies for viral cap-snatching Proc Natl Acad Sci U S A, Vols 105:19294–9 25 Khaiboullina SF, St Jeor SC (2002), Hantavirus immunology Viral Immunol, Vols 15: 609–625 26 Linderholm M, Bjermer L, Juto P, Roos G, Sandstrom T, Settergren B, Tarnvik A (1993), Local host response in the lower respiratory tract in nephropathia epidemica Scand J Infect Dis, Vols 25: 639–646 27 Musalwa Muyangwa, Ekaterina V Martynova, Svetlana F Khaiboullina, Sergey P Morzunov, and Albert A Rizvanov (2015), Hantaviral Proteins: Structure, Functions, and Role in Hantavirus Infection Front Microbiol Vol 6: 1326 28 Thua Thang Truong, Kumiko Yoshimatsu, Koichi ARAKI, Byoung - Hee LEE, Uyen Ninh Tr Molecular Epidemiological and Serological Studies of Hantavirus Infection in Northern Vietnam Journal of Veterinary Medical Science Vol 71 (2009) No 10 October P 1357-1363 29 Trương Thừa Thắng (2008) Nghiên cứu huyết học nhiễm virus Hanta số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ 30 Trần Đức, J Arikawa, Trương Thừa Thắng, Phạm Thị Bích Ngọc, Trương Uyên Ninh (2009): Phát virus Seoul chuột R novergicus thành phố Hải Phòng 2003-2005 Tạp Chí Y Học Thực Hành (678), số 9/2009 31 Lee HW (1982), Hemorrhagic fever with renal syndrome History of Hantaan virus and epidemiological features Scand J Infect Dis 36:82–85 32 Boonsong L, McNeely JA, Marshall JT (1988), Mammals of Thailand Association for the Conservation of Wildlife, Bangkok 748 33 Reynes JM, Soares JL, Hue T, Bouloy M, Sun S, Kruy SL, Flye Sainte Marie F, Zeller H (2003), Evidence of the presence of Seoul virus in Cambodia Microbes Infect 5: 769-73 10.1016/S1286-579(03)00149-7 34 Elwell MR, Ward GS, Tingpalapong M, Leduc JW (1985), Serologic evidence of Hantaan-like virus in rodents and man in Thailand Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 16: 349-354 35 Nitatpattana N, Chauvency G, Dardaine J, Poblap T, Jumronsawat K, Tangkanakul W, Poonsuksombat D, Yoksan S, Gonzalez JP (2000), Serological study of Hantavirus in the rodent population of Nakhon Pathom and Nakhon Ratchasima provinces in Thailand Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 31: 277-282 36 Sawasdikol S, Tamura M, Jamjit P (1989), Antibody to hemoragic fever with renal syndrome in man and rat in Thailand Bulletin of the Department of Medical Sciences 31: 125-130 37 Zhang YZ, Xiao DL, Wang Y, Wang HX, Sun L, Tao XX, Qu YG (2004) The epidemic characteristics and preventive measures of hemorrhagic fever with renal syndrome in China Chin J Epidemiol 25: 466-469 38 Tkachenko E, Dzagurova T, Bashkirtsev V, Bernshtein A, Apekina N, Sedova N, Okulova N, Korotina N, Nabatnikov P, Malkin A, Smirnov A, Morozov V, Yunicheva Y, Klempa B, Kruger D (2007) Epidemiology of hemorrhagic fever with renal syndrome in european Russia The 7th International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses, Buenos Aires, Argentina June 13-15, Abstract book, Page 17 39 Lokugamage N, Kariwa H, Lokugamage K, Iwasa MA, Hagiya T, Yoshii K, Tachi A, Ando S, Fukushima H, Tsuchiya K, Iwasaki T, Araki K, Yoshimatsu K, Arikawa J, Mizutani T, Osawa K, Sato H, Takashima I (2004) Epizootiological and epidemiological study of hantavirus infection in Japan Microbiol Immunol 48 :843-851 40 Hepojoki J., Strandin T., Lankinen H (2012), "Hantavirus structure-molecular interactions behind the scene", J Gen Virol, 93(Pt 8), pp 1631-1644 41 Muyangwa M., Martynova E V., Khaiboullina S F (2015), "Hantaviral Proteins: Structure, Functions, and Role in Hantavirus Infection", Frontiers in Microbiology, 42 Huong V T Q., Yoshimatsu K., Luan V D (2010), "Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, Vietnam", Emerging Infectious Diseases, 16(2), pp 363-365 43 J Clement, P Maes, M Van Ranst (2006) Hantavirus in the Old and New World, Perspective in Medical Virology, 16, pp161-177 44 Watson DC, Sargianou M, Papa A Epidemiology of Hantavirus infections in humans: A comprehensive, global overview Crit Rev Microbiol 2014;40(3):261-72 45 Oliveira R, Guterres A, Fernandes J Hantavirus Reservoirs: Current Status with an Emphasis on Data from Brazil Viruses 2014;6(5):1929-1973 46 Huong V T Q., Yoshimatsu K., Luan V D (2010), "Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, Vietnam", Emerging Infectious Diseases, 16(2), pp 363-365 PHỤ LỤC Quy trình tách chiết vật liệu di truyền từ mẫu mơ động vật Mục đích: Tách chiết ARN virus Hanta từ mẫu phổi động vật để thực phản ứng RT – PCR chẩn đoán bệnh Nguyên lý: Sử dụng dung dịch ly giải virus TRIzol, cho mẫu phổi cần tách chiết ARN vào dung dịch TRIzol, tế bào bị ly giải, ARN virus gắn vào chất mang ARN Với có mặt ethanol 70 %, ARN virus bị tủa Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, ARN virus gắn chọn lọc màng QIA amp Silicagel nhờ chất mang ARN Sử dụng dung dịch rửa RW1, RPE để loại thành phần tạp bám màng QIA amp Silicagel Nước cất không chứa ARNase tách ARN virus bám màng QIA amp Silicagel Hóa chất sinh phẩm: a Mẫu bệnh phẩm: phổi động vật nghi nhiễm bệnh b Điều kiện bảo quản:  Mẫu bảo quản nhiệt độ -800C  Sinh phẩm sử dụng cho tách chiết vật liệu di truyền bảo quản nhiệt độ phòng c Hóa chất, sinh phẩm:  Rneasy Lipid Tissue (hãng QIAgen) – Cat No 74804  TRIzol (15596 – 018 Hãng Gibco)  Ethanol (70%) (1.00983.1000 hãng Merck)  Chloroform (1.02445.1000 hãng Merck)  Cồn 700 Dụng cụ trang thiết bị: 4.1 Dụng cụ:  Tuýp eppendorf: ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;  Đầu côn loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;  Pippet tự động loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-200 l, 200 -1000 l  Tuýp ly tâm vô trùng 1.5 ml  Tuýp ly tâm vô trùng 2.0 ml 4.2 Thiết bị:  Cối nghiền Micro – pestle (Eppendorf);  Tủ -80oC;  Máy ly tâm cho tuýp ml (Eppendorf);  Máy trộn vortex – MS1 Minishaker (IKA) Các bước tiến hành: 5.1 Chuẩn bị mẫu, dụng cụ, bảo hộ lao động:  Mẫu bệnh phẩm  Lấy mẫu khỏi tủ -80, đặt khay đựng mẫu  Mẫu bệnh phẩm xử lý tủ an toàn sinh học cấp độ  Khu vực làm việc  Trải giấy thấm có mặt khơng thấm nước xuống bề mặt tủ an toàn sinh học  Lồng túi đựng rác thải dụng cụ bẩn vào hộp đựng rác thải để vào tủ an toàn sinh học – Cho dụng cụ cần thiết (tube eppendorf, bút viết) Đánh dấu mã hoá mẫu lên tube eppendorf  Cho mẫu vào tủ an toàn sinh học 5.2 Chuẩn bị sinh phẩm:  Đệm TRIzol  Nếu chưa mở bảo quản nhiệt độ phòng  Nếu mở để sử dụng cần bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, tránh ánh sáng  Đệm RW1  Ghi ngày tháng năm mở đệm RW1 chai  Bảo quản nhiệt độ phòng đệm RW1 sử dụng năm  Đệm RPE  Thêm 44 ml ethanol 96-100% vào chai chứa 11ml RPE  Đánh dấu nắp chai thêm ethanol  Ghi ngày tháng năm chuẩn bị đệm RPE chai  Bảo quản nhiệt độ phòng đệm RPE sử dụng năm 5.3 Tiến hành bước: 1) Lấy 3mm3 mẫu phổi vào cối Micro – pestle, nghiền não 2) Thêm 1ml dung dịch tách triết TRIzol vào hút lên xịt xuống đồng 3) Ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút Thêm 0.2ml chloroform, lắc 4) Ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút 5) Ly tâm 12.000 vòng 15 phút 4oC 6) Lấy pha phía trên, thêm lượng tương đương ethanol 70%, vortex 7) Đặt cột lọc vào tube 2ml, cho 630 µl hỗn dịch mẫu vào cột, đậy nắp, ly tâm 8000 vòng/1 phút Sau chuyển cột sang tube 2ml mới, loại bỏ tube cũ 8) Tiếp tục nhỏ mẫu lại vào cột làm tiếp bước hết dung dịch mẫu 9) Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 700 µl dung dịch đệm RW1 Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/ 30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 10) Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 11) Tiếp tục cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 12) Nên Ly tâm khô 14000 vòng/ phút 13) Chuyển cột vào tube 1,5ml, mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 50µl nước cất khơng chứa ARNase, để nhiệt độ phòng phút trước ly tâm 8000 vòng/ phút Loại bỏ cột Thu tube chứa mẫu ARN 14) ARN bảo quản hộp giấy đựng mẫu ARN Ghi sơ đồ mẫu hộp Khử trùng phía ngồi hộp đựng mẫu cồn 700 15) Lưu giữ mẫu ARN -200C - 80oC 5.4 Khử trùng xử lý rác thải:  Cho dụng cụ bẩn vào hộp đựng, sau cho tiếp vào túi đựng rác thải buộc kín túi, khử trùng bề mặt xung quanh túi rác thải cồn 70 đưa tủ an toàn sinh học cho vào nồi hấp (autoclave) tiệt trùng  Phân chia rác thải vào túi rác thải y tế hộp đựng chuyên dụng cho dung dịch, đồ sắc nhọn khơng rò ngồi Buộc kín túi đóng kín nắp hộp Khử trùng xung quanh bề mặt đưa tủ an toàn sinh học cho vào nồi hấp (autoclave) tiệt trùng  Đối với dụng cụ phòng thí nghiệm phun cồn tiệt trùng xung quanh bề mặt để đèn UV tủ an toàn sinh học (với dụng cụ nhỏ) đèn UV phòng thí nghiệm với dụng cụ lớn  Xịt cồn lên bề mặt tủ an toàn sinh học, dùng khăn giấy thấm cồn lau bề mặt Bật đèn UV tủ an toàn sinh học để khử trùng  Sau tiệt trùng dụng cụ bẩn rác thải autoclave xong, mang ngồi phòng thí nghiệm bỏ rác thải vào nơi xử lý rác thải y tế, dụng cụ bẩn đem rửa để tái sử dụng Biểu mẫu: Bao gồm mã số bệnh phẩm, số lượng mẫu, sinh phẩm hạn sử dụng, ngày người thực Tài liệu tham khảo:  Rneasy Lipid Tissue Kit, Qiagen PHỤ LỤC SOP chạy phản ứng RTPCR Mục đích: Khuếch đại ARN virus Hanta mẫu nghi nhiễm Nguyên lý: ARN tổng số tách triết từ mẫu nghi nhiễm Sau đó, ARN cho vào hỗn hợp phản ứng RT – PCR nhờ ADN polymerase thực tổng hợp mạch từ ADN mạch khn với có mặt cặp mồi đặc hiệu Mồi đoạn ADN đặc hiệu có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Sản phẩm ADN sau phản ứng PCR đọc tia cực tím nhờ điện di thạch có nhuộm ethidium bromide Định nghĩa từ viết tắt: PTN: Phòng thí nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction): Chuỗi phản ứng polymerase RT- PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi gen chép ngược ARN: Acide Ribonucleic TAE: Tris-acetate-EDTA Hóa chất sinh phẩm: 4.1 Điều kiện bảo quản:  Hóa chất sinh phẩm sử dụng phản ứng RT-PCR phải bảo  quản -200C để đảm bảo tính ổn định sinh phẩm Khi sử dụng cho pha chế, sinh phẩm phải đặt đá lạnh,  phải cất lại sau dùng xong Riêng sinh phẩm RNase inhibitor mang sử dụng cho sinh phẩm phải cất lại sau dùng xong 4.2 Sinh phẩm  QIAGEN Onestep RT- PCR kit, cat No 210212 1) Đệm PCR 5X 2) dNTP: gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP, nồng độ 10mM 3) Taq DNA Polymerase (Omniscript TM, Sensiscript TM HotStarTaq DNA polymeraza) 4) Nước cất vơ trùng khơng có Rnase 4.3 Cặp mồi Tên mồi SEO-MF 1936 SEO-MR 2353 Trình tự nucleotid 5’ – 3’ Gtggactcttcttctcattatt tgggcaatctggggggttgcatg Gen đích M M Kích thước 420 bp 4.4 Chứng chuẩn:  Chứng dương: ARN tách chiết từ não chuột gây nhiễm CVS  Chứng âm: sử dụng khuôn mẫu nước cất tinh khiết  Chứng âm tách chiết: ARN tách chiết từ não chuột khỏe mạnh Dụng cụ, thiết bị 5.1 Điều kiện bảo quản  Dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm bảo quản nơi khơ ráo, thơng thống Khi sử dụng lấy bảo quản phòng thí nghiệm  Trang thiết bị phòng thí nghiệm bảo quản vận hành khoảng nhiệt độ từ 200C – 250C 5.2 Dụng cụ:  Tuýp eppendorf vô trùng: ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;  Đầu côn lọc loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;  Pippet tự động loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-200 l, 200 -1000 l;  Găng tay vơ trùng  Giá tích lạnh 5.3 Thiết bị  Máy lắc vortex (MS1 – Minishaker)  Máy ly tâm lạnh dành cho tube ml  Hốt an toàn sinh học cấp  Máy PCR Eppendoft Các bước tiến hành: 6.1 Chuẩn bị dụng cụ  Đánh dấu tuýp 1.5 ml (dùng để trộn sinh phẩm)  Chuẩn bị tuýp PCR  Pipet đầu loại  Giá tích lạnh  Sơ đồ phản ứng cần làm 6.2 Chuẩn bị thiết bị: Cài đặt chu trình chạy theo hướng dẫn nhà sản xuất theo hướng dẫn sinh phẩm 6.3 Thành phần phản ứng RT - PCR Chất phản ứng Nước cất dNTPs Dung dịch đệm phản ứng (5x Buffer) Mồi ngược (MR 2353 – 10 pmol/µl) Mồi xi (MF 1936 – 10 pmol/µl) Enzym mix Mẫu ARN (Chứng dương 2l) Tởng thể tích 6.4 Tiến hành phản ứng Thể tích cho phản ứng 10 l l 10 l l l l 20 l 50 l Chia 40 l hỗn hợp mixture vào tuýp eppendorf, sau cho 10l ARN vào tuýp đánh dấu mẫu bệnh phẩm, chứng dương 10 l nước cất vô trùng vào tuýp chứng âm, trộn Các điểm cần lưu ý  Cần phải tính tốn số lượng mẫu xét nghiệm, chứng dương, chứng âm để pha hỗn dịch phản ứng theo công thức: N = (n + 3) x 40 + N: Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng + n: Số mẫu thử nghiệm  Toàn thành phần tham gia phản ứng phải ủ đá bào trình trộn hỗn dịch cho phản ứng RT – PCR (mix)  Mix phải trộn trước chia vào tube  Chu kỳ nhiệt phản ứng RT - PCR 500C: 950C: 94oC: 520C: 720C: 720C: 40C: 30 phút 15 phút phút phút 1,5 phút 10 phút ∞ 40 chu kỳ  Tra mẫu vào týp pha  Điện di sản phẩm PCR theo mẫu “Điện di sản phẩm PCR thạch” Phân tích kết  Tiêu chuẩn chứng: + Kết đọc chứng dương dương tính chứng âm tách chiết , chứng âm (nước cất tinh khiết) âm tính Trong trường hợp ngược lại, phải thực lại phản ứng + Chứng dương: Xuất băng ADN vị trí tương ứng 420 bp so với thang chuẩn + Chứng âm khơng có băng ADN vị trí tương ứng 420 bp  Nhận định kết quả: Mẫu dương tính xuất băng ADN tương ứng vị trí 420 bp tương tự chứng dương Chứng dương, chứng âm đạt tiêu chuẩn Xử lý mẫu, dụng cụ, chất thải:  Thạch, vật liệu qua sử dụng phải cho vào túi chuyên dùng, hấp tiệt trùng autoclave  Dung dịch TAE ethidium bromide phải chứa bể chứa chuyên dùng để xử lý trước thải hệ thống nước thải chung  Phun cồn NaClO 100 ppm tiệt trùng xung quanh bề mặt làm việc sau bật đèn tím phòng 30 phút Tài liệu tham khảo: Qiamp Viral RNA Mini Handbook Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC ĐI M PHÂN TỬ GEN M CỦA VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT TẠI M T SỐ ĐI M Ở HÀ NỘI TỪ 2015-2017 Chuyên ngành: Vi sinh y học M số: 60720115 LUẬN... nghiên cứu tham khảo Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài Nghiên cứu số đặc đi m phân tử gen M virus Hanta chuột số đi m Hà Nội từ 2015 – 2017” với m c tiêu sau: 1: M tả số đặc đi m phân tử (nucleotide... Đặc đi m phân tử đoạn gen M virus Hanta chuột số đi m Hà Nội từ 2015-2017 47 4.3 Phân loài phát sinh loài virus Hanta chuột số đi m Hà Nội từ 2015-2017 dựa vào phân tích đoạn gen M 51