NGHIÊN cứu một số đặc điểm PHÂN tử đoạn GEN m của VI rút HANTA TRÊN CHUỘT tại một số điểm ở hà nội từ năm 2015 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHI£N CứU MộT Số ĐặC ĐIểM PHÂN Tử đoạn GEN M CủA VI RúT HANTA TRÊN CHUộT TạI số điểm ë Hµ NéI Tõ N¡M 2015 - 2018 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHI£N CứU MộT Số ĐặC ĐIểM PHÂN Tử đoạn GEN M CủA VI RúT HANTA TRÊN CHUộT TạI số điểm ë Hµ NéI Tõ N¡M 2015 - 2018 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số : 60720115 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS.BS Phạm Hồng Nhung 2.TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI - 2017 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương vi rút Hanta 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Bệnh học dịch tễ học 1.1.3 Tình hình dịch tễ giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm vi rút học .6 1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán vi rút Hanta 13 1.2 Kĩ thuật Sequencing 14 1.3 Các nghiên cứu di truyền phân loài vi rút Hanta 15 1.3.1 Các nghiên cứu di truyền phân loài vi rút Hanta giới 15 1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền phân loài vi rút Hanta Việt Nam .16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 17 2.3 Thời gian nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu .17 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu .18 2.5 Đạo đức nghiên cứu 23 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 24 3.1 Mô tả đặc điểm phân tử đoạn gen M vi rút Hanta thu quần thể chuột Hà Nội từ 2015 - 2018 24 3.2 Phân loài, phát sinh chủng loài chủng phân lập chuột Hà Nội 2015 - 2018 chủng khu vực giới.25 CHƯƠNG 26 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 26 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 27 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ .27 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt DOBV BCCV DNA HFRS HPS HTNV ICTV Phiên ÂmTiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt Dobrava/Belgrade Virus Black Creek Canal Virus Deoxyribose Nucleic Acid Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Hantavirus Pulmonary Syndrome Hantaan Virus International Committee on Taxonomy of Vi rút Dobrava/Belgrade Vi rút Black Creek Canal Deoxyribose Nucleic Acid Sốt xuất huyết có hội chứng Thận Hội chứng Phổi vi rút Hanta Vi rút Hantaan IFN LANV MCLV NCR NE ORF ORNV PHV PUUP RNA RT Viruses Interferon Laguna Negra Virus Maciel Virus Non Coding Region Nephropathia Epidemica Open Reading Frame Orán Virus Prospect Hill Virus Puumala Virus Ribonucleic Acid Reverse Transcription Polymerase Chain Interferon Vi rút Laguna Negra Vi rút Maciel Vùng khơng mã hóa Nephropathia Epidemica Khung đọc mở Vi rút Orán Vi rút Prospect Hill Vi rút Puumala Ribonucleic Acid Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR SAAV SEOV SNV THAIV Reaction Saaremaa Virus Seoul Virus Sin Nombre Virus Thailand Virus phiên mã ngược Vi rút Saaremaa Vi rút Seoul Vi rút Sin Nombre Vi rút Thái Lan Ủy ban phân loại vi rút Quốc tế DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sự phân bố địa lý vi rút Hanta vật chủ .6 Bảng 1.2 Trình tự mồi kĩ thuật RT-PCR phát vi rút Hanta 13 Bảng 2.1 Các chủng so sánh 16 Bảng 3.2 So sánh trình tự nucleotid gen M chủng phát 22 với chủng so sánh 22 Bảng 3.3 So sánh trình tự nucleotid gen M chủng phát 23 với chủng so sánh 23 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phân bố hội chứng vi rút Hanta Hình 1.2 Vi rút Hanta kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Cấu trúc vi rút hệ gen vi rút Hanta 10 Hình 1.4 Quá trình xâm nhập nhân lên tế bào chủ vi rút Hanta 11 Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100 14 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu .17 Hình 3.1 Đặc điểm nucleotide đoạn gen M số chủng thu 22 Hình 3.2 Trình tự acid amin chủng thu so với chủng so sánh 23 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loài vi rút Hanta quần thể chuột dựa vào phân tích đoạn gen M 23 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae truyền bệnh sang người chủ yếu qua loài động vật gặm nhấm, đặc biệt chuột bị cắn tiếp xúc trực tiếp với chất tiết (phân, nước tiểu) động vật [1] Th ể nặng bệnh có biểu Hội chứng Hội chứng Thận (HFRS) với tỷ lệ tử vong 15% phổi (HPS) có tỷ lệ tử vong lên tới 50% [2] Bệnh vi rút Hanta ghi nhận tất châu lục Mỗi lồi vi rút truyền bệnh cho người thơng qua vật chủ xác định phân bố theo vùng địa lý khác nhau, phân bố HFRS HPS bị giới hạn theo phân bố địa lý loài động vật gặm nhấm Theo Mohammed Mir, phần lớn vi rút phân họ Neotominae Sigmodontinae gây HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao (40-50%), vi rút phân bố khắp Bắc Nam Mỹ loài gặm nhấm khác Châu Á châu lục có lịch sử lâu đời nhiễm vi rút Hanta Vi rút HTNV Seoul (SEOV) tác nhân gây HFRS châu Á với khoảng 300-500 ca tử vong HFRS báo cáo hàng năm, 1-4% Hàn Quốc [3], [4] Tại Việt Nam Singapore, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với vi rút từ 14-34% [5] Ở nước ta có báo cáo Hội chứng Thận Phổi vi rút Hanta Hà Nội trung tâm kinh tế, văn hóa, trị nước, ln có giao thương lớn vậy, quần thể chuột dễ dàng xâm nhập mang theo mầm bệnh khác có vi rút Hanta Vì việc chủ động giám sát bệnh chuột có vi rút Hanta quan trọng để có biện pháp phòng bệnh chủ động hiệu Đồng thời, việc nghiên cứu sâu phân lồi vi rút từ xác định nguồn gốc vi rút nội địa hay xâm nhập vô quan trọng giúp cho cơng tác phòng chống cung cấp sở liệu gen vi rút Hanta ngân hàng gen giới để nhà khoa học nghiên cứu tham khảo Chính vậy, tiến hành đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm phân tử đoạn gen M vi rút Hanta chuột số điểm Hà Nội từ 2015 – 2018” với mục tiêu sau: 1: Mô tả số đặc điểm phân tử gen M vi rút Hanta chuột thu thập số điểm Hà Nội 2015-2018 2: Phân tích lồi, phát sinh chủng loài vi rút Hanta phân lập Hà Nội, năm 2015 - 2018 dựa đoạn gen M CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương vi rút Hanta 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae Có số ý kiến cho loại bệnh với triệu chứng tương tự hội chứng HFRS ghi chép y văn người Trung Quốc từ năm 960 [31] Vào kỉ 15 Anh, người ta ghi nhận chứng bệnh bí ẩn cho phù hợp với triệu chứng vi rút Hanta gây nên Người bệnh xuất tình trạng mệt mỏi đổ nhiều mồ hôi, dịch bệnh bùng phát với đợt lớn vào năm 1485, 1508, 1517, 1528 1551 [6] Thực tế, HFRS lần phát ghi nhận chiến tranh Triều tiên (1951 – 1954), bệnh khiến 3000 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh chưa tìm 25 năm sau Vào năm 1978, nguyên nhân gây HFRS xác định vi rút Hanta, phân lập từ loài chuột Apodemus agrarius bên bờ sơng Hantaan thuộc Nam Triều Tiên, tác nhân đặt theo tên sông Hantaan virus Năm 1993, bùng phát trường hợp suy hô hấp bất thường, sau gọi HPS vùng Bắc Mỹ khiến nhiều người tử vong Sau đó, khoảng thời gian ngắn, vi rút gây HPS phân lập từ loài Peromyscus maniculatus sau đặt tên vi rút (SNV tên vơ danh tiếng Tây Ban Nha) [7] 1.1.2 Bệnh học dịch tễ học a Nguồn lây phương thức truyền bệnh Nguồn lây truyền Vi rút Hanta lây truyền bệnh cho người qua vật chủ chứa thường động vật gặm nhấm với lồi tiêu biểu có mặt hầu hết nơi giới Ngoại trừ vi rút Puumala phát chuột đồng lông đỏ-nâu hầu hết vi rút Hanta gây bệnh cho người liên quan tới chuột nhắt chuột cống [8] Vi rút Hanta gây ảnh hưởng đến vật chủ chứa chúng, báo cáo thử nghiệm cho thấy vi rút Hanta không gây nên triệu chứng bệnh chuột Mặc dù vi rút 29 Bàn luận theo mục tiêu kết nghiên cứu 30 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Kết luật theo mục tiêu nghiên cứu DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ Kiến nghị theo kết nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Musalwa Muyangwa, Ekaterina V Martynova, Svetlana F Khaiboullina, Sergey P Morzunov, and Albert A Rizvanov Hantaviral Proteins: Structure, Functions, and Role in Hantavirus Infection s.l : Front Microbiol, 2015 Nov 27 https://www.cdc.gov/hantavirus/technical/hanta/virology.html Song KJ1, Baek LJ, Moon S, Ha SJ, Kim SH, Park KS, Klein TA, Sames W, Kim HC, Lee JS, Yanagihara R, Song JW s.l Muju virus, a novel hantavirus harboured by the arvicolid rodent Myodes regulus in Korea.: J Gen Virol 2007, Nov, Vols 88(Pt 11):3121-9 Lee HW, Lee PW, Johnson KM s.l : Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever J Infect Dis, 1978 Mar, Vols 137(3):298-308 Hantaviruses globally emerging pathogens Kruger DH, Figueiredo LT, Song JW, Klempa B s.l : J Clin Virol, 2015 Mar, Vols 64:128-36 Paul Heyman, Leopold Simons and Christel Cochez Were the English Sweating Sickness and the Picardy Sweat Caused by Hantaviruses? s.l : Viruses, 2014 Jan, Vols 6(1): 151–171 Jonsson, C.B., L.T Figueiredo, and O Vapalahti s.l : Clin Microbiol Rev, A global perspective on hantavirus ecology, epidemiology, and disease 2010, Vols 23(2): p 412-41 Watson, D.C., et al s.l : Crit Rev Epidemiology of Hantavirus infections in humans: A comprehensive, global overview Microbiol, 2013, Vols p 1-12 Hart, C.A and M Bennett Hantavirus infections: epidemiology and pathogenesis Microbes and Infection 1999, Vol 1: p 1229−1237 10 Kruger, D.H., et al s.l Hantaviruses globally emerging pathogens.: J Clin Virol, 2015, Vols 64: p 128-36 11 Zhenqiang Bi, Pierre B.H Formenty, Cathy E Roth Hantavirus Infection: a review and global update 2008 12 Padula PJ, Colavecchia SB, Martinez VP, Gonzalez Della Valle MO, Edelstein A, Miguel SD, Russi J, Riquelme JM, Colucci N, Almiron M, Rabinovich RD Genetic diversity, distribution, and serological features of hantavirus infection in five countries in South America s.l : J Clin Microbiol, 2000, Vols 38: 3029-3035 13 E., Weir Hantavirus: 'tis the season s.l : CMAJ, 2005, Vol 17:147 14 Wu GH Progress of epidemiological studies on hemorrhagic fever with renal syndrome in China (2003), s.l : Chin J Epidemiol, Vols 24: 413-415 15 Zhang YZ, Xiao DL, Wang Y, Wang HX, Sun L, Tao XX, Qu YG The epidemic characteristics and preventive measures of hemorrhagic fever with renal syndrome in China s.l : Chin J Epidemiol, 2004, Vols 25: 466-469 16 King, A M Q., Adams, M J., Carstens, E B & Lefkowitz, E J Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses 2011 : Elsevier Academic Press 17 Kruănger, D H., Ulrich, R & Lundkvist A, A Hantavirus infections and their prevention s.l : Microbes Infect, 2001, Vols 3, 1129–1144 18 Maes, P., Klempa, B., Clement, J., Matthijnssens, J., Gajdusek, D C., Kruă ger, D H & Van Ranst, M A proposal for new criteria for the classification of hantaviruses, based on S and M segment protein sequences s.l : Infect Genet Evol, 2009, Vols 9, 813–820 19 Plyusnin A., Kukkonen S K., Plyusnina A., Vapalahti O., Vaheri A Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with recombinant S RNA segment s.l : EMBO J , 2002, Vols 21, 1497–1503 20 Plyusnin, A Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy s.l : Arch Virol, 2002, Vols 147, 665–682 21 Plyusnin, A., Vapalahti, O & Vaheri, A Hantaviruses: genome structure, expression and evolution s.l : J Gen Virol, 1996, Vols 77, 2677–2687 22 Gavrilovskaya I N., Shepley M., Shaw R., Ginsberg M H., Mackow E R (1998) Beta3 Integrins mediate the cellular entry of Hantaviruses that cause respiratory failure Proc Natl Acad Sci U.S.A.95 7074–7079 22 Gavrilovskaya IN, Gorbunova EE, Mackow NA, Mackow ER s.l Hantaviruses direct endothelial cell permeability by sensitizing cells to the vascular permeability factor VEGF, while angiopoietin and sphingosine 1phosphate inhibit hantavirus-directed permeabilit.: J Virol, 2008, Vols 82:5797–806 23 Elliott RM, Schmaljohn CS, Collett MS Bunyaviridae genome structure and gene expression s.l : Curr Top Microbiol Immunol, 1991, Vols 169:91–141 24 Mir MA, Duran WA, Hjelle BL, Ye C, Panganiban AT Storage of cellular 5′ mRNA caps in P bodies for viral cap-snatching s.l : Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, Vols 105:19294–9 25 Khaiboullina SF, St Jeor SC Hantavirus immunology s.l : Viral Immunol, 2002, Vols 15: 609–625 26 Linderholm M, Bjermer L, Juto P, Roos G, Sandstrom T, Settergren B, TRNAvik A Local host response in the lower respiratory tract in nephropathia epidemica s.l : Scand J Infect Dis, 1993, Vols 25: 639–646 27 Musalwa Muyangwa, Ekaterina V Martynova, Svetlana F Khaiboullina, Sergey P Morzunov, and Albert A Rizvanov Hantaviral Proteins: Structure, Functions, and Role in Hantavirus Infection s.l : Front Microbiol , 2015, Vol 6: 1326 28 Thua Thang TRUONG, Kumiko Yoshimatsu, Koichi ARAKI, Byoung - Hee LEE, Uyen Ninh Tr Molecular Epidemiological and Serological Studies of Hantavirus Infection in Northern Vietnam.: Journal of Veterinary Medical Science Vol 71 (2009) No 10 October P 1357-1363 29 Nghiên cứu huyết học nhiễm vi rút Hanta số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Trương Thừa Thắng: 2008, Luận án tiến sĩ 30 Trần Đức, J Arikawa, Trương Thừa Thắng, Phạm Thị Bích Ngọc, Trương Uyên Ninh: Phát vi rút Seoul chuột R novergicus thành phố Hải Phòng 2003-2005 Tạp Chí Y Học Thực Hành (678), số 9/2009 31 Lee HW Hemorrhagic fever with renal syndrome History of Hantaan virus and epidemiological features Scand J Infect Dis 1982;36:82–85 32 Boonsong L, McNeely JA, Marshall JT: Mammals of Thailand Association for the Conservation of Wildlife, Bangkok 1988, 748 33 Reynes JM, Soares JL, Hue T, Bouloy M, Sun S, Kruy SL, Flye Sainte Marie F, Zeller H: Evidence of the presence of Seoul virus in Cambodia Microbes Infect 2003, 5: 769-73 10.1016/S1286-4579(03)00149-7 34 Elwell MR, Ward GS, Tingpalapong M, Leduc JW: Serologic evidence of Hantaan-like virus in rodents and man in Thailand Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 1985, 16: 349-354 35 Nitatpattana N, Chauvency G, Dardaine J, Poblap T, Jumronsawat K, Tangkanakul W, Poonsuksombat D, Yoksan S, Gonzalez JP: Serological study of Hantavirus in the rodent population of Nakhon Pathom and Nakhon Ratchasima provinces in Thailand Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 2000, 31: 277-282 36 Sawasdikol S, Tamura M, Jamjit P: Antibody to hemoragic fever with renal syndrome in man and rat in Thailand Bulletin of the Department of Medical Sciences 1989, 31: 125-130 37 Spiropoulou CF, Morzunov S, Feldmann H, Sanchez A, Peters CJ, Nichol ST Genome structure and variability of a virus causing hantavirus pulmonary syndrome Virology 1994 May 1; 200(2):715-23 38 Nicolás Cifuentes-Muñoz, Natalia Salazar-Quiroz, and Nicole D Tischler Hantavirus Gn and Gc Envelope Glycoprotein: Key structural for Virus Cell Entry and Virus Assembly Viruses 2014 Apr; 6(4): 1801–1822 39 Wang Hua, Yoshimatsu K, Ebihara H et al Genetic diversity of hantavirus isolated in China and characterization of novel hantavirus isolated from Niviventer confucianus and Rattus rattus Virology 2000; 278(2):332-45 40 Colleen B Jonsson, Luiz Tadeu Moraes Figueiredo, and Olli Vapalahti A global perspective on Hantavirus Ecology, Epidemiology and Disease Clin Microbiol Rev 2010 Apr; 23(2): 412–441 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung Thời gian Tìm, đọc tài liệu tham khảo 10-06/2017 Viết đề cương chỉnh sửa đề cương Bảo vệ đề cương Tiến hành nghiên cứu 06-07/2017 TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh 08/2017 TS Phạm Hồng Nhung Bs Bùi Thị Huyền My 08/2017- Bs Bùi Thị Huyền My 07/2018 03-05/2018 Bs Bùi Thị Huyền My Phân tích kết Bs Bùi Thị Huyền My Viết luận văn chỉnh sửa Bs Bùi Thị Huyền My Bs Bùi Thị Huyền My Người tham gia Bảo vệ luận văn Chỉnh sửa nộp nhà trường 10-11/2018 11/2018 12/2018 PHỤ LỤC TS BS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS BS Phạm Hồng Nhung (hướng dẫn) Bs Bùi Thị Huyền My Bs Bùi Thị Huyền My Quy trình tách chiết vật liệu di truyền từ mẫu mô động vật Mục đích: Tách chiết RNA virut Hanta từ mẫu phổi động vật để thực phản ứng RT – PCR chẩn đoán bệnh Nguyên lý: Sử dụng dung dịch ly giải virut TRIzol, cho mẫu phổi cần tách chiết RNA vào dung dịch TRIzol, tế bào bị ly giải, RNA virut gắn vào chất mang RNA Với có mặt ethanol 70 %, RNA virut bị tủa Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, RNA virut gắn chọn lọc màng QIA amp Silicagel nhờ chất mang RNA Sử dụng dung dịch rửa RW1, RPE để loại thành phần tạp bám màng QIA amp Silicagel Nước cất không chứa RNAase tách RNA virut bám màng QIA amp Silicagel Hóa chất sinh phẩm: a Mẫu bệnh phẩm: phổi động vật nghi nhiễm bệnh b Điều kiện bảo quản:  Mẫu bảo quản nhiệt độ -800C  Sinh phẩm sử dụng cho tách chiết vật liệu di truyền bảo quản nhiệt độ phòng c Hóa chất, sinh phẩm:  Rneasy Lipid Tissue (hãng QIAgen) – Cat No 74804  TRIzol (15596 – 018 Hãng Gibco)  Ethanol (70%) (1.00983.1000 hãng Merck)  Chloroform (1.02445.1000 hãng Merck)  Cồn 700 Dụng cụ trang thiết bị: 4.1 Dụng cụ:  Tuýp eppendorf: ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;  Đầu côn loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;  Pippet tự động loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-200 l, 200 -1000 l  Tuýp ly tâm vô trùng 1.5 ml  Tuýp ly tâm vô trùng 2.0 ml 4.2 Thiết bị:  Cối nghiền Micro – pestle (Eppendorf);  Tủ -80oC;  Máy ly tâm cho tuýp ml (Eppendorf);  Máy trộn vortex – MS1 Minishaker (IKA) Các bước tiến hành: 5.1 Chuẩn bị mẫu, dụng cụ, bảo hộ lao động:  Mẫu bệnh phẩm  Lấy mẫu khỏi tủ -80, đặt khay đựng mẫu  Mẫu bệnh phẩm xử lý tủ an toàn sinh học cấp độ  Khu vực làm việc  Trải giấy thấm có mặt khơng thấm nước xuống bề mặt tủ an toàn sinh học  Lồng túi đựng rác thải dụng cụ bẩn vào hộp đựng rác thải để vào tủ an toàn sinh học – Cho dụng cụ cần thiết (tube eppendorf, bút viết) Đánh dấu mã hoá mẫu lên tube eppendorf  Cho mẫu vào tủ an toàn sinh học 5.2 Chuẩn bị sinh phẩm:  Đệm TRIzol  Nếu chưa mở bảo quản nhiệt độ phòng  Nếu mở để sử dụng cần bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, tránh ánh sáng  Đệm RW1  Ghi ngày tháng năm mở đệm RW1 chai  Bảo quản nhiệt độ phòng đệm RW1 sử dụng năm  Đệm RPE  Thêm 44 ml ethanol 96-100% vào chai chứa 11ml RPE  Đánh dấu nắp chai thêm ethanol  Ghi ngày tháng năm chuẩn bị đệm RPE chai  Bảo quản nhiệt độ phòng đệm RPE sử dụng năm 5.3 Tiến hành bước: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) Lấy 3mm3 mẫu phổi vào cối Micro – pestle, nghiền não Thêm 1ml dung dịch tách triết TRIzol vào hút lên xịt xuống đồng Ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút Thêm 0.2ml chloroform, lắc Ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút Ly tâm 12.000 vòng 15 phút 4oC Lấy pha phía trên, thêm lượng tương đương ethanol 70%, vortex Đặt cột lọc vào tube 2ml, cho 630 µl hỗn dịch mẫu vào cột, đậy nắp, ly tâm 8000 vòng/1 phút Sau chuyển cột sang tube 2ml mới, loại bỏ tube cũ 8) Tiếp tục nhỏ mẫu lại vào cột làm tiếp bước hết dung dịch mẫu 9) Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 700 µl dung dịch đệm RW1 Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/ 30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 10)Mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 11)Tiếp tục cho vào cột 500 µl dung dịch đệm RPE Đóng nắp cột, ly tâm 8000 vòng/30 giây Chuyển cột sang tube 2ml Loại bỏ tube cũ 12)Nên Ly tâm khơ 14000 vòng/ phút 13)Chuyển cột vào tube 1,5ml, mở nắp cột nhẹ nhàng, cho vào cột 50µl nước cất khơng chứa RNAase, để nhiệt độ phòng phút trước ly tâm 8000 vòng/ phút Loại bỏ cột Thu tube chứa mẫu RNA 14)RNA bảo quản hộp giấy đựng mẫu RNA Ghi sơ đồ mẫu hộp Khử trùng phía ngồi hộp đựng mẫu cồn 700 15)Lưu giữ mẫu RNA -200C - 80oC 5.4 Khử trùng xử lý rác thải:  Cho dụng cụ bẩn vào hộp đựng, sau cho tiếp vào túi đựng rác thải buộc kín túi, khử trùng bề mặt xung quanh túi rác thải cồn 70 đưa tủ an toàn sinh học cho vào nồi hấp (autoclave) tiệt trùng  Phân chia rác thải vào túi rác thải y tế hộp đựng chuyên dụng cho dung dịch, đồ sắc nhọn khơng rò ngồi Buộc kín túi đóng kín nắp hộp Khử trùng xung quanh bề mặt đưa tủ an toàn sinh học cho vào nồi hấp (autoclave) tiệt trùng  Đối với dụng cụ phòng thí nghiệm phun cồn tiệt trùng xung quanh bề mặt để đèn UV tủ an toàn sinh học (với dụng cụ nhỏ) đèn UV phòng thí nghiệm với dụng cụ lớn  Xịt cồn lên bề mặt tủ an toàn sinh học, dùng khăn giấy thấm cồn lau bề mặt Bật đèn UV tủ an toàn sinh học để khử trùng  Sau tiệt trùng dụng cụ bẩn rác thải autoclave xong, mang ngồi phòng thí nghiệm bỏ rác thải vào nơi xử lý rác thải y tế, dụng cụ bẩn đem rửa để tái sử dụng Biểu mẫu: Bao gồm mã số bệnh phẩm, số lượng mẫu, sinh phẩm hạn sử dụng, ngày người thực Tài liệu tham khảo:  Rneasy Lipid Tissue Kit, Qiagen PHỤ LỤC Quy trình chạy phản ứng RT PCR Mục đích: Khuếch đại RNA virut Hanta mẫu nghi nhiễm Nguyên lý: RNA tổng số tách triết từ mẫu nghi nhiễm Sau đó, RNA cho vào hỗn hợp phản ứng RT – PCR nhờ ADN polymerase thực tổng hợp mạch từ ADN mạch khuôn với có mặt cặp mồi đặc hiệu Mồi đoạn ADN đặc hiệu có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Sản phẩm ADN sau phản ứng PCR đọc tia cực tím nhờ điện di thạch có nhuộm ethidium bromide Định nghĩa từ viết tắt: PTN: Phòng thí nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction): Chuỗi phản ứng polymerase RT- PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi gen chép ngược RNA: Acide Ribonucleic TAE: Tris-acetate-EDTA Hóa chất sinh phẩm: 4.1 Điều kiện bảo quản:  Hóa chất sinh phẩm sử dụng phản ứng RT-PCR phải bảo quản  -200C để đảm bảo tính ổn định sinh phẩm Khi sử dụng cho pha chế, sinh phẩm phải đặt đá lạnh,  phải cất lại sau dùng xong Riêng sinh phẩm RNase inhibitor mang sử dụng cho sinh phẩm phải cất lại sau dùng xong 4.2 Sinh phẩm  QIAGEN Onestep RT- PCR kit, cat No 210212 1) Đệm PCR 5X 2) dNTP: gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP, nồng độ 10mM 3) Taq DNA Polymerase (Omniscript TM, Sensiscript TM HotStarTaq DNA polymeraza) 4) Nước cất vô trùng khơng có Rnase 4.3 Cặp mồi Tên mồi Trình tự nucleotid 5’ – 3’ SEO-MF 1936 Gtggactcttcttctcattatt SEO-MR 2353 tgggcaatctggggggttgcatg Gen đích M M Kích thước 420 bp 4.4 Chứng chuẩn:  Chứng dương: RNA tách chiết từ não chuột gây nhiễm CVS  Chứng âm: sử dụng khuôn mẫu nước cất tinh khiết  Chứng âm tách chiết: RNA tách chiết từ não chuột khỏe mạnh Dụng cụ, thiết bị 5.1 Điều kiện bảo quản  Dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm bảo quản nơi khơ ráo, thơng thống Khi sử dụng lấy bảo quản phòng thí nghiệm  Trang thiết bị phòng thí nghiệm bảo quản vận hành khoảng nhiệt độ từ 200C – 250C 5.2 Dụng cụ: Tuýp eppendorf vô trùng: ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml; Đầu côn lọc loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l; Pippet tự động loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-200 l, 200 -1000 l; Găng tay vơ trùng Giá tích lạnh 5.3 Thiết bị  Máy lắc vortex (MS1 – Minishaker)  Máy ly tâm lạnh dành cho tube ml  Hốt an toàn sinh học cấp  Máy PCR Eppendoft Các bước tiến hành: 6.1 Chuẩn bị dụng cụ  Đánh dấu tuýp 1.5 ml (dùng để trộn sinh phẩm)  Chuẩn bị tuýp PCR  Pipet đầu loại  Giá tích lạnh  Sơ đồ phản ứng cần làm 6.2 Chuẩn bị thiết bị: Cài đặt chu trình chạy theo hướng dẫn nhà sản xuất theo hướng dẫn sinh phẩm 6.3 Thành phần phản ứng RT - PCR Chất phản ứng Thể tích cho phản ứng 10 l l 10 l l l l 20 l 50 l Nước cất dNTPs Dung dịch đệm phản ứng (5x Buffer) Mồi ngược (MR 2353 – 10 pmol/µl) Mồi xi (MF 1936 – 10 pmol/µl) Enzym mix Mẫu RNA (Chứng dương 2l) Tổng thể tích 6.4 Tiến hành phản ứng Chia 40 l hỗn hợp mixture vào tuýp eppendorf, sau cho 10l RNA vào tuýp đánh dấu mẫu bệnh phẩm, chứng dương 10 l nước cất vô trùng vào tuýp chứng âm, trộn Các điểm cần lưu ý Cần phải tính tốn số lượng mẫu xét nghiệm, chứng dương, chứng âm để pha hỗn dịch phản ứng theo công thức: N = (n + 3) x 40 + N: Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng + n: Số mẫu thử nghiệm Toàn thành phần tham gia phản ứng phải ủ đá bào trình trộn hỗn dịch cho phản ứng RT – PCR (mix) Mix phải trộn trước chia vào tube  Chu kỳ nhiệt phản ứng RT - PCR 500C: 30 phút 95 C: 15 phút o 94 C: phút 52 C: phút 40 chu kỳ 72 C: 1,5 phút 72 C: 10 phút C: ∞  Tra mẫu vào týp pha  Điện di sản phẩm PCR theo mẫu “Điện di sản phẩm PCR thạch” Phân tích kết  Tiêu chuẩn chứng: + Kết đọc chứng dương dương tính chứng âm tách chiết , chứng âm (nước cất tinh khiết) âm tính Trong trường hợp ngược lại, phải thực lại phản ứng + Chứng dương: Xuất băng ADN vị trí tương ứng 420 bp so với thang chuẩn + Chứng âm khơng có băng ADN vị trí tương ứng 420 bp  Nhận định kết quả: Mẫu dương tính xuất băng ADN tương ứng vị trí 420 bp tương tự chứng dương Chứng dương, chứng âm đạt tiêu chuẩn Xử lý mẫu, dụng cụ, chất thải:  Thạch, vật liệu qua sử dụng phải cho vào túi chuyên dùng, hấp tiệt trùng autoclave  Dung dịch TAE ethidium bromide phải chứa bể chứa chuyên dùng để xử lý trước thải hệ thống nước thải chung  Phun cồn NaClO 100 ppm tiệt trùng xung quanh bề mặt làm việc sau bật đèn tím phòng 30 phút Tài liệu tham khảo: Qiamp Viral RNA Mini Handbook Qiagen OneStep RT-PCR Kit Handbook ... Nghiên cứu số đặc đi m phân tử đoạn gen M vi rút Hanta chuột số đi m Hà Nội từ 2015 – 2018 với m c tiêu sau: 1: M tả số đặc đi m phân tử gen M vi rút Hanta chuột thu thập số đi m Hà Nội 201 5- 2018. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ HUYỀN MY NGHI£N CứU M T Số ĐặC ĐI M PHÂN Tử đoạn GEN M CủA VI RúT HANTA TRÊN CHUộT TạI số đi m ë Hµ NéI Tõ N M 2015 - 2018 Chuyên ngành: Vi sinh y học M số : 60720115... https://www.researchgate.net/figure/282867889_fig2_Figure-2-Structureand-genome-organization-of-hantaviruses-The-hantavirus-virion-o)  Cấu trúc đoạn gen M Đoạn gen M vi rút Hanta g m vùng bao g m vùng 5’ khơng m hóa (5’ NCR), khung đọc m (ORF)