Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm

Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬT TRONG DƯỢC PHẨM Trương Ngọc Lan**, Nguyễn Thanh Thuận*, Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát Đơng* TĨM TẮT Mở đầu: Dược phẩm cần phải đạt tiêu chuẩn an tồn cao để khơng gây nguy hiểm cho người bệnh Một yếu tố nguy nhiễm vi sinh vật Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháp truyền thống từ đến ngày Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn dược phẩm Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật mẫu dược phẩm Phương pháp: Dựa phương pháp PCR, tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu, độ đặc hiệu độ nhạy cặp cặp mồi chung mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát loại vi sinh vật Sau kiểm tra thơng số tối ưu phản ứng RT-PCR Kết quả: Xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ cho cặp mồi Các cặp mồi đạt độ đặc hiệu để phát vi khuẩn, vi nấm vi sinh vật thị có giới hạn phát tốt Phương pháp RT-PCR rút ngắn thời gian kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng lần so với phương pháp Dược điển Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp để xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn dược phẩm Từ khóa: Kỹ thuật PCR, thử giới hạn vi sinh vật, kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp nhanh ABSTRACT APPLICATION OF RT-PCR TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF MICROBIAL LIMIT TEST OF PHARMACEUTICALS Truong Ngoc Lan, Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 202 - 210 Background: Microbial contamination in pharmaceutical products is one of the major causes of health risk to consumers Vietnamese Pharmacopoeia microbial limit test requires - days RT-PCR detection of microorganisms is a rapid, sensitive, and infallible method Objectives: To develop a convenient, reproducible and rapid test for microbial limit of pharmaceutical products Methods: Base on PCR method, annealing temperature, Mg2+ concentration, sensitivity and specificity of the universal and specific primers, proliferating time for microorganisms were optimized After that, the optimal conditions were applied to RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) assay Results: The annealing temperature, Mg2+ concentration of primer pairs were determined All primers are specific to detect bacteria, fungi and indicative microorganisms and have good detection limits RT-PCR analysis can be used for microbial limit determination times faster than the standard method Conclusions: RT-PCR is a suitable method for rapid and reliable detection of microbes pharmaceutical samples Keywords: PCR, microbial limit test, pharmaceutical quality control, rapid method *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Cát Đông 202 ** Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Bình Dương ĐT: 08 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Dược phẩm chế phẩm dùng để phòng Nghiên cứu Y học nay, kỹ thuật RT-PCR phổ biến nước ta ngày ứng dụng nhiều chẩn điều trị bệnh, cần phải đạt tiêu chuẩn đốn, xét nghiệm an tồn cao để khơng gây nguy hiểm cho người VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP bệnh Một yếu tố nguy nhiễm Các chủng vi sinh vật vi sinh vật, vi sinh vật gây Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm bệnh trực tiếp gián tiếp làm hỏng dạng bào chủng chuẩn ATCC chủng phân chế, làm cho chế phẩm không đặc điểm lập giữ Bộ môn Vi sinh - Ký sinh: cảm quan mà tác dụng điều trị Dược Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus điển Việt Nam quy định dạng thuốc dùng ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC đường uống không chứa chất bảo quản phải đạt 27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacalis giới hạn độ nhiễm khuẩn, việc xác định ATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillus giới hạn vi sinh vật thực theo phương cereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicans pháp tăng sinh, nuôi cấy môi trường ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 chọn lọc , nhiên thời gian để có kết Monascus purpureus (1) mẫu kiểm nghiệm từ đến ngày, mẫu không đạt phải lặp lại lần nữa, chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh Phương pháp tốn thời gian, kết phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật viên kiểm nghiệm, thuốc lưu lại kho lâu hơn, gây tốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành Trong hầu hết tuổi thọ thuốc dùng đường uống ngắn (12 đến 24 tháng) Gần đây, nước tiên tiến giới bắt đầu áp dụng phương pháp xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trình kiểm tra để xuất xưởng Các phương pháp có độ nhạy cao chứng minh tương đương với phương pháp truyền thống, với phương pháp giúp tự động hóa phần cho kết khách quan Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh xác, ứng dụng để xác định số lượng vi sinh vật sở vi sinh vật mang số biết trước khuôn mẫu Hiện Chuyên Đề Dược Khoa Tách chiết ADN, ARN ADN vi khuẩn tách chiết phương pháp phenol–chloroform Để phá vỡ tế bào, dùng đệm ly giải BLB (EDTA 50mM, NaCl 0,1M, pH 7,5) lysozyme vi khuẩn Gram dương dùng SDS 10% vi khuẩn Gram âm ADN nấm men chiết theo phương pháp Harju(4), ADN nấm mốc chiết theo phương pháp Vanittanakom(2,8) ARN vi sinh vật tách chiết tinh kit SV total RNA isolation system (Promega) đo OD600 dịch nuôi cấy đạt 0,6-1 Phản ứng PCR Mồi sử dụng phản ứng PCR chọn theo hai hướng: mồi đa phát tất vi sinh vật mồi chuyên biệt phát nhóm vi sinh vật thị như: E coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp., P aeruginosa Trình tự mồi liệt kê Bảng 203 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Các phản ứng PCR thực riêng rẽ để thăm dò thơng số khác từ – mM tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+ Chu trình phản ứng chu kỳ: 95oC PCR thực với tổng thể tích 25 μl phút; 35 chu kỳ: 95oC phút, thời gian gắn gồm Taq mồi phút với nhiệt độ khác cho dNTP loại mồi, 72oC phút cuối 1μM/mồi polymerase (Sigma (Promega); Proligo); 0,25 1U mM (BioLabs); 1X PCR buffer (Promega) Mg2+ chu kỳ 72oC phút Bảng Mồi sử dụng phản ứng PCR Vi sinh vật thị- gen đích Mồi Trình tự Sản phẩm (bp) Vi khuẩn-16S rADN [8] p8FPL-UF AGTTTGATCCTGGCTCAG 798 p806R-UR GGACTACCAGGGTATCTAAT U340-UF TCCTACGGGAGGCAGCAGT U806-UR GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT RRF1-UF ATCTAAATCCCTTAACGAGGAACA RRH1-UR CCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTT SSU-0817-UF TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA SSU196-UR TCTGGACCTGGTGAGTTTCC UAL 754 AAAACGGCAAAGAAAAAGCAG UAR 900 ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG Pseud-oprLR ATGGAAATGCTGAAATTCGGC Pseud-oprLR CTTCTTCAGCTCGACGCGACG Sal-Malo2-F GTATTGTTGATTAATGAGATCCG Sal-Malo2-Ra ATATTACGCACGGAAACACGTT STAIb-F GGAATAACGTGACATATTGTA STAIib-R TTCACTCGGTTTTGCTTGG Vi khuẩn-16S rADN [6] Vi nấm-18S rADN [8] Vi nấm- 18S rADN [3] E coli-uidA [7] P aeruginosa- oprL [5] Salmonella- invA [6] Sta sp-16S rADN [9] Phản ứng RT-PCR 466 631 422 147 504 373 300 fg 10 µl để khảo sát độ nhạy phản Phản ứng PCR ngược (reverse transcriptase ứng PCR Cách quy đổi số sau với PCR - RT-PCR) thực với kit Ready-To- nồng độ ADN sau: 100 fg ADN tương Go RT-PCR Beads (GE Healthcare) mồi đương với 22 gen vi khuẩn 10 ARN chuyển thành cADN gen vi nấm Các thông số phản ứng nhiệt độ 42oC 15 phút sau chu kỳ thiết lập Độ nhạy xác phản ứng tiến hành PCR định số lượng ADN đích thấp Độ nhạy phản ứng PCR Dung dịch ADN đích biết số pha lỗng liên tiếp cho 10 µl khn mẫu có chứa 2x107 đến cho sản phẩm thực phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng Thời gian tăng sinh để phát vi sinh vật vi khuẩn 107 đến vi Khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết giúp nấm tương ứng với nồng độ ADN đích từ 100 làm giàu số lượng vi sinh vật mẫu lên đến ng, 10 ng, ng, 100 pg, 10 pg, pg, 100 fg, 10 fg ngưỡng phát phương pháp PCR Để 204 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học khảo sát thời gian tăng sinh phát vi sinh vật KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN mẫu dược phẩm, tiến hành gây nhiễm Chiết tách ADN, ARN vi khuẩn thị, nấm men, nấm mốc vào thuốc Sản phẩm ADN, ARN chiết có tỉ lệ tiêm lidocain 2% với lượng vi sinh vật gây OD260/OD280 nằm khoảng từ 1,8 đến 2, đảm nhiễm từ 100 - 105 CFU/ml Sau đó, bảo hàm lượng độ tinh để thực mẫu thuốc tiêm gây nhiễm tăng phản ứng PCR Khi chiết ADN, ARN sinh mơi trường thích hợp với đối Aspergilus niger khơng loại sắc tố đen tượng (môi trường TSB vi khuẩn, PDP phần dịch nổi, nhiên, kết nấm mốc YPD nấm men) Sau không ảnh hưởng thực phản ứng PCR tăng sinh, tiến hành chiết ADN mốc RT-PCR thời gian 6, 12 (đối với vi khuẩn nấm men) 24, 48 60 (đối với nấm mốc) thực phản ứng PCR theo điều kiện tối ưu loại vi sinh vật Phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi với nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+ theo tài liệu tham khảo Đối với cặp mồi có nhiệt độ Phát sản phẩm PCR nồng độ Mg2+ phù hợp với tài liệu cho sản Sản phẩm PCR chạy điện di gel phẩm PCR rõ kích thước agarose 1% điện 120V 20 phút, đọc không tiến hành khảo sát lại Với cặp mồi kết phương pháp nhuộm ethidium không cho sản phẩm PCR vạch sản phẩm bromide Sản phẩm điện di chụp hình khơng rõ chúng tơi tiến hành khảo sát lại nhiệt máy Dolphin (Wealtec Corp.) độ gắn mồi nồng độ Mg2+ tối ưu Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi Bảng Bảng Nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+ tối ưu Vi sinh vật Mồi Vi khuẩn Vi khuẩn Vi nấm Vi nấm P aeruginosa Salmonella S aureus E coli U340-UF/U806-UR P8FPL-UF/p806R-UR RRF1-UF/RRH1-UF SSU-0817-UF/SSU-1196-UR Pseud-oprLF/Pseud-oprLR Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra STAIb-F/STAIib-R UAL 754/UAR 900 Nhiệt độ bắt cặp Nồng độ Mg2+ Theo tài liệu Thực nghiệm Theo tài liệu Thực nghiệm 58 58 2 55 55 2 56 53 2,5 2,5 56 52 2,5 2,5 58 64 1,5 55 55 1,5 3,5 46 50 3 (*) 50 1,5 (*): tài liệu khơng đề cập Tính đặc hiệu cặp mồi Các vi sinh vật gồm: Bacillus subtilis (Bs), Bacillus cereus (Bc), E coli (Ec), Klebsiella (Kle), Pseudomonas aeruginosa (Pse), Salmonella sp (Sal), Shigella (Shi), Staphylococcus aureus (St), Streptococcus feacalis (Stre), Candida albicans (Ca), Aspergillus (As), Monascus purpureus (Mo) Chuyên Đề Dược Khoa Mồi chung để phát vi khuẩn, vi nấm Cặp mồi p8FPL-UF/p806R-UR cho vạch sản phẩm có kích thước 798 bp, cặp mồi U340UF/U806-UR có sản phẩm PCR có kích thước 466 bp vi khuẩn mà khơng có sản phẩm PCR vi nấm thử nghiệm Cặp mồi 205 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 SSU-0817-UF/SSU-1196-UR cho vạch sản phẩm mồi Pseud-oprLF/Pseud-oprLR cho vạch sản có kích thước 422 bp, tương tự, cặp mồi RRF1- phẩm có kích thước 504 bp P aeruginosa, UF/RRH1-UF có sản phẩm PCR kích cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-R cho sản phẩm thước 631 bp vi nấm mà khơng xuất có kích thước 373 bp Salmonella sp, UAL- vạch sản phẩm vi khuẩn thử nghiệm tính 754/UAR-900 cho sản phẩm có kích thước 147 đặc hiệu Vậy cặp mồi chung khảo sát bp E coli STAIb-F/STAIib-R cho sản đặc hiệu để phát vi khuẩn vi nấm phẩm có kích thước 300 bp S aureus (Hình 1) khơng cho sản phẩm PCR vi khuẩn, vi Mồi phát vi sinh vật thị nấm chứng âm Như cặp mồi chọn Phản ứng PCR cho sản phẩm vi đạt yêu cầu tính đặc hiệu PCR (Hình 2) khuẩn thị tương ứng với cặp mồi: cặp M As Ca Mo Bs Ec Kle Ps Sa Shi Sta Stre 422bp M As Ca Mo Bs Ec Kle Ps Sal Shi Sta Stre 631bpp SSU-0817-UF/SSU-1196-UR RRF1-UF/RRH1-UF M Bs Ec Kle Ps Sa Bc Sta Str Bc Shi Ca Mo As M Bs Ec Kle Ps Sa Sh Sta Str Bc Shi As Ca Mo 798bp 466bp p8FPL-UF/p806R-UR U340-UF/U806-UR Hình Tính đặc hiệu mồi chung phát vi nấm vi khuẩn 206 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 M Ps Bs Ec Kl Sal Sh Sta Stre Ca As Mo 504bp Nghiên cứu Y học M Sal Bs Ec Kl Ps Shi Sta Stre Ca As Mo 373bp Pseud-oprLF/Pseud-oprLR Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra M Ec Bs Kl Ps Sal Sh St Stre Ca As Mo M St Bs Ec Kl Ps Sal Sh Stre Ca As Mo 300bp 147bp UAL754/UAR900 STAIb-F/STAIibR Hình Độ đặc hiệu vi sinh vật thị Độ nhạy phản ứng PCR Dãy nồng độ ADN, số gen vi khuẩn vi nấm Bảng Kết PCR cho thấy hai cặp mồi chung phát vi khuẩn có giới hạn phát tương đương 10fg ADN tương ứng với vi khuẩn Đối với hai cặp mồi phát vi nấm cặp mồi SSU-0817- UF/SSU-1196-UR có giới hạn phát 100fg ADN tương ứng với 10 vi nấm, nhạy cặp mồi RRF1-UF/RRH1-UR có giới hạn phát 1pg ADN tương đương 100 (Hình 3) Vậy cặp mồi SSU-0817UF/SSU-1196-UR thích hợp cho thử nghiệm vi nấm mẫu dược phẩm Bảng Nồng độ ADN số gen Giếng ADN Số vi khuẩn Số vi nấm 100ng 2.10 10 Chuyên Đề Dược Khoa 10ng 2.106 106 1ng 2.105 105 100pg 2.104 104 10pg 2.103 103 1pg 2.102 102 100fg 2.10 10 10fg 1fg 0,2 0,1 10 0 207 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học M 10 M 10 631bp 422bp SSU-0817-UF/SSU-1196-UR M RRF1-UF/RRH1-UF 10 M 10 798bp 466bp U340-UF/U806-UR p8FPL-UF/p806R-UR Hình Giới hạn phát mồi chung phát vi khuẩn vi nấm M M 10 10 504bp 373bp Pseud-oprLF/Pseud-oprLR M Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra 10 M 10 300bp 147bp UAL 754/UAR-900 STAIb-F/STAIib-R Hình Giới hạn phát cặp mồi vi sinh vật thị 208 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-F phát Salmonella có giới hạn phát nồng độ ADN 10fg tương đương sao, cặp mồi PseudoprLF/Pseud-oprLR phát P aeruginosa có giới hạn phát 2pg tương dương với 200 sao, cặp mồi UAL 754/UAR900 phát E coli có giới hạn phát 20pg tương dương với 2.103 cặp mồi STAIb-F/STAIib-R phát S aureus có giới hạn phát 200pg tương dương với 2.104 (Hình 3) Như vậy, mồi phát Salmonella, P aeruginosa, vi khuẩn, vi nấm cho kết tốt, mồi E coli, S aureus có giới hạn phát cao: 2.103, 2.104 tế bào/phản ứng So với tiêu chuẩn Dược điển yêu cầu phát vi khuẩn mẫu cặp mồi khơng đạt Tuy nhiên, tiến hành thực nghiệm mẫu thuốc, việc chiết hồn tồn ADN mẫu khơng thể đạt được, thơng thường sử dụng lượng nhỏ đem tăng sinh trước chiết ADN Sau tăng sinh lượng vi sinh vật đạt ngưỡng giới hạn tất cặp mồi M M M 798bp Thời gian tăng sinh để phát vi sinh vật Kết thử nghiệm thời gian tăng sinh để phát vi sinh vật cho thấy: E coli, P aeruginosa thời gian phát giờ, lượng vi khuẩn gây nhiễm 100 CFU; Salmonella, S aureus lượng vi khuẩn gây nhiễm 100 Còn với thử nghiệm vơ khuẩn: thời gian tăng sinh vi khuẩn với lượng gây nhiễm 100, nấm men thời gian tăng sinh 12 với lượng gây nhiễm 100, nấm mốc thời gian tăng sinh 60 với gây nhiễm 101 Phản ứng RT-PCR Dược điển quy định, việc kiểm nghiệm tiêu vi sinh mẫu dược phẩm dựa vi sinh vật sống, thử nghiệm phát dựa phương pháp RT-PCR, nghĩa tiến hành vi sinh vật sống ARN tồn tế bào sống Tuy nhiên sử dụng ARN không ổn định, số lượng ARN tế bào thay đổi tùy vào giai đoạn tế bào M Ec Ps Sal Sta 631bp 466bp Nghiên cứu Y học 422bp 504bp 373bp 300bp 147bp Hình Phản ứng RT-PCR mồi chung mồi đặc hiệu 1, 2: ARN vi khuẩn với mồi p8FPL-UF/ p806R-UR, U340-UF/ U806-UR; 3,4: ARN Candida Aspergillus với mồi RRF1-UF/ RRH1-UR; 5, 6: ARN Candida Aspergillus với mồi SSU-0817-UF/ SSU196-UR; Ec, Ps, Sal, Sta: ARN vi sinh vật thị với mồi đặc hiệu Do tối ưu thông số cặp mồi sử dụng, khảo sát giới hạn phát hiện, tính đặc hiệu mồi, thời gian tăng sinh để phát vi sinh vật tiến hành khuôn mẫu ADN kiểm tra lại thông số với khuôn mẫu ARN Kết cho thấy thông số phản ứng PCR Chuyên Đề Dược Khoa thích hợp áp dụng lên phản ứng RT-PCR với khuôn mẫu ARN KẾT LUẬN Từ kết trên, nhận thấy kỹ thuật RT-PCR để phát vi sinh vật thị thử vơ khuẩn dược phẩm có thời gian thực nhanh khoảng lần so với phương 209 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 pháp Dược điển Ngoài ra, yêu cầu độ đặc hiệu độ nhạy đạt cặp mồi khảo sát Như vậy, kỹ thuật PCR để xác định giới hạn vi sinh vật dược phẩm hoàn toàn khả thi TÀI LIỆU THAM KHẢO 210 Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam Phụ luc 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn PL258- PL269 Hà Nội Bayardelle P., Zafarullah M (2002) Development of oligonucleotide primers for the specific PCR-based detection of the most frequent Enterobacteriaceae species ADN using wec gene templates Can J Microbiol 48(2): 113-22 Borneman J., Hartin R J (2000) PCR primers that amplify fungal rADN genes from environmental samples Appl Environ Microbiol 66(10): 4356-60 Harju S., Fedosyuk H., et al (2004) Rapid isolation of yeast genomic ADN: Bust n' Grab BMC Biotechnol 4: 8 Jaffe R I., Lane J D., et al (2001) Real-time identification of Pseudomonas aeruginosa direct from clinical samples using a rapid extraction method and polymerase chain reaction (PCR) J Clin Lab Anal 15(3): 131-7 McCabe K M., Zhang Y H., et al (1999) Bacterial species identification after ADN amplification with a universal primer pair Mol Genet Metab 66(3): 205-11 Tsai Y L., Palmer C J., et al (1993) Detection of Escherichia coli in sewage and sludge by polymerase chain reaction Appl Environ Microbiol 59(2): 353-7 Vanittanakom N., Vanittanakom P., et al (2002) Rapid identification of Penicillium marneffei by PCR-based detection of specific sequences on the rADN gene J Clin Microbiol 40(5): 1739-42 Voytenko A V., Kanbar T., et al (2006) Identification of Staphylococcus hyicus by polymerase chain reaction mediated amplification of species specific sequences of superoxide dismutase A encoding gene sodA Vet Microbiol 116(1-3): 211-6 Chuyên Đề Dược Khoa ... quan Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh xác, ứng dụng để xác định số lượng vi sinh vật sở vi sinh vật mang số biết trước khuôn mẫu Hiện Chuyên Đề Dược Khoa Tách chiết ADN, ARN ADN vi khuẩn... nhiễm 101 Phản ứng RT-PCR Dược điển quy định, vi c kiểm nghiệm tiêu vi sinh mẫu dược phẩm dựa vi sinh vật sống, thử nghiệm phát dựa phương pháp RT-PCR, nghĩa tiến hành vi sinh vật sống ARN tồn... để không gây nguy hiểm cho người VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP bệnh Một yếu tố nguy nhiễm Các chủng vi sinh vật vi sinh vật, vi sinh vật gây Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm bệnh trực tiếp gián tiếp