Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù hợp với giải trình tự gen.
Trang 1ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA
Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI
Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương
Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nay, các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta (FGB) quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình
tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25% Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù hợp với giải trình tự gen Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi.
Từ khoá: Nhồi máu cơ tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A
Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di
truyền, Trường Đại học Y Hà Nội
Email: lanhluong@gmail.com
Ngày nhận: 16/12/2016
Ngày được chấp thuận: 26/2/2017
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhồi máu cơ tim được xếp thứ nhất trong
số 7 nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu trên
thế giới Ước tính ở Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu
bệnh nhân nhập viện mỗi năm vì nhồi máu cơ
tim cấp và khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh
nhân tử vong hàng năm vì nhồi máu cơ tim
cấp [1] Tại Việt Nam, nhồi máu cơ tim cấp
đang có xu hướng gia tăng trong những năm
gần đây, tỷ lệ tử vong vẫn còn cao và đang là
vấn đề thời sự rất được quan tâm Năm 2003,
theo thống kê của Viện Tim mạch Quốc gia
Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện vì nhồi
máu cơ tim cấp là 4,2%, đến năm 2007 con số
này là 9,1% Ở Bệnh viện Chợ Rẫy, năm 2010
có tới 7.421 trường hợp nhập viện vì đau thắt
ngực, 1.538 ca phải nhập viện và điều trị vì
hội chứng vành cấp, 267 trường hợp tử vong
[2; 3]
Theo các nghiên cứu, đa phần người cao tuổi mắc phải căn bệnh này, tuy nhiên nhiều trường hợp nhồi máu cơ tim xuất hiện ở người < 60 tuổi và thậm chí ở lứa tuổi trẻ hơn,
< 30 tuổi, một số dẫn đến tử vong Các nghiên cứu gần đây trên thế giới đề cập đến mối liên quan giữa nhồi máu cơ tim với biến đổi vật chất di truyền ở cấp phân tử Các nghiên cứu cho rằng các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi hoặc có tính gia đình, không rõ các nguy
cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến
- 455G/A của gen Fibrinogen Beta quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7] Fibrinogen
là 1 protein được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypep-tide (chuỗi α, β và γ), tham gia quá trình đông máu và đóng một vai trò quan trọng trong quá trình hình thành huyết khối Đột biến -455G/A trên gen có thể gây tác động mạnh nhất lên tốc độ tổng hợp của toàn phân tử fibrinogen,
từ đó làm tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim [8]
Để phát hiện đột biến điểm -455G/A trên gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học phân tử thường được nghĩ tới đầu tiên là giải trình tự gen, nhưng không phải cơ sở nghiên
Trang 2cứu và ứng dụng nào cũng có thể làm được
bởi yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen
và chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen khá
tốn kém Realtime PCR là kỹ thuật khuếch đại
gen, có nhiều ưu điểm so với PCR truyền
thống, được ứng dụng ngày càng rộng rãi
trong di truyền học, công nghệ sinh học cũng
như nhiều lĩnh vực khác Tuy nhiên, ở Việt
Nam hiện nay, chúng tôi chưa thấy tác giả nào
nghiên cứu và ứng dụng kĩ thuật này trong
việc phát hiện đột biến -455G/A nhằm góp
phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim
Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định
đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta
bằng kỹ thuật Realtime PCR.
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 Đối tượng
- 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi
được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai
- Thời gian: từ tháng 1/2013 đến tháng 1/2016
- Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà Nội
2 Phương pháp: nghiên cứu mô tả.
Quy trình nghiên cứu
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi và chiết tách DNA tổng số DNA được kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng bằng máy đo quang phổ Nano - Drop 2000
- Thực hiện kỹ thuật Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A Gen Fibrinogen Beta được thiết kế nhân lên bằng kỹ thuật PCR trên vùng promoter tại vị trí nucleotide xác định theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế (GenBank, M 64983.1)
Bảng 1 Primer - Probe phát hiện gen FGB
Mồi (FGBf3m- FGBr4m)
F -AATAACTTCCCATCATTTTGTCCAATTC
730
R -AGTCGTTGACACCTTGGGACTTAACTTG Đoạn dò
FGB1m (phát hiện gen không đột biến) FGB2m (phát hiện gen đột biến)
- Phản ứng Realtime PCR được tiến hành
6 phản ứng:
+ Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe
không đột biến
+ Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe
đột biến
+ Chứng đột biến
+ Chứng không đột biến
+ Chứng âm (nước cất) với phản ứng có
probe không đột biến
+ Chứng âm (nước cất) với phản ứng có probe đột biến
- Thể tích PCR: 50µl
- Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta (PCR) bằng hệ thống luân nhiệt của máy Realtime PCR (Bio-Rad CFX96)
- Chu trình luân nhiệt:
+ Làm nóng hỗn hợp ở 40°C trong 10 phút, 95°C trong 5 phút
* FGBr4m: Mồi ngược (Fibrinogen Beta reverse); FGBf3m: mồi xuôi (Fibrinogen Beta forward).
Trang 3+ 39 chu kỳ nhiệt: 95°C trong 15 giây/60°C
trong 1 phút/72°C trong 30 giây
So sánh kết quả Real time PCR với giải
trình tự gen FGB
Gen Fibrinogen Beta được nhân lên bằng
kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m
-FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5
phút/ 60oC - 30 giây/72oC - 30 giây) Thể tích
phản ứng 50 µl, bao gồm các thành phần:
DNA mẫu, mồi, và các thành phần cho phản
ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP,
MgCl2, dH2O) Sản phẩm PCR được tinh sạch
bằng kit PureLinkTM (Invitrogen) Giải trình tự
gen Fibrinogen Beta bằng hệ thống ABI
se-quencer được thực hiện trên máy Applied
Bio-systems 3.100
Đối chiếu kết quả phát hiện đột biến
-455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ
thuật realtime PCR với kết quả giải trình tự
Kết quả phù hợp khi các bệnh nhân có kết
quả Realtime PCR và giải trình tự tương ứng
với nhau
Phân tích và xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu gen Fibrinogen Beta
trên máy Realtime PCR được phân tích bằng
phần mềm CFX Manager™Software
Kết quả giải trình tự gen: các thông số và chất lượng đỉnh được thu thập, kiểm định bằng các phần mềm ABI Data Collection v2.0
và Sequencing Analysis Sotwave v5.3
Trình tự đoạn promoter của gen Fibrinogen Beta của mẫu bệnh và chứng người Việt Nam được so sánh với trình tự tham chiếu công bố trên GenBank thông qua sử dụng phần mềm phân tích Chromas Lite v2.1.1 và Seaview để xác định đột biến điểm
Các số liệu được tổng hợp và tính toán bằng Word và Excel 2010
3 Đạo đức nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ
về mục đích nghiên cứu, được cung cấp thông tin và bệnh nhân đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được giữ kín bí mật cá nhân và được phản hồi kết quả nghiên cứu
III KẾT QUẢ
1 Thông tin mẫu nghiên cứu
Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, trong đó có 14 nam và 6 nữ Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân là từ 18 - 56 tuổi
Bảng 2 Tuổi trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu
Giới Tuổi trung bình chung của các bệnh nhân ( ± SD)
Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nghiên cứu là 39,00 ± 11,15 tuổi Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nam (40,86 ± 12,25 tuổi) lớn hơn bệnh nhân nữ (34,83 ± 9,13 tuổi)
Trang 42 Phát hiện đột biến -455G/A bằng kỹ thuật Realtime PCR
2.1 Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A
Bảng 3 Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A
Giới n Số bệnh nhân có đột biến gen Tỷ lệ đột biến/ giới (%)
Chỉ số
*: Không khác biệt so với nam (p > 0,05).
Có 5 trên tổng số 20 bệnh nhân phát hiện mang đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, chiếm 25%, trong đó có 4 nam (80%) và 1 nữ (20%)
Tỷ lệ phát hiện đột biến gen ở nam và nữ có sự khác nhau, tuy nhiên không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05)
2.2 Hình ảnh Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A
Hình 1 Kết quả Realtime PCR và giải trình tự ở mẫu không có đột biến và mẫu đột biến
-455G (không đột biến); -455A (đột biến).
Chứng hoặc mẫu không đột biến Chu kì ngưỡng (Ct)
Trang 52.3 Kiểu gen đột biến -455G/A
Bảng 4 Kiểu gen đột biến -455G/A
Trong số 5 bệnh nhân phát hiện có đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đều là đồng hợp tử, tức cả hai alen của gen đều bị đột biến, không có trường hợp nào kiểu gen là dị hợp tử (chỉ có 1 alen bị đột biến)
2.4 Đối chiếu kết quả Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A
So sánh kết quả phân tích đột biến -455G/A của gen FGB ở 20 bệnh nhân bằng kỹ thuật Real-time PCR và kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả như sau:
Bảng 5 Sự phù hợp giữa kết quả Realtime PCR
và giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A
Bệnh nhân
nhồi máu cơ tim
Phân tích bằng kỹ thuật Realtime PCR (1)
Phân tích bằng kỹ thuật giải trình tự (2)
Tỷ lệ phù hợp (1)/(2)
Kết quả tìm đột biến của 2 phương pháp Realtime PCR và giải trình tự ở các bệnh nhân là như nhau, tỷ lệ phù hợp là 100%
IV BÀN LUẬN
Sau khi hoàn chỉnh thành công kỹ thuật
Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A
của gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu này
bước đầu ghi nhận và xử lý các số liệu về đột
biến -455G/A ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim
trẻ tuổi Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, tuy
nhiên đây cũng là mở đầu cho các nghiên cứu
tiếp theo chi tiết hơn về đột biến này
Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen
Fibrinogen Beta ở các bệnh nhân nhồi máu cơ
tim trẻ tuổi trong nghiên cứu này là 25% Theo một nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang đột biến -455G/A trong nhóm bệnh nhân xơ vữa động mạch là 25,8%, cao hơn so với tỉ lệ 15,2% ở nhóm chứng không mắc bệnh [9] Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến -455G/A ở 885 nam giới tuổi dưới 70, có tiền
sử cơn đau thắt ngực là 21%, còn một nghiên cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến này là 35,3% tính trên 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10; 11] Như vậy có thể thấy, tỉ lệ phát hiện đột
Trang 6biến trong nghiên cứu của chúng tôi khá
tương đồng so với các tác giả khác trên thế
giới Ngoài ra, một nghiên cứu năm 1999 cho
thấy đột biến -455G/A làm tăng 5,4% lượng
fibrinogen, kết hợp với 1 đột biến khác cũng
trên gen Fibrinogen Beta là -854G/A thì tỉ lệ
này tăng lên xấp xỉ 11%, hay nghiên cứu năm
1998 cũng kết luận kiểu gen -455AA có nồng
độ fibrinogen trung bình là 3,9 g/L so với trung
bình 3,1 g/L của kiểu gen -455GG [10; 12]
Điều này cho thấy đột biến -455G/A đóng vai
trò quan trong trong sự gia tăng nồng độ
fi-brinogen, chứng tỏ tầm quan trọng của nghiên
cứu hoàn chỉnh kỹ thuật Realtime PCR để
phát hiện đột biến này
75% các trường hợp còn lại không phát
hiện có đột biến -455G/A có thể bệnh nhân
mắc các đột biến khác ngoài đột biến trên
Theo một thống kê, các bệnh nhân nhồi máu
cơ tim do đột biến gen Fibrinogen Beta, ngoài
đột biến -455G/A hay gặp còn có thể xuất hiện
các đột biến 148C/T, 249C/T, 854G/A,
-993C/T [12] Điều này sẽ giúp mở ra những
hướng mới cho các nghiên cứu sau này
Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có
sự khác nhau: 28,57% ở nam và 16,67% ở
nữ, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê,
(p > 0,05) 100% các trường hợp đột biến đều
có kiểu gen đồng hợp tử, điều này cũng phù
hợp với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc
thể thường của gen, khi ở trạng thái đồng hợp
tử mới biểu hiện bệnh
V KẾT LUẬN
Đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime
PCR để phát hiện đột biến -455G/A trên gen
Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim
cấp trẻ tuổi, các kết quả phân tích phù hợp với
kết quả giải trình tự gen
Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25% Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57%
và 16,67%, tuy nhiên không có ý nghĩa thống
kê, (p > 0,05)
Lời cảm ơn
Nghiên cứu thực hiện thành công nhờ sự
hỗ trợ của Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Tim mạch Việt Nam và Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Longo D (2012) Epidemiology of
Car-diovascular Disease, Harrisons Principles of
internal Medicine, McGraw-Hill United States.
2 Ngô Quý Châu (2012) Bệnh học Nội
khoa 1 Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 185.
3 Nguyễn Thị Hồng Huệ (2013) Nghiên
cứu giá trị NT-PRO-BNP trong nhồi máu cơ
tim cấp không ST chênh lên Tạp chí Y dược
lâm sàng, 108, 21.
4 Brown E T., Fuller G M (1998)
Detec-tion of a complex that associates with the Bβ
fibrinogen G− 455-A polymorphism Blood, 92
(9), 3286 - 3293.
5 Mika M (2003) Fibrinogen gene
pro-moter− 455 A allele as a risk factor for lacunar
stroke Stroke, 34(4), 886 - 891.
6 Sevimli S (2014) Impact of-455G/A
Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene on Platelet Aggregation in Patients With Acute
Coronary Syndrome Clinical and Applied
Thrombosis/Hemostasis, 20(3), 238 - 243.
7 Gu L (2014) Influence of the
β-fibrinogen-455G/A polymorphism on develop-ment of ischemic stroke and coronary heart
disease Thromb Res, 133(6), 993 - 1005.
8 Wilhelmsen L (1984) Fibrinogen as a
risk factor for stroke and myocardial infarction
Trang 7New England journal of medicine, 311(8), 501
- 505
9 Sun H (2004) [Relationship between
fibrinogen B beta gene FGB-455G/A
polymor-phism and atherosclerotic cerebral infarction]
Chinese journal of medical genetics, 21(4),
382 - 385
10 de Maat M P (1998) -455G/A
Poly-morphism of the β-Fibrinogen Gene is
Associ-ated With the Progression of Coronary
Athero-sclerosis in Symptomatic Men Proposed Role
for an Acute-Phase Reaction Pattern of
Fibrinogen Arteriosclerosis, thrombosis and
vascular biology, 18(2), 265 - 271.
11 Mika M (2014) Βeta-fibrinogen gene
promoter A− 455 allele associated with poor longterm survival among 55 - 71 years old Caucasian women in Finnish stroke cohort
BMC neurology, 14(1), 1.
12 Van’t Hooft F M (1999) Two
com-mon, functional polymorphisms in the pro-moter region of the β-fibrinogen gene contrib-ute to regulation of plasma fibrinogen
concen-tration Arteriosclerosis, thrombosis and
vas-cular biology, 19(12), 3063 - 3070.
Summary APPLICATIONS OF REALTIME PCR TO DETECT -455G/A IN
FIBRINOGEN BETA (FGB) GENE IN YOUNG PATIENTS
WITH MYOCARDIAL INFARCTION
Myocardial infarction in younger individuals or familial myocardial infarction of unknown etiol-ogy may be related to genetic mutations, including mutations common -455G/A Fibrinogen Beta gene regulations fibrinogen chain synthesis Mutations -455G/A of Fibrinogen Beta gene identified
by using Real - time PCR is compared with sequencing results Our study was conducted on 20 patients under 60 years old with acute myocardial infarction admitted in the Vietnam National Heart Institute The mutation detection rates of -455G/A in the Fibrinogen Beta gene was 25% Mutation detection rate in male and female were 28.57% and 16.67% respectively These results fit with the sequencing results Researchers have successfully applied Real-time PCR techniques
to detect mutations 455G/A in the Fibrinogen Beta gene in younger patients with acute myocardial infarction
Keywords: Acute myocardial infarction, FGB, -455G/A