Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù hợp với giải trình tự gen.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương Trường Đại học Y Hà Nội Ngày nay, trường hợp nhồi máu tim trẻ tuổi có tính gia đình, khơng rõ nguy mơi trường gây bệnh, liên quan đến đột biến gen, hay gặp đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta (FGB) quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình tự gen để phát đột biến -455G/A 20 bệnh nhân nhồi máu tim cấp < 60 tuổi chẩn đoán xác định nhồi máu tim cấp Viện Tim mạch Việt Nam Tỷ lệ phát đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta 25% Tỷ lệ phát đột biến nam nữ có khác nhau: 28,57% 16,67%, kết phù hợp với giải trình tự gen Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát đột biến 455G/A gen Fibrinogen Beta bệnh nhân nhồi máu tim cấp trẻ tuổi Từ khoá: Nhồi máu tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A I ĐẶT VẤN ĐỀ Theo nghiên cứu, đa phần người cao tuổi mắc phải bệnh này, nhiên nhiều Nhồi máu tim xếp thứ số nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu giới Ước tính Hoa Kỳ có khoảng triệu bệnh nhân nhập viện năm nhồi máu tim cấp khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh nhân tử vong hàng năm nhồi máu tim cấp [1] Tại Việt Nam, nhồi máu tim cấp có xu hướng gia tăng năm gần đây, tỷ lệ tử vong cao vấn đề thời quan tâm Năm 2003, theo thống kê Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện nhồi máu tim cấp 4,2%, đến năm 2007 số 9,1% Ở Bệnh viện Chợ Rẫy, năm 2010 có tới 7.421 trường hợp nhập viện đau thắt ngực, 1.538 ca phải nhập viện điều trị hội chứng vành cấp, 267 trường hợp tử vong [2; 3] trường hợp nhồi máu tim xuất người < 60 tuổi chí lứa tuổi trẻ hơn, < 30 tuổi, số dẫn đến tử vong Các nghiên cứu gần giới đề cập đến mối liên quan nhồi máu tim với biến đổi vật chất di truyền cấp phân tử Các nghiên cứu cho trường hợp nhồi máu tim trẻ tuổi có tính gia đình, khơng rõ nguy mơi trường gây bệnh, liên quan đến đột biến gen, hay gặp đột biến - 455G/A gen Fibrinogen Beta quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7] Fibrinogen protein cấu tạo chuỗi polypeptide (chuỗi α, β γ), tham gia q trình đơng máu đóng vai trò quan trọng q trình hình thành huyết khối Đột biến -455G/A gen gây tác động mạnh lên tốc độ tổng hợp tồn phân tử fibrinogen, từ làm tăng nguy nhồi máu tim [8] Địa liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội Email: lanhluong@gmail.com Ngày nhận: 16/12/2016 Ngày chấp thuận: 26/2/2017 TCNCYH 106 (1) - 2017 Để phát đột biến điểm -455G/A gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học phân tử thường nghĩ tới giải trình tự gen, sở nghiên 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cứu ứng dụng làm được chẩn đốn xác định nhồi máu tim cấp yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen tốn Realtime PCR kỹ thuật khuếch đại gen, có nhiều ưu điểm so với PCR truyền thống, ứng dụng ngày rộng rãi - Thời gian: từ tháng 1/2013 đến tháng 1/2016 - Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà Nội di truyền học, công nghệ sinh học nhiều lĩnh vực khác Tuy nhiên, Việt Nam nay, chưa thấy tác giả nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật việc phát đột biến -455G/A nhằm góp phần tầm sốt sớm bệnh nhồi máu tim Nghiên cứu thực nhằm: xác định Phương pháp: nghiên cứu mơ tả Quy trình nghiên cứu - Lấy 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi chiết tách DNA tổng số DNA kiểm tra độ tinh hàm lượng máy đo quang phổ Nano - Drop 2000 đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta - Thực kỹ thuật Realtime PCR phát kỹ thuật Realtime PCR đột biến -455G/A Gen Fibrinogen Beta II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP thiết kế nhân lên kỹ thuật PCR vùng promoter vị trí nucleotide xác định Đối tượng theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế - 20 bệnh nhân nhồi máu tim cấp < 60 tuổi (GenBank, M 64983.1) Bảng Primer - Probe phát gen FGB Mồi – Đoạn dò Trình tự 5’ - 3’ Sản phẩm (bp) F -AATAACTTCCCATCATTTTGTCCAATTC Mồi (FGBf3m- FGBr4m) 730 R -AGTCGTTGACACCTTGGGACTTAACTTG FGB1m (phát gen khơng đột biến) Đoạn dò FGB2m (phát gen đột biến) * FGBr4m: Mồi ngược (Fibrinogen Beta reverse); FGBf3m: mồi xuôi (Fibrinogen Beta forward) - Phản ứng Realtime PCR tiến hành phản ứng: + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe khơng đột biến + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe đột biến + Chứng đột biến + Chứng không đột biến + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có probe khơng đột biến 18 + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có probe đột biến - Thể tích PCR: 50µl - Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta (PCR) hệ thống luân nhiệt máy Realtime PCR (Bio-Rad CFX96) - Chu trình ln nhiệt: + Làm nóng hỗn hợp 40°C 10 phút, 95°C phút TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC + 39 chu kỳ nhiệt: 95°C 15 giây/60°C phút/72°C 30 giây chất lượng đỉnh thu thập, kiểm định So sánh kết Real time PCR với giải phần mềm ABI Data Collection v2.0 Sequencing Analysis Sotwave v5.3 trình tự gen FGB Gen Fibrinogen Beta nhân lên kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95oC - phút/ 60oC - 30 giây/72oC - 30 giây) Thể tích phản ứng 50 µl, bao gồm thành phần: DNA mẫu, mồi, thành phần cho phản ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, dH2O) Sản phẩm PCR tinh kit PureLink Kết giải trình tự gen: thơng số TM (Invitrogen) Giải trình tự gen Fibrinogen Beta hệ thống ABI sequencer thực máy Applied Biosystems 3.100 Trình tự đoạn promoter gen Fibrinogen Beta mẫu bệnh chứng người Việt Nam so sánh với trình tự tham chiếu công bố GenBank thông qua sử dụng phần mềm phân tích Chromas Lite v2.1.1 Seaview để xác định đột biến điểm Các số liệu tổng hợp tính tốn Word Excel 2010 Đạo đức nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thơng báo rõ mục đích nghiên cứu, cung cấp thông tin bệnh nhân đồng ý tự nguyện Đối chiếu kết phát đột biến - tham gia nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu 455G/A gen Fibrinogen Beta kỹ giữ kín bí mật cá nhân phản thuật realtime PCR với kết giải trình tự hồi kết nghiên cứu Kết phù hợp bệnh nhân có kết Realtime PCR giải trình tự tương ứng với III KẾT QUẢ Thơng tin mẫu nghiên cứu Phân tích xử lý số liệu Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên Kết nghiên cứu gen Fibrinogen Beta cứu, có 14 nam nữ Độ tuổi máy Realtime PCR phân tích trung bình bệnh nhân từ 18 - 56 tuổi phần mềm CFX Manager™Software Bảng Tuổi trung bình bệnh nhân nghiên cứu Chỉ số Giới Tuổi trung bình chung bệnh nhân ( X ± SD) Nam 40,86 ± 12,25 Nữ 34,83 ± 9,13 Cả giới 39,00 ± 11,15 Tuổi trung bình bệnh nhân nghiên cứu 39,00 ± 11,15 tuổi Tuổi trung bình bệnh nhân nam (40,86 ± 12,25 tuổi) lớn bệnh nhân nữ (34,83 ± 9,13 tuổi) TCNCYH 106 (1) - 2017 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Phát đột biến -455G/A kỹ thuật Realtime PCR 2.1 Tỷ lệ phát đột biến -455G/A Bảng Tỷ lệ phát đột biến -455G/A Chỉ số n Số bệnh nhân có đột biến gen Tỷ lệ đột biến/ giới (%) Nam 14 28,6 Nữ 16,7* Tổng 20 25 Giới *: Không khác biệt so với nam (p > 0,05) Có tổng số 20 bệnh nhân phát mang đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta, chiếm 25%, có nam (80%) nữ (20%) Tỷ lệ phát đột biến gen nam nữ có khác nhau, nhiên khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 2.2 Hình ảnh Realtime PCR phát đột biến -455G/A Hình Kết Realtime PCR giải trình tự mẫu khơng có đột biến mẫu đột biến -455G (không đột biến); -455A (đột biến) Chứng mẫu đột biến Chứng âm Chứng mẫu khơng đột biến 20 Chu kì ngưỡng (Ct) TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2.3 Kiểu gen đột biến -455G/A Bảng Kiểu gen đột biến -455G/A Kiểu gen n % Đồng hợp tử 100 Dị hợp tử 0 Tổng 100 Trong số bệnh nhân phát có đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đồng hợp tử, tức hai alen gen bị đột biến, khơng có trường hợp kiểu gen dị hợp tử (chỉ có alen bị đột biến) 2.4 Đối chiếu kết Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A So sánh kết phân tích đột biến -455G/A gen FGB 20 bệnh nhân kỹ thuật Realtime PCR kỹ thuật giải trình tự gen, kết sau: Bảng Sự phù hợp kết Realtime PCR giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A Bệnh nhân nhồi máu tim Phân tích kỹ thuật Realtime PCR (1) Phân tích kỹ thuật giải trình tự (2) Tỷ lệ phù hợp (1)/(2) Đột biến -455G/A 5 100% Không đột biến 15 15 100% Tổng số 20 20 100% Kết tìm đột biến phương pháp Realtime PCR giải trình tự bệnh nhân nhau, tỷ lệ phù hợp 100% IV BÀN LUẬN tim trẻ tuổi nghiên cứu 25% Theo Sau hoàn chỉnh thành công kỹ thuật nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang Realtime PCR để phát đột biến -455G/A đột biến -455G/A nhóm bệnh nhân xơ gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu vữa động mạch 25,8%, cao so với tỉ lệ bước đầu ghi nhận xử lý số liệu đột 15,2% nhóm chứng khơng mắc bệnh [9] biến -455G/A bệnh nhân nhồi máu tim Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến - trẻ tuổi Mặc dù hạn chế cỡ mẫu, 455G/A 885 nam giới tuổi 70, có tiền nhiên mở đầu cho nghiên cứu sử đau thắt ngực 21%, nghiên chi tiết đột biến cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến 35,3% tính Tỷ lệ phát đột biến -455G/A gen 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10; Fibrinogen Beta bệnh nhân nhồi máu 11] Như thấy, tỉ lệ phát đột TCNCYH 106 (1) - 2017 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến nghiên cứu Tỷ lệ phát đột biến -455G/A gen tương đồng so với tác giả khác Fibrinogen Beta 25% Tỷ lệ phát đột giới Ngoài ra, nghiên cứu năm 1999 cho biến nam nữ có khác nhau: 28,57% thấy đột biến -455G/A làm tăng 5,4% lượng 16,67%, nhiên khơng có ý nghĩa thống fibrinogen, kết hợp với đột biến khác kê, (p > 0,05) gen Fibrinogen Beta -854G/A tỉ lệ tăng lên xấp xỉ 11%, hay nghiên cứu năm Lời cảm ơn 1998 kết luận kiểu gen -455AA có nồng Nghiên cứu thực thành cơng nhờ độ fibrinogen trung bình 3,9 g/L so với trung hỗ trợ Bộ môn Y sinh học - Di truyền, bình 3,1 g/L kiểu gen -455GG [10; 12] Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Tim mạch Việt Điều cho thấy đột biến -455G/A đóng vai Nam Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á trò quan trong gia tăng nồng độ fibrinogen, chứng tỏ tầm quan trọng nghiên TÀI LIỆU THAM KHẢO cứu hoàn chỉnh kỹ thuật Realtime PCR để Longo D (2012) Epidemiology of Cardiovascular Disease, Harrisons Principles of internal Medicine, McGraw-Hill United States phát đột biến 75% trường hợp lại khơng phát có đột biến -455G/A bệnh nhân mắc đột biến khác đột biến Theo thống kê, bệnh nhân nhồi máu tim đột biến gen Fibrinogen Beta, ngồi đột biến -455G/A hay gặp xuất đột biến -148C/T, -249C/T, -854G/A, 993C/T [12] Điều giúp mở hướng cho nghiên cứu sau Tỷ lệ phát đột biến nam nữ có khác nhau: 28,57% nam 16,67% Ngô Quý Châu (2012) Bệnh học Nội khoa Nhà xuất Y học, Hà Nội, 185 Nguyễn Thị Hồng Huệ (2013) Nghiên cứu giá trị NT-PRO-BNP nhồi máu tim cấp khơng ST chênh lên Tạp chí Y dược lâm sàng, 108, 21 Brown E T., Fuller G M (1998) Detection of a complex that associates with the Bβ fibrinogen G− 455-A polymorphism Blood, 92 (9), 3286 - 3293 nữ, nhiên khơng có ý nghĩa thống kê, Mika M (2003) Fibrinogen gene promoter− 455 A allele as a risk factor for lacunar (p > 0,05) 100% trường hợp đột biến stroke Stroke, 34(4), 886 - 891 có kiểu gen đồng hợp tử, điều phù Sevimli S (2014) Impact of-455G/A hợp với đặc điểm di truyền lặn nhiễm sắc Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene on thể thường gen, trạng thái đồng hợp Platelet Aggregation in Patients With Acute tử biểu bệnh Coronary Syndrome Clinical and Applied V KẾT LUẬN Thrombosis/Hemostasis, 20(3), 238 - 243 Đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime Gu L (2014) Influence of the βfibrinogen-455G/A polymorphism on develop- PCR để phát đột biến -455G/A gen ment of ischemic stroke and coronary heart Fibrinogen Beta bệnh nhân nhồi máu tim disease Thromb Res, 133(6), 993 - 1005 cấp trẻ tuổi, kết phân tích phù hợp với Wilhelmsen L (1984) Fibrinogen as a risk factor for stroke and myocardial infarction kết giải trình tự gen 22 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC New England journal of medicine, 311(8), 501 - 505 vascular biology, 18(2), 265 - 271 Sun H (2004) [Relationship between fibrinogen B beta gene FGB-455G/A polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction] promoter A− 455 allele associated with poor Chinese journal of medical genetics, 21(4), 382 - 385 BMC neurology, 14(1), 10 de Maat M P (1998) -455G/A Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene is Associated With the Progression of Coronary Athero- 11 Mika M (2014) Βeta-fibrinogen gene longterm survival among 55 - 71 years old Caucasian women in Finnish stroke cohort 12 Van’t Hooft F M (1999) Two common, functional polymorphisms in the promoter region of the β-fibrinogen gene contrib- sclerosis in Symptomatic Men Proposed Role for an Acute-Phase Reaction Pattern of ute to regulation of plasma fibrinogen concen- Fibrinogen Arteriosclerosis, thrombosis and cular biology, 19(12), 3063 - 3070 tration Arteriosclerosis, thrombosis and vas- Summary APPLICATIONS OF REALTIME PCR TO DETECT -455G/A IN FIBRINOGEN BETA (FGB) GENE IN YOUNG PATIENTS WITH MYOCARDIAL INFARCTION Myocardial infarction in younger individuals or familial myocardial infarction of unknown etiology may be related to genetic mutations, including mutations common -455G/A Fibrinogen Beta gene regulations fibrinogen chain synthesis Mutations -455G/A of Fibrinogen Beta gene identified by using Real - time PCR is compared with sequencing results Our study was conducted on 20 patients under 60 years old with acute myocardial infarction admitted in the Vietnam National Heart Institute The mutation detection rates of -455G/A in the Fibrinogen Beta gene was 25% Mutation detection rate in male and female were 28.57% and 16.67% respectively These results fit with the sequencing results Researchers have successfully applied Real-time PCR techniques to detect mutations 455G/A in the Fibrinogen Beta gene in younger patients with acute myocardial infarction Keywords: Acute myocardial infarction, FGB, -455G/A TCNCYH 106 (1) - 2017 23 ... 2000 đột biến -455G/A gen Fibrinogen Beta - Thực kỹ thuật Realtime PCR phát kỹ thuật Realtime PCR đột biến -455G/A Gen Fibrinogen Beta II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP thiết kế nhân lên kỹ thuật PCR. .. lại khơng phát có đột biến -455G/A bệnh nhân mắc đột biến khác đột biến Theo thống kê, bệnh nhân nhồi máu tim đột biến gen Fibrinogen Beta, đột biến -455G/A hay gặp xuất đột biến -148C/T, -249C/T,... NGHIÊN CỨU Y HỌC Phát đột biến -455G/A kỹ thuật Realtime PCR 2.1 Tỷ lệ phát đột biến -455G/A Bảng Tỷ lệ phát đột biến -455G/A Chỉ số n Số bệnh nhân có đột biến gen Tỷ lệ đột biến/ giới (%) Nam