1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 7 doc

8 603 2

Đang tải... (xem toàn văn)

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 8
Dung lượng 478,46 KB

Nội dung

Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes... * Nếu không có sản phẩm - Chạy PCR cho mỗi cặp primer được s

Trang 1

22 Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O Brien A D., Alroy J., and

Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest

92:1418-1424

23 FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory

24 FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical

manual Online, CFSAN September 2002

<URL: http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam-4a.html

25 Gaastra W., and Svennerholm A M., 1996 Colonization factors of human

enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Trends Microbiol 4:444-452

26 Gyles C L., 1992 Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins Can J Microbiol 38:734-746

27 Handl C E., Olsson E., and Flock J I., 1992 Evaluation of three different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in

Swedish porcine Escherichia coli Diagn Microbiol Infect Dis 15:505-510

28 Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S., and Faibrother J M., 1991 Detection of genes for fimbrial antigens and

enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig with diarrhea J Clin Microbiol 29:745-752

29 Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992 Some

properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II Infect Immum 60:4468-4474

30 Karmali M A.,1989 Infection by verocytotoxin – producing Escherichia coli J Clin Microbiol Rev 2:15-38

31 Kenny B., DeVinney R., Stein M., Reinscheid D J., Frey E A., and Finlay B

B., 1997 Enteropathogenic E coli (EPEC) transfers its receptor for intimate adherence into mammalian cells Cell 91:511-520

32 Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno-and genotypic epidemiology Academic

dissertation The Faculty of Ariculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland

33 Koneman E W., Allen S D., Dowell V R., and Sommers H M., 1983 Color Atlas and extbook of Diagnostic Microbiology 2d ed., J.B Lippincott Co.,

Philadelphia, PA, pp 57-124

Trang 2

34 Leung P H M., Peiris J S M., Ng W W S., Robin-Browne R M., Bettelheim K A., and Yam W., C., 2003 A newly discovered verotoxin

variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli Appl Environ Microbiol 69: 7549-7553

35 Levine M M., Xu J., Kapper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987 A DNA probe to identify

enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome J Infect Dis

156:175-182

36 Makino S., Kobori H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al,

2000 Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escheichia coli from seagulls Epidemiol Infect 125:55-61

37 Moon H W., Schneider R A., and Moseley S L., 1986 Comparative

prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine Am J Vet Res 47:210-212

38 Nataro J P and Kaper J B., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11(1):142-201

39 Neter E., Westphal O., Luderitz O., Gimo R M., and Gorzynski E A., 1995

Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages Pediatrics 16:801-808

40 Paton A W and Paton J C., 1998a Detection and characterization of Shiga

toxigenic Escherichia coli by using multiplex - PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E coli hlyA, rfb 0111 , and rfb o157 J Clinical Microbiol 36(2):598-602

41 Paton J C and Paton A W., 1998b Phathogenesis and diagnosis of Shiga

toxin-producing Escherichia coli infection Clin Microbiol Rev 11:450-479

42 Pierard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., and Lauwers S., 1998 Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human

and animal Echerichia coli isolates J Clin Microbiol 36:3317-3322

43 Protocol online

<URL:http://www.protocol-online.org/prot/Molecular-Biology/PCR/

Multiplex- PCR/

44 Radu S., Mutalib S A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim Y

B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998 Detection of Escherichia coli O157:H7 in beef marketed in Malaysia Appl Environ Microbiol

64:1153-1156

Trang 3

45 Schmidt H., Beutin L., and Karch H., 1995 Molecular Analysis of the

Plasmid-encoed Hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933 Infec Immunity 63:1055-1061

46 Smith H R., and Scotland S M., 1998 Vero cytotoxin-producing strains of

Escherichia coli J Med Microbiol 26:77-85

47 Timisjarvi A T., Alatossava T., 2004 Rapid DNA preparation from milk and

dairy process samples for the detection of bacteria by PCR Food Microbiol

21:365-368

48 Thomas A., Cheasty T., Chart H., and Rowe B., 1994 Isolation of vero

cytotoxin-producing Escherichia coli serotypes O9ab:H- and

O101:H-carrying VT2 variant gene sequences from a patient with haemolytic uraemic

syndrome Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13:1074-1076

49 Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., and Iwanaga M., 2003 Multipex – PCR Assays for identification of human

diarrheagenic Escherichia coli J Clin Microbiol 41:2669-2671

50 Wang G., Clark C G., and Rodgerst F G., 2002 Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type

2 shiga toxin family by multiplex PCR J Clin Microbiol 40:3613-3619

51 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind

R., Byomi A., and Baljer G., 1996 Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes J Clin Microbiol 34:2980-2984

Trang 4

PHỤ LỤC 1

MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

Môi trường

CT-SMAC

SMAC

CT – SUPPLEMENT

MAC

Bacto Proteose peptone 3 g

NA

Trang 5

Sodium chloride 5 g

pH = 7,4 ± 0,2 (250C)

Nước peptone đệm

Disodium hydrogen phosphate 9 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g

pH = 7

SIMMON CITRAE

MR – VP

pH = 6,9 ± 0,2

Trang 6

Thuốc thử

VP (Voges Proskauer)

Dung dịch A:

Dung dịch B:

Potassium hydroxyde 40 g

MR (Methyl red)

HÓA CHẤT ĐIỆN DI TBE (0,5 X)

pH = 8,3

Agarose (1,4%)

Loading dye

HÓA CHẤT NHUỘM GEL

Trang 7

PHỤ LỤC 2

CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ

HƯỚNG GIẢI QUYẾT

Sản phẩm

không chuyên

biệt

* Nếu dài

- Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM

* Nếu ngắn

- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,9 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM

- Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp

- Giảm lượng DNA xét nghiệm

- Giảm lượng primer

- Giảm lượng Taq – polymerase

- Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng

độ dNTP

- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng

độ cuối cùng) Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối)

* Nếu không có sản phẩm

- Chạy PCR cho mỗi cặp primer được sử dụng trong multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn bình thường

- So sánh các sản phẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp primer kiểm tra với sản phẩm không chuyên biệt nhìn thấy khi chạy multiplex – PCR Điều này có thể chỉ ra mỗi cặp primer mang lại những sản phẩm không chuyên biệt trong phản ứng multiplex

- Kết hợp một vài hoặc tất cả những phương pháp trên

Sản phẩm yếu

(mờ)

- Giảm thời gian ủ bắt cặp

- Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 680C

- Tăng thời gian kéo dài

- Tăng nồng độ DNA xét nghiệm

- Tăng tất cả lượng primer sử dụng

- Điều chỉnh nồng độ Taq – polymerase

- Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2

mM

- Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng

độ dNTP

- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng

độ cuối cùng) Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối)

Trang 8

Sản phẩm dài

và yếu (mờ)

- Giảm nồng độ buffer cịn 0,7 – 0,8 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM

- Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,4 mM nhưng giữ nguyên nồng

độ dNTPs

- Tăng thời gian biến tính

- Tăng thời gian ủ bắt cặp

- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp

- Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài

- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR cĩ băng mờ đồng thời giảm lượng primer cho băng đậm

- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l) Nên thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng)

- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên

Sản phẩm

ngắn và yếu

(mờ)

- Tăng nồng độ buffer đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM

- Giảm thời gian biến tính

- Giảm thời gian ủ bắt cặp

- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp

- Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài

- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR cĩ băng mờ và giảm lượng primer cĩ băng đậm

- Thêm chất phụ gia BSA (0,1 – 0,8 g/l), cĩ thể thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng)

- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên

Ngày đăng: 28/07/2014, 05:21

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w