Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes... * Nếu không có sản phẩm - Chạy PCR cho mỗi cặp primer được s
Trang 122 Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O Brien A D., Alroy J., and
Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest
92:1418-1424
23 FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory
24 FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical
manual Online, CFSAN September 2002
<URL: http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam-4a.html
25 Gaastra W., and Svennerholm A M., 1996 Colonization factors of human
enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Trends Microbiol 4:444-452
26 Gyles C L., 1992 Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins Can J Microbiol 38:734-746
27 Handl C E., Olsson E., and Flock J I., 1992 Evaluation of three different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in
Swedish porcine Escherichia coli Diagn Microbiol Infect Dis 15:505-510
28 Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S., and Faibrother J M., 1991 Detection of genes for fimbrial antigens and
enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig with diarrhea J Clin Microbiol 29:745-752
29 Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992 Some
properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II Infect Immum 60:4468-4474
30 Karmali M A.,1989 Infection by verocytotoxin – producing Escherichia coli J Clin Microbiol Rev 2:15-38
31 Kenny B., DeVinney R., Stein M., Reinscheid D J., Frey E A., and Finlay B
B., 1997 Enteropathogenic E coli (EPEC) transfers its receptor for intimate adherence into mammalian cells Cell 91:511-520
32 Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno-and genotypic epidemiology Academic
dissertation The Faculty of Ariculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland
33 Koneman E W., Allen S D., Dowell V R., and Sommers H M., 1983 Color Atlas and extbook of Diagnostic Microbiology 2d ed., J.B Lippincott Co.,
Philadelphia, PA, pp 57-124
Trang 234 Leung P H M., Peiris J S M., Ng W W S., Robin-Browne R M., Bettelheim K A., and Yam W., C., 2003 A newly discovered verotoxin
variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli Appl Environ Microbiol 69: 7549-7553
35 Levine M M., Xu J., Kapper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987 A DNA probe to identify
enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome J Infect Dis
156:175-182
36 Makino S., Kobori H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al,
2000 Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escheichia coli from seagulls Epidemiol Infect 125:55-61
37 Moon H W., Schneider R A., and Moseley S L., 1986 Comparative
prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine Am J Vet Res 47:210-212
38 Nataro J P and Kaper J B., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11(1):142-201
39 Neter E., Westphal O., Luderitz O., Gimo R M., and Gorzynski E A., 1995
Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in sera of children of various ages Pediatrics 16:801-808
40 Paton A W and Paton J C., 1998a Detection and characterization of Shiga
toxigenic Escherichia coli by using multiplex - PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E coli hlyA, rfb 0111 , and rfb o157 J Clinical Microbiol 36(2):598-602
41 Paton J C and Paton A W., 1998b Phathogenesis and diagnosis of Shiga
toxin-producing Escherichia coli infection Clin Microbiol Rev 11:450-479
42 Pierard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., and Lauwers S., 1998 Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human
and animal Echerichia coli isolates J Clin Microbiol 36:3317-3322
43 Protocol online
<URL:http://www.protocol-online.org/prot/Molecular-Biology/PCR/
Multiplex- PCR/
44 Radu S., Mutalib S A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim Y
B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998 Detection of Escherichia coli O157:H7 in beef marketed in Malaysia Appl Environ Microbiol
64:1153-1156
Trang 345 Schmidt H., Beutin L., and Karch H., 1995 Molecular Analysis of the
Plasmid-encoed Hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933 Infec Immunity 63:1055-1061
46 Smith H R., and Scotland S M., 1998 Vero cytotoxin-producing strains of
Escherichia coli J Med Microbiol 26:77-85
47 Timisjarvi A T., Alatossava T., 2004 Rapid DNA preparation from milk and
dairy process samples for the detection of bacteria by PCR Food Microbiol
21:365-368
48 Thomas A., Cheasty T., Chart H., and Rowe B., 1994 Isolation of vero
cytotoxin-producing Escherichia coli serotypes O9ab:H- and
O101:H-carrying VT2 variant gene sequences from a patient with haemolytic uraemic
syndrome Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13:1074-1076
49 Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., and Iwanaga M., 2003 Multipex – PCR Assays for identification of human
diarrheagenic Escherichia coli J Clin Microbiol 41:2669-2671
50 Wang G., Clark C G., and Rodgerst F G., 2002 Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type
2 shiga toxin family by multiplex PCR J Clin Microbiol 40:3613-3619
51 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind
R., Byomi A., and Baljer G., 1996 Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other genes J Clin Microbiol 34:2980-2984
Trang 4PHỤ LỤC 1
MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ
Môi trường
CT-SMAC
SMAC
CT – SUPPLEMENT
MAC
Bacto Proteose peptone 3 g
NA
Trang 5Sodium chloride 5 g
pH = 7,4 ± 0,2 (250C)
Nước peptone đệm
Disodium hydrogen phosphate 9 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g
pH = 7
SIMMON CITRAE
MR – VP
pH = 6,9 ± 0,2
Trang 6Thuốc thử
VP (Voges Proskauer)
Dung dịch A:
Dung dịch B:
Potassium hydroxyde 40 g
MR (Methyl red)
HÓA CHẤT ĐIỆN DI TBE (0,5 X)
pH = 8,3
Agarose (1,4%)
Loading dye
HÓA CHẤT NHUỘM GEL
Trang 7PHỤ LỤC 2
CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ
HƯỚNG GIẢI QUYẾT
Sản phẩm
không chuyên
biệt
* Nếu dài
- Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM
* Nếu ngắn
- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,9 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM
- Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp
- Giảm lượng DNA xét nghiệm
- Giảm lượng primer
- Giảm lượng Taq – polymerase
- Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng
độ dNTP
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng
độ cuối cùng) Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối)
* Nếu không có sản phẩm
- Chạy PCR cho mỗi cặp primer được sử dụng trong multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn bình thường
- So sánh các sản phẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp primer kiểm tra với sản phẩm không chuyên biệt nhìn thấy khi chạy multiplex – PCR Điều này có thể chỉ ra mỗi cặp primer mang lại những sản phẩm không chuyên biệt trong phản ứng multiplex
- Kết hợp một vài hoặc tất cả những phương pháp trên
Sản phẩm yếu
(mờ)
- Giảm thời gian ủ bắt cặp
- Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 680C
- Tăng thời gian kéo dài
- Tăng nồng độ DNA xét nghiệm
- Tăng tất cả lượng primer sử dụng
- Điều chỉnh nồng độ Taq – polymerase
- Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2
mM
- Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng
độ dNTP
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng
độ cuối cùng) Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối)
Trang 8Sản phẩm dài
và yếu (mờ)
- Giảm nồng độ buffer cịn 0,7 – 0,8 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM
- Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,4 mM nhưng giữ nguyên nồng
độ dNTPs
- Tăng thời gian biến tính
- Tăng thời gian ủ bắt cặp
- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp
- Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR cĩ băng mờ đồng thời giảm lượng primer cho băng đậm
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l) Nên thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng)
- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên
Sản phẩm
ngắn và yếu
(mờ)
- Tăng nồng độ buffer đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM
- Giảm thời gian biến tính
- Giảm thời gian ủ bắt cặp
- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp
- Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR cĩ băng mờ và giảm lượng primer cĩ băng đậm
- Thêm chất phụ gia BSA (0,1 – 0,8 g/l), cĩ thể thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng)
- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên