Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 2 pdf

Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E.. coli mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR 13

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 14

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1 26

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2 26

SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli và phát hiện gen độc lực 22

BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli trên các mẫu khảo sát 40

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Số lượng mẫu 20 Bảng 4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm

khuẩn lạc đại diện cho E coli trong phân bò tiêu chảy 29 Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen stx1, stx2, eae, hly của một số khuẩn

lạc E coli riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy 30

Bảng 4.3 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn

lạc đại diện cho E coli trong phân heo tiêu chảy 33

Bảng 4.4 Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một số khuẩn lạc

E coli riêng lẻ phân lập được từ

phân heo tiêu chảy 35 Bảng 4.5 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn

lạc đại diện cho E coli trong phân bê tiêu chảy 36

Bảng 4.6 Kết quả phát hiện các gen độc lực của nhóm khuẩn lạc

đại diện cho E coli trong mẫu bề mặt thịt bò 38

Bảng 4.7 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực

của E coli trên các mẫu khảo sát 39

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi

sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một

số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non E coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng E coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài Nếu quá trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt

tươi, nhất là trong quá trình giết mổ Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm

không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E coli hoàn toàn có thể xảy ra

E coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong

đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội

chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu

(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây

bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa Trong khi đó, nhóm ETEC

(Enterotoxigenic E coli)mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli) mang gen eae

sản sinh protein intimin, …

Trước đây, để phát hiện E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền

thống Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới

có kết quả Hơn nữa, E coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có

nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng Do vậy, việc phát hiện các gen gây

độc của E coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây

bệnh trên vật nuôi và con người PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi

khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”

1.2 Mục tiêu

- Phát hiện một số gen độc lực của E coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ

mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

1.3 Mục đích

- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E coli gây ra cho động vật và

người

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa

người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885

- Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ

thống phân loại của Bergey)

- E coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng

1,5m x 0,5m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996)

E coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu

nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực

ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 – 7,4)

- E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau

trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí E coli thường được phân

lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB)

Trên môi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường

SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi

nhầy, còn các nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002)

giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường

- Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết quả là + + - -

(biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992)

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular) Có trên 700 loại serotype

của E coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K Theo Jay (2000), E coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30

type kháng nguyên H

2.1.4 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli:

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC

- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC

- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC

Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),

E coli được chia thành 5 nhóm sau:

 STEC (Shiga toxin – producing E coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E

coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

 EPEC (Enteropathogenic E coli)

 EAEC (Enteroaggregative E coli)

 ETEC (Enterotoxigenic E coli)

 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

- EIEC (Enteroinvasive E coli)

- DAEC (Diffusely adherent E coli)

2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC

a Danh pháp

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác

nhau để đặt tên cho nhóm E coli này:

- Tên gọi Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli

(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu

- Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây

viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998)

- Tên Shiga toxin - producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống

như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997) Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng

nhóm E coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, không

phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác

Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe

mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995) Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998)

b Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

* Shiga toxin

Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt)

Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và

Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2 Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn

vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA) Cả hai gen

stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc

thể (NST) của STEC Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả

Stx2e (Pierard và ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh

ở người Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994) Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và

VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997) Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen

mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000)

* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là heat – stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157 Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc

lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E coli có Stx âm tính và

Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989) EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết, nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào ruột Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Protein

intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching và effacing) Intimin gây tổn

thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi

khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây

bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương

A/E Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein

màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997)

Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác Dấu hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc không tạo ra- glucuronidase Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào

việc phát hiện E coli không lên men sorbitol O157:H7 và các serotype không phải

O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM và O113:H21 (WHO, 1994)

c Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu,

dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000) Loài động vật quan trọng nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996)

STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang người khác Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001)

2.1.5.2 Nhóm EPEC

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em

a Đặc điểm

Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn

bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố Shiga

b Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998) Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự

hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu