“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiê
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NG D NG K THU T MULTIPLEX - PCR PHÁT HI N CÁC GEN C
L C C A VI KHU N
ESCHERICHIA COLI PHÂN L P T
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CH Y
VÀ TH T BÒ
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện : ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ
Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Trang 2KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NG D NG K THU T MULTIPLEX - PCR PHÁT HI N CÁC GEN C
L C C A VI KHU N
ESCHERICHIA COLI PHÂN L P T
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CH Y
VÀ TH T BÒ
th c hi n:
PGS TS NGUY N NG C TUÂN OÀN
TH TUY T LÊ
BSTY BÙI THỊ THU TRANG
Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005
Trang 3LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:
* Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần Ba mẹ đã luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường
* PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức
* BSTY Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khóa luận này
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM
* BSTY Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP HCM
* Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập
Chân thành cảm ơn Đoàn Thị Tuyết Lê
Trang 4TÓM TẮT
ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005 “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO
TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”
Hội đồng hướng dẫn:
PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân
BSTY Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I,
sta, stb, vt2e của vi khuẩn E coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo,
bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR Ghi nhận được khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng; khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó
(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1,
eae) Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E coli mang các
gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E coli
(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy
của bò, bê và heo
Trang 5SUMMARY
“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli
isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”
The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes
of isolated E coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9
swabs of the beef surface by multiplex – PCR Observation had one group of pink colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies DNA of the colony groups and each separate colony were extracted by heat method The results of multiplex – PCR were showed that:
(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the genes
(2) Frequency of virulence genes of isolated E coli from diarrhea stools samples was 25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).
(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E coli.
(4) Sta gene of E coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples
weren’t detected
Trang 6MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2 TỔNG QUAN 3
2.1 Vi khuẩn E coli 3
2.1.1 Định nghĩa 3
2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3
2.1.3 Yếu tố kháng nguyên 4
2.1.4 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli 4
2.1.5 Phân loại E coli 4
2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 4
2.1.5.2 Nhóm EPEC 7
2.1.53 Nhóm ETEC 8
2.2 Kỹ thuật PCR 11
2.2.1 Nguyên tắc 11
2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12
2.2.3 Các thành phần của phản ứng PCR 14
2.2.4 Phân tích kết quả PCR 15
2.2.5 Những ứng dụng của PCR 15
Trang 72.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ 15
2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng 16
2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA 16
2.2.5.4 PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau 17
2.2.6 Các hạn chế của PCR 17
3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 19
3.2 Nội dung 19
3.3 Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1 Lấy mẫu 19
3.3.2 Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E coli 20
3.3.3 Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E coli phân lập được 23
3.3.4 Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di 25
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1 Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E coli từ các khuẩn lạc phân lập được 27
4.1.1 Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC 27
4.1.2 Xác định E coli cho các khuẩn lạc được chọn 27
4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 28
4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy 32
4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 36
4.5 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 38
4.6 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli trên các mẫu khảo sát 39
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1 Kết luận 41
Trang 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
7 PHỤ LỤC 46
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFA : Colonization factor antigen
CT-SMAC :Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agar
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
eae : E coli attaching and effacing
EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E coli
EPEC : Enterophathogenic E coli
ETEC : Enterotoxigenic E coli
FAO : Food and Agriculture Organization
IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate LEE : Locus of enterocyte effacement
Trang 9PCR : Polymerase chain reaction
STEC : Shiga toxin-producing E coli
Tir : Translocated intimin receptor
VTEC : Verotoxigenic E coli