Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: 1 miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, 2 những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng v
Trang 1mô Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và
V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin Protein này là yếu tố độc
lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993) Theo Nataro và Kaper (1998), gen
eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường
c Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường
miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em Người trưởng thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất các thụ thể đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ cao
2.1.5.3 Nhóm ETEC
a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT)
(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):
Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra
LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế bào LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I
và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT-I là
một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1
và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành
Trang 2vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT) Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh
(LTh- I) được phân lập từ người Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid
mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA)
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus) Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998)
- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến bệnh trên người và thú
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi
khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V cholerae không phải O1 ST
giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1 Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử
khoảng 2 kDa STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E coli phân lập trên người
Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người
Trang 3Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây
ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb còn kích thích phóng thích PGE2
và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992)
Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens)
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh
b Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC
Trang 4trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981) Sự nhiễm ETEC, ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm
c Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng
cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có
ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy
d Phát hiện và chẩn đoán
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…
2.2 Kỹ thuật PCR
2.2.1 Nguyên tắc
Trang 5PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào)
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới
bổ sung với sợi DNA mẫu Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sự tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ
đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online)
2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở
94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút
Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút
Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA
Trang 6* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2n Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu
kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định Tuy nhiên, ở chu
kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2
x : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng
Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng
Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu ban đầu là
105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40
Giai đoạn biến tính (denaturation)
Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Trang 7Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, cĩ trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuơn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen, khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuơi và primer ngược và cũng khơng cĩ những cấu trúc kẹp tĩc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primer xuơi và ngược khơng quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nĩng Taq DNA polymerase
khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản
Biến tính 94-950C
Ủ bắt cặp 40-700C
Kéo dài
720C
Lặp lại n lần
Thời gian (phút)
0 C)
Trang 8ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng
5’3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C
- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA
- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)
2.2.4 Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường Sự
di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế
Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng =300 nm) thành vạch màu đỏ da cam
Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)
2.2.5 Những ứng dụng của PCR
2.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ
Trang 9PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này
Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc
và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụng các phương pháp phân tích thông thường
Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các xác ướp
2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền
PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Ví dụ: Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng Từ đó ta
có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại
2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ enzyme reverse transcriptase
Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác