Sử dụng kỹ thuật Rapd-Pcr để xác định mối quan hệ di truyền của một số loài thuộc chi Calothrix (Cyanobacteria) phân lập được từ đất trồng của tỉnh Đắc Lắc

Nhằm có những dẫn liệu khoa học bổ sung cho phương pháp phân loại kinh điển, bài viết sử dụng phương pháp RAPD-PCR để tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 5 loài thuộc chi Calothrix phân lập được từ đất trồng của tỉnh Đắc Lắc.

28 (1): 68-74 3-2006 T¹p chÝ Sinh häc Sư dơng kỹ thuật RAPD-PCR để xác định mối quan hệ di truyền số loài thuộc chi Calothrix (cyanobacteria) phân lập đợc từ đất trồng tỉnh Đắc Lắc Hồ Sỹ Hạnh Trờng cao đẳng S phạm Đắc Lắc Võ Hành Trờng đại học Vinh Đặng Diễm Hồng Viện Công nghƯ sinh häc Chi Calothrix thc ngµnh vi khn lam (Cyanobacteria) có số lợng loài dới loài lớn, phân bố rộng toàn cầu Theo Gollerbakh, Calothrix có 47 taxa [3], cßn theo Desikachary-39 taxa [2] ë ViƯt Nam, nay, định danh đợc 14 taxa [11, 12] Một số loài chúng có khả cố định nitơ từ khí [10] Từ năm 2002-2003, đ tiến hành thu mẫu vi khuẩn lam (VKL) đất trồng tỉnh Đắc Lắc phân lập đợc loài thuộc chi Calothrix khiết Việc phân loại VKL chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Tuy nhiên, tự nhiên, nhiều loài sinh vật giống hình thái chúng dễ thay đổi theo biến đổi môi trờng Các kỹ thuật phân tích DNA ngày đợc áp dụng rộng r i, góp phần xây dựng phân loại phân tích tính đa dạng di truyền loài nh cá thể loài [1, 4, 5, 6, 7, 9] Nh»m cã nh÷ng dÉn liƯu khoa học bổ sung cho phơng pháp phân loại kinh điển, bớc đầu sử dụng phơng pháp RAPD-PCR ®Ĩ t×m hiĨu mèi quan hƯ di trun cđa loài thuộc chi Calothrix phân lập đợc từ đất trồng tỉnh Đắc Lắc I Phơng pháp nghiên cứu Mẫu VKL đợc phân lập từ mẫu đất trồng lúa đất trồng tỉnh Đắc Lắc năm 2002-2003 Môi trờng nuôi cấy để phân lập BG-11 có 10% thạch đ tiệt trùng Để thu đợc loài VKL khiết 68 (sạch tảo vi khuẩn khác), sử dụng phơng pháp cấy truyền nhiều lần Chiếu ánh sáng cực tím qua mẫu VKL khiết với thời gian 10-15 phút, thu đợc mẫu VKL Độ khuẩn chúng đợc kiểm tra kính hiển vi quang học hai mắt có độ phóng đại 600-1000 lần, sau chuyển mẫu vào bình cầu dung tích 100 ml có chứa 50 ml môi trờng BG-11 lỏng để tạo sinh khối nhằm sử dụng cho phản ứng RAPD-PCR DNA genom mẫu VKL đợc tách chiết theo phơng pháp Y K Hong có cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam (Trần Hữu Quang cs., 1999) [8] Ba mồi ngẫu nhiên đặc trng cho VKL đ đợc sử dụng có trình tự nh sau: OPA4AATCGGGCTG, OPA10-GTGATCGCAG OPL12-GGGCGGTACT PCR đợc thực máy PTC-100TMProgrammable Thermal Controller MJ Research Phản ứng đợc bắt đầu giai đoạn biến tính DNA khuôn 94oC phút tiếp đến 45 chu kỳ, chu kỳ bao gồm bớc thay đổi nhiệt độ nh sau: 94oC-30 giây; 32oC-1 phút 30 giây; 72oC-2 phút Giai đoạn tổng hợp cuối đợc thực 72oC phút Sản phẩm PCR đợc điện di gel agarosa 1,2% máckơ Kb, sau đợc nhuộm EtBr đợc chụp ảnh Hệ số đồng dạng di truyền loài VKL đợc tính theo công thøc cđa Nei vµ Li (1979) [5]: S= 2N i j Ni + N j Trong đó, Nij: số băng có hai loài i j; Ni: số băng có loài i; Nj: số băng có loài j Cây phân loại loài VKL đợc xây dựng phần mềm máy tính NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistic Inc, USA, 1998) II Kết nghiên cứu Kết phân loại theo phơng pháp kinh điển Trichom thắt hẹp vách ngăn ngang tế bào Khi non tế bào hình vuông đến hình chữ nhật; trởng thành, tế bào có chiều dài ngắn rộng Tế bào đỉnh có mặt tự hình nêm, không tạo lông Gốc sợi rộng 13,6 àm, đỉnh rộng 6,8 àm Trichom có phần gốc rộng 10,2 àm Tế bào dài 5,1 àm Heterocyst đơn độc gốc sợi hình cầu, có đờng kính 11,9 µm Khi tr−ëng thµnh, tÕ bµo ph©n chia nhanh lµm cho trichom uèn cong gÊp khóc dån bao, sau khúc hình thành tảo đoạn (hình 2) Mẫu số 20 đợc xếp vào loài Calothrix sp1 Sau thu đợc mẫu VKL sạch, đánh số ký hiƯu nh− sau: 1, 20, 201, 202 vµ 203 Căn theo tiêu chuẩn hình thái, mẫu VKL đợc xếp vào loài dới loài sau đây: a Mẫu số (M1) Sợi đơn độc, có màu khác (màu lam tái đến ôliu); bao không phân lớp Sợi có giảm dần từ gốc đến đỉnh Trichom rộng 5,1-6 àm, eo thắt vách ngăn ngang, cuối thon lại Heterocyst hình trứng rộng 4-5,1 àm, dài 4,8-6 àm Bào tử đơn độc cặp, rộng 8,5- àm, dài 6-10 àm (hình 1) Mẫu số đợc xếp vào loài Calothrix javanica De Wilde H×nh Calothrix sp1 (× 600) c MÉu sè 201 (M201) H×nh Calothrix javanica De Wilde (× 600) b Mẫu số 20 (M20) Tản có màu lam sáng Sợi dài; bao mỏng Tản nh mảnh nhung nhỏ, có màu lam nâu Sợi dài, kích thớc sợi tơng đối đồng đều, thuôn nhẹ phía đỉnh Sợi rộng 8,5-13,6 àm; bao mỏng, vững Trichom rộng 8,5-11,9 àm, eo thắt vách ngăn ngang tế bào, kết thúc sợi lông Tế bào tận tròn lại; tế bào có chiều dài dài chiều rộng có chiều dài ngắn rộng Heterocyst đơn độc gốc, hình bán cầu cầu, rộng 8,5 àm, dài 5,1 àm (hình 3) Mẫu số 201 đợc xếp vào loài Calothrix marchica var crassa Rao, C B 69 a b H×nh Calothrix marchica var crassa Rao, C B a phÇn gèc cđa sợi (ì 600); b sợi (ì 120) d Mẫu số 202 (M202) Tản có màu lam tối lam nâu Sợi dài tới 250 àm, chúng hợp lại thành búi; sợi phình gốc có chiều rộng 6-9 àm, trung bình 5,1 àm; bao mỏng không phân lớp, mở ®Ønh Trichom ë gèc réng 5,1-6,8 µm; ®Ønh réng 3,4 àm, đỉnh dạng lông Tế bào hình vuông chiều dài ngắn rộng Heterocyst gốc, đơn độc, rộng 4,1-6,8 àm (hình 4) Mẫu 202 đợc xếp vµo loµi Calothrix elenkinii Kosinsk 10,2 µm, dµi 3,4-5,5 µm Tế bào đỉnh có mặt tự tù Heterocyst đáy đơn độc, hình bán cầu, có đờng kính 10,2 àm Tảo đoạn hình thành cuối sợi (hình 5) Mẫu số 203 đợc xếp vào loài Calothrix sp2 Hình Calothrix sp2 (× 600) Sư dơng kü tht RAPD-PCR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài thuộc chi Calothrix Hình Calothrix elenkinii Kosinsk (ì 600) e Mẫu số 203 (M203) Tản nh lông tơ xanh lam sáng, cấu tạo sợi dài (trên 620 àm) Gốc sợi phình ra, rộng 11,9 àm giảm dần phía đỉnh, rộng 5,1-68 àm; tận không lông; bao mỏng Trichom eo thắt, rộng 5,170 a Tách chiết DNA tổng số loµi VKL thc chi Calothrix Tõ sinh khèi cđa mẫu Calothrix sạch, tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phơng pháp Y K Hong có cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam [5] Kết đợc hình 6, cho thấy DNA tách chiết đợc đảm bảo nồng độ độ tinh để làm nguyên liệu cho nghiên cứu 1 M M1 5 M2 12 kb 5000 bp 21 kb 12 kb 5000 bp 2000 bp 1650 bp 2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1353 bp 1078 bp 872 bp 603 bp 310 bp 281 bp 271 bp 234 bp 194 bp 118 bp H×nh Kết tách chiết DNA tổng số loài VKL thuộc chi Calothrix Hình Kết chạy điện di sản phẩm RAPDPCR cuả loài VKL với mồi OPA4 Các giếng 1-5 lần lợt mẫu 1, 20, 201, 202 vµ 203; giÕng M kb Plus DNA Ladder M1, M2 1Kb Plus DNA Ladder vµ φ X 174 -Hae III digest; giếng 1-5 lần lợt mẫu 1, 20, 201, 202 203 M2 1353 bp 1078 bp 872 bp 603 bp 310 bp 281 bp 271 bp 234 bp 194 bp 118 bp M1 M1 12 kb 5000 bp 12 kb 2000 bp 1650 bp 1000 bp 850bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp 650 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp M2 1353 bp 1078 bp 872 bp 603 bp 310 bp 281 bp 234 bp 194 bp 118 bp 72 bp H×nh Kết chạy điện di sản phẩm RAPDPCR cuả loài VKL với mồi OPA10 Hình Kết chạy điện di sản phẩm RAPDPCR cuả loài VKL với måi OPL12 M1, M2 1Kb Plus DNA Ladder vµ φ X 174 -Hae III digest; giếng 1-5 lần lợt mẫu 1, 20, 201, 202 203 M1, M2 1Kb Plus DNA Ladder vµ φ X 174 -Hae III digest; giếng 1-5 lần lợt mẫu 1, 20, 201, 202 203 71 Bảng Các đoạn DNA đợc nhân RAPD-PCR với mồi OPA4, OPA10 vµ OPL12 cđa loµi VKL thc chi Calothrix Kích thớc băng DNA 20 201 202 203 Kích thớc băng DNA 4100 (OPA4) 2300 2100 1850 1650 1600 1550 1450 1400 1353 1250 1180 1110 1000 995 950 900 850 800 765 700 680 650 600 560 545 510 420 340 310 250 1900 (OPA10) 1850 1700 1600 1550 1500 1450 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1300 1078 995 900 850 700 650 590 550 500 480 420 400 350 320 3000 (OPL12) 2600 2500 1800 1650 1600 1500 1300 1150 1078 1000 950 872 860 800 750 700 600 570 530 500 485 310 72 20 201 202 203 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 b Phân tích tính đa dạng di truyền loài thuộc chi Calothrix kỹ thuật RAPD Trong trình chạy RAPD-PCR, tiến hành tối u điều kiện PCR cho phù hợp với đặc trng mÉu KÕt qđa ph¶n øng RAPDPCR víi måi OPA4, OPA10 OPL12 đợc trình bày hình 7, Kết cho thấy có 75 băng DNA rõ nét đợc nhân lên với mồi Trong đó, mồi OPA4 nhân đợc 31 băng, OPA10-22 băng OPL12-22 băng Trung bình, mồi nhân đợc 25 băng mẫu Chiều dài băng nằm khoảng 250 bp đến 4100 bp Trong 75 băng nhân đợc, có 74 băng đa hình (chiếm 98,66%); có băng có kích thớc 850 bp chung cho loài thuộc chi Calothrix đợc nghiên cứu mồi OPA10 Băng chung đợc xem máckơ đặc trng chung cho loài thuộc chi Calothrix Số lợng băng đợc nhân với mồi chiều dài chúng đợc trình bày bảng Dựa có mặt băng DNA nhân ngẫu nhiên với mồi OPA4, OPA10 OPL12 (bảng 1), hệ số đồng dạng loài đợc so sánh với dựa vào công thức Nei Li (phần phơng pháp nghiên cứu) Kết đợc bảng Bảng Hệ số đồng dạng di truyền loài thuộc chi Calothrix M1 1,0000 0,5783 0,6867 0,6144 0,6144 M1 M20 M201 M202 M203 M20 M201 M202 M203 1,0000 0,5542 0,4578 0,5060 1,0000 0,5662 0,6144 1,0000 0,4698 1,0000 Mèi quan hÖ loài đợc thể hệ số đồng dạng di truyền chúng Các loài giống mặt di truyền hệ số đồng dạng di truyền lớn ngợc lại Hệ số đồng dạng di truyền lớn M1 M201 0,6867 thấp M202 M20 0,4578 Hệ số sai khác loài thay đổi từ giá trị 0,3133 (1-0,6867) đến 0,5422 (1- 0,4578) Nh vậy, khác loài thuộc chi Calothrix đợc nghiên cứu mức độ phân tử DNA phát đợc nhờ kỹ thuật RAPD-PCR Cây phân loại loài thuộc chi Calotthrix đợc thiết lập dựa chơng trình NTSYSpc 2.0, đợc thể hình 10 M1 M201 M203 M202 M20 0,52 0,56 0,61 0,65 0,69 Hệ số Hình 10 Cây phân loại loài VKL thuộc chi Calothrix Trên phân loại (hình 10), loài thuộc chi Calothrix đợc chia làm nhãm chÝnh Nhãm thø nhÊt chØ gåm loµi M20 Nhãm thứ hai gồm loài lại, đợc chia thành nhánh 73 nhỏ Nhánh nhỏ thứ gồm loài M202 Nhánh nhỏ thứ hai gồm loài M203, M201 M1 Hệ số đồng dạng di truyền loài M20 loài M202 0,4578, loài M20 loài M203-0,5060; loài M202 loài M2030,4698; loài M203 loài M201 0,6144 Các hệ số không cao, cho phép phân biệt chúng loài tách biệt Loài M201 loài M1 có hệ số ®ång d¹ng di trun cao nhÊt: 0,6867, cho thÊy loài có quan hệ gần so với loài lại (M20, M202 M203) Nh vậy, kỹ thuật RAPD-PCR, xác định đợc sai khác mặt di truyền loài VKL thuộc chi Calothrix III Kết luận Từ mẫu đất trồng tỉnh Đắc Lắc, đ phân lập đợc loài thuộc chi Calothrix định loại chúng theo phơng pháp kinh điển Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để nghiên cứu tính đa dạng di truyền loài trên, có kết luận sau: - Trong tổng số 75 băng DNA đợc nhân lên với mồi có 74 băng đa hình (chiếm 98,66%) Xác định đợc máckơ chung đặc trng cho loài VKL thuộc chi Calothrix đợc nghiên cứu mồi OPA10 - B»ng kü thuËt RAPD-PCR ® cho thÊy sù khác biệt mặt di truyền loài thuộc chi Calothrix đợc phân lập từ đất trồng tỉnh Đắc Lắc Tài liệu tham khảo Trần Dụ Chi cs., 2001: Tạp chí Sinh học, 23(3a): 170-177 Hà Néi Desikachary T V., 1959: Cyanophyta, Indian Council of Agricultural Research, New Delhi Gollerbakh M M., Kosinskaia E K., Poljanski B N., 1953: Opredelitel presnovodnukh vodoroslei SSSR, Vupusk 2: Sinejilionue vodoroslei Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Võ Thơng Lan, 2000: Tạp chí Sinh học, 22(2): 24-28 Hà Nội Đặng Diễm Hồng cs., 2002: Tạp chí Khoa học Công nghệ, 40(số đặc biệt): 161-167 Hµ Néi Raeid M M Abed et al., 2003: J Phycol., 39(5): 862-873 Renhui Li, Wayne W Cacmichael and Paulo Pereira, 2003: J Phycol., 39(4): 814818 Trần Hữu Quang cs., 1999: Kỷ yếu Viện Công nghƯ sinh häc: 170-177 Hµ Néi Sean Turner, Tan-Chi Huang and ShuMiaw Chaw, 2001: Bot Bull Acad Sin., 42: 181-186 10 Dơng Đức Tiến, 1994: Vi khuẩn lam cố định nitơ ruộng lúa Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 11 Dơng Đức Tiến, 1996: Phân loại vi khuẩn lam Việt Nam Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 12 Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Môi trờng-ĐHQG HN, 2001: Danh lục loài thực vật Việt Nam, 1: 1-50, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội USING THE RAPD-PCR TECHNIQUE TO IDENTIFY THE GENETIC RELATIONSHIP OF some CALOTHRIX species ISOLATED from CULTURAL SOIl OF the DAcLAc PROVINCE Ho Sy Hanh, Vo Hanh, dang diem hong Summary Five pure species of the genus Calothrix have been isolated from soil samples in the Daclac province and classified by the classical method We have used the RAPD-PCR technique to explore the genetic relationship of these Calothrix species The results showed that 75 bands were multiplied by random primers OPA4, OPA10 and OPL12; each of which on average had 25 bands for these Calothrix species There were 74 polymorphic bands and one band was common marker for these species The RAPD-PCR technique showed the genetic difference among these species The findings by using the RAPD-PCR technique were consistent with the results of classical methods Ngµy nhËn bµi: 29-06-2005 74 ... mặt di truyền loài VKL thuộc chi Calothrix III Kết luận Từ mẫu đất trồng tỉnh Đắc Lắc, đ phân lập đợc loài thuộc chi Calothrix định loại chúng theo phơng pháp kinh điển Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR. .. 0,6144 1,0000 0,4698 1,0000 Mối quan hệ loài đợc thể hệ số đồng dạng di truyền chúng Các loài giống mặt di truyền hệ số đồng dạng di truyền lớn ngợc lại Hệ số đồng dạng di truyền lớn M1 M201 0,6867... 5) Mẫu số 203 đợc xếp vào loài Calothrix sp2 H×nh Calothrix sp2 (× 600) Sư dụng kỹ thuật RAPD-PCR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài thuộc chi Calothrix Hình Calothrix elenkinii Kosinsk