Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS trong định danh và xác định mối quan hệ di truyền một số loài lan thuộc chi hoàng thảo (Dendrobium)

Trong nghiên cứu này, mã vạch DNA dựa trên vùng đệm sao chép nội (ITS-based DNA barcode) được sử dụng để phân tích cấu trúc di truyền của 10 mẫu lan Hoàng thảo được thu thập từ các khu vực khác nhau. Kết quả cho thấy có sự đa dạng di truyền trong vùng ITS của 10 mẫu lan. Dựa vào phân tích theo mô hình Kimura 2- parameter, khoảng cách di truyền giữa các mẫu lan dao động từ 0,00 đến 1,14. Mời các bạn cùng tham khảo!

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 21 (4) (2021) 31-38 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ VÙNG ITS TRONG ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI LAN THUỘC CHI HOÀNG THẢO (Dendrobium) Huỳnh Thị Trúc Phương, Hồ Viết Thế* Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: thehv@hufi.edu.vn Ngày nhận bài: 21/01/2021; Ngày chấp nhận đăng: 03/5/2021 TÓM TẮT Lan Hoàng thảo (Dendrobium) chi lớn họ Phong lan Nhiều lồi chi lan có giá trị kinh tế cao vẻ đẹp tính dược liệu Tuy nhiên, việc phân loại loài dựa đặc điểm hình thái thường khó khăn có nhiều điểm tương đồng loài Trong nghiên cứu này, mã vạch DNA dựa vùng đệm chép nội (ITS-based DNA barcode) sử dụng để phân tích cấu trúc di truyền 10 mẫu lan Hoàng thảo thu thập từ khu vực khác Kết cho thấy có đa dạng di truyền vùng ITS 10 mẫu lan Dựa vào phân tích theo mơ hình Kimura 2- parameter, khoảng cách di truyền mẫu lan dao động từ 0,00 đến 1,14 Qua định danh BLAST, 10 mẫu lan có mẫu thuộc loài Dendrobium catenatum, mẫu thuộc loài Dendrobium aphyllum tám mẫu cịn lại xác định thuộc lồi Dendrobium anosmum Như vậy, mã vạch DNA dựa vùng ITS có triển vọng lớn việc nhận dạng phân loại cung cấp thông tin mối quan hệ di truyền loài lan chi Hồng thảo Từ khóa: Đa dạng di truyền, Dendrobium, ITS, mã vạch DNA, thị phân tử MỞ ĐẦU Chi lan Hoàng thảo Dendrobium chi lớn họ Phong lan (Orchidaceae) bao gồm khoảng 800-1400 loài [1] Ở Việt Nam có 100 lồi lan Hồng thảo với giá trị trang trí dược liệu khác Việc phân loại xác cấp độ lồi công việc quan trọng để bảo tồn, sử dụng bền vững nguồn tài nguyên thực vật đánh giá quỹ gen chi thực vật nhiệm vụ quan trọng, cấp bách mang tính khoa học thực tiễn cao Thơng thường, lồi lan phân biệt với thông qua thân, hoa trưởng thành Tuy nhiên, phương pháp thường bị tác động yếu tố ngoại cảnh, giai đoạn phát triển Các đặc điểm hình thái nhiều chi Hoàng thảo giống giai đoạn chưa có hoa [2] Để phân biệt thơng qua hình thái xác u cầu tiên phải giai đoạn phát triển hoàn chỉnh điều làm tốn thời gian nhiều, kết dựa vào cảm tính người đánh giá nên gây sai lệch kết cuối Do đó, khó chí khơng thể phân biệt lồi cách sử dụng phân loại hình thái học Vì vậy, việc phát triển phương pháp xác khơng phức tạp để xác thực lồi lan chi Hoàng thảo cấp thiết Mã vạch DNA công cụ sử dụng nhiều để phân biệt lồi có quan hệ họ hàng gần Mã vạch DNA kỹ thuật để xác thực sinh vật dựa đoạn DNA ngắn, đó, vùng nội phiên mã DNA ribosome (Internal transcribed spacer/ITS) có độ bảo tồn lồi, nhiên có biến động cao mức độ loài, vùng dễ khuếch đại với lượng DNA nhỏ Do đó, mã vạch ITS xem vùng lý tưởng để xác thực loài 31 Huỳnh Thị Trúc Phương, Hồ Viết Thế thực vật khác Mã vạch sử dụng nhiều việc định danh loài lan nhiều nước khác Trung Quốc [2], Malaysia [3], Sri Lanka [4] Ở nước ta, vùng ITS sử dụng để nhận diện mẫu giống lan trước nhân giống phương pháp nuôi cấy mơ [5] Vùng sau xác định phù hợp vùng DNA khác nhưu matK, rbcL, rpoB1, rpoB2, rpoC1 rpoC2 phân biệt loài mẫu lan kim tuyến [6], gần hơn, vùng ITS sử dụng để phân tích mối quan hệ di truyền loài lan Giả hạc, Long tu, Trầm [7] Trong nghiên cứu này, đa dạng di truyền 10 mẫu lan thuộc chi Hoàng thảo thu thập vùng địa lý khác phân tích cách sử dụng đánh dấu mã vạch DNA dựa ITS Kết thu cung cấp thơng tin khoa học cho việc phân loại, xác định, bảo tồn phát triển loài lan thuộc chi Hoàng thảo Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Thông qua liên hệ với đồng nghiệp, viện nghiên cứu trường đại học, tổng cộng 10 mẫu lan có đặc điểm đặc trưng thuộc chi Hoàng thảo thu thập từ địa điểm khác trình bày Bảng Sau thu thập, mẫu bảo quản tủ mát sử dụng cho tách chiết DNA Bảng Danh sách mẫu lan sử dụng nghiên cứu Nơi thu nhận STT Ký hiệu mẫu Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM HF Khu Nông nghiệp Công nghệ cao Củ Chi CC Ninh Thuận NT Buôn Mê Thuột BMT Đắk lắk DKL Campuchia CPC Gia Lai GL Lâm Đồng LĐ Tây Nguyên TN 10 An Giang AG 2.2 Tách chiết DNA DNA tổng số chiết xuất từ mẫu lan theo quy trình Doyle Doyle [8] Chất lượng DNA sau kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1% dung dịch đệm TAE Tris-Acetate-EDTA 1X nhuộm thuốc nhuộm Gelred (Biotium, Mỹ) DNA quan sát tia cực tím máy đọc gel Quantum-ST4 3000 (Montreal Biotech, Canada) để kiểm tra độ nguyên vẹn DNA thu Nồng độ DNA sau xác định máy quang phổ (Optima SP 3000 nano UV-VIS, Nhật Bản) bước sóng 260 nm 2.3 Phản ứng PCR giải trình tự DNA Vùng ITS khuếch đại cách sử dụng thành phần phản ứng PCR sau: 7,5 μL 2X Mytaq Red Mix (Bioline, Anh), 20 ng DNA, 0,2 μM primer (ITS18S_F 5' AGGAGAAGTCGAACAAG 3' ITS26S_R 5' GTTTCTTTTCCTCCGCT 3'), nước PCR 32 Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS định danh xác định mối quan hệ di truyền… cho thể tích cuối 15 μL Điều kiện phản ứng PCR sau: biến tính ban đầu 94 °C phút; sau 35 chu kỳ 30 giây 94 °C, 30 giây 55 °C, phút 72 °C, cuối phút 72 °C để hoàn thành phản ứng Tất phản ứng thực máy luân nhiệt SureCycler 8800 (Agilent, Mỹ) Các sản phẩm PCR điện di cách sử dụng gel agarose 1% so sánh với thang chuẩn 1kb (Bioline, UK) để xác định kích thước sản phẩm khuếch đại Các sản phẩm khuếch đại PCR sau tinh cách sử dụng ISOLATE II PCR Gel Kit (Bioline, UK) sau thực phản ứng với giải trình tự BigDyeTM Terminator (Aplied Biosystems, Mỹ) Tiếp theo, sản phẩm phân tích tích máy ABI 3100 (Aplied Biosystems, Mỹ) Các trình tự DNA kiểm tra chất lượng phần mềm FinchTV (Digital World Biology Products, Mỹ), có vùng có số PHRED cao 20 sử dụng cho phân tích Các trình tự sau được cập nhật lên ngân hàng gen quốc tế (GenBank) với mã số Bảng 2.4 Phân tích số liệu Các trình tự DNA sử dụng để định danh lồi cơng cụ BLAST theo chương trình BLASTN (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Mỹ) Sau trình tự so sánh thẳng hàng phương pháp CLUSTAL phần mềm MEGA 6.0 Các kiểu thay nucleotide xác định phần mềm Cây quan hệ di truyền trình tự xây dựng dựa phương pháp bao gồm Neighbor-Joining Maximum Likelihood với giá trị bootstrap 1000 Mức độ tin cậy quan hệ di truyền đánh giá thông qua giá trị bootstrap sau: tin cậy cao (> 85%), tin cậy trung bình (70–85%), tin cậy yếu (50–69%) tin cậy (