Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này. TS. Bùi Minh Trí, ThS. Trần Nhật Phƣơng cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trƣờng đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà đã hết lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Vƣơng Hồ Vũ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến Đề tài thực hiện các nội dung sau: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. 2. Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của đoạn gen này. Kết quả đạt đƣợc 1. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng nhƣ sau: - Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% 2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tƣơng đồng 100% sau khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ . iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng . viii Danh sách các hình và biểu đồ ix 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích . 2 1.3 Yêu cầu . 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây . 3 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây . 4 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) 4 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) 5 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) . 6 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây . 8 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài 8 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học 8 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ . 8 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây . 8 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép 9 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 9 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . 9 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich . 10 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) 10 vi 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR . 10 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen 11 2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây . 12 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV 12 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV . 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV 14 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV . 15 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA . 15 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu . 16 3.3.1 Nội dung nghiên cứu . 16 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu 16 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV . 17 3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA . 17 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR 20 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV 25 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 27 4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt 27 4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA 27 4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phƣờng . 27 4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống 29 4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ . 30 4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi . 30 4.3 Kết quả RT-PCR 31 4.4 Kết quả giải trình tự . 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 37 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC . 40 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid - ctv: Cộng tác viên -ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20 - PLRV: Potato leafroll virus - p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction - PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y - VPg: Protein linked genome viii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc TP.Đà Lạt . 17 Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể . 18 Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme . 19 Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu 20 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA . 23 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA . 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống . 29 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ 30 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi . 30 Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA . 31 Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA . 32 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Hình thái của virus PVX . 5 Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX 5 Hình 2.3 Hình thái virus PVY 6 Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY 6 Hình 2.5 Hình thái virus PLRV 7 Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá 7 Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR 11 Hình 4.1 Kết quả điện di 33 Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer . 34 Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer 34 Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer . 35 Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV . 36 Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen 36 Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng 28 Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 29 Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ . 29 Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi 31 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng nhất của con ngƣời (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ). Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982). Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với các loại giống chủ yếu nhƣ 06 và 07. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây ra là hết sức cần thiết. Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện đƣợc. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng nhƣ phòng trừ bệnh virus trên khoai tây. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” [...]... Mục đích - Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA - Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT -PCR - Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT -PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này 1.3 Yêu cầu - Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phƣờng trên địa bàn thành phố Đà Lạt - Thực hiện phản ứng RT -PCR với... cứu này dựa trên sự khác biệt ở đoạn gen P1 và 5’ - UTR - Nie, Xianzhou, Singh và Rudra (2003) đã dùng kỹ thuật multiplex RT -PCR để phân biệt các chủng PVYN, PVYO và PVYNTN - Nie và Singh (2000) đã sử dụng các primer ngẫu nhiên cho multiplex RT -PCR nhằm mục đích xác định sự hiện diện của virus và viroid trong rệp, lá và củ - Singh, Kurz, Boiteau và Moore (1997) đã dùng kỹ thuật PT -PCR để xác định sự hiện... cả hai giai đoạn Kỹ thuật RT -PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng thấp, RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp khác nhƣ Northern blot Một kỹ thuật mới phát triển - kỹ thuật in situ RT -PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo... của kỹ thuật RT -PCR 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen Phƣơng pháp RT -PCR chỉ cho biết kích thƣớc của đoạn gene ta có đƣợc, cho phép xác định đoạn gene đó có tồn tại trong virus hay không nhƣng chƣa thể kết luận về bản chất của nó, cụ thể là đoạn gen đó tƣơng ứng với gene gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào, cá thể mang gene này có phải là biến thể mới không Thông tin này chỉ có thể. .. vùng Hà Tây - Các virus PVX, PVY, PMV và một số virus khác đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội Kỹ thuật ELISA đƣợc sử dụng từ năm 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995 để chẩn đóan bệnh - Tại Trung tâm Nghiên cứu khoai tây Đà Lạt chỉ mới dừng lại ở kiểm tra ELISA trên các giống do Trung tâm sản xuất 13 - Các kỹ thuật RT -PCR, giải trình... (Promega - Mỹ) - Loading dye 6X - Thang chuẩn (ladder) 100bp (Bio – Rad) - TAE 0,5X 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung nghiên cứu - Điều tra tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt thông qua việc thực hiện phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại các phƣờng - Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với virus PLRV bằng kỹ thuật RT -PCR - Giải trình... RT -PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) RT -PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch đại các phân tử RNA Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT -PCR (Reverse Transcriptase - PCR) Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA (Complement Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngƣợc từ Mo-MLV (murine leukemia virus)... tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên khoai tây từ đó xác định địa bàn tiêu biểu cần điều tra 17 - Điều tra tại các hộ nông dân có trồng khoai tây theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Đặc điểm vƣờn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 10 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo... hiện phản ứng RTPCR trên đối tƣợng virus PLRV Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT -PCR - Dƣơng tính - Trị số dƣơng tính từ máy đọc phải cao 21 - Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi) Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại thành phố Đà Lạt - Phƣờng 5: Mẫu 148 - Phƣờng 8: Mẫu 97 - Phƣờng 9: Mẫu 45 - Phƣờng... cung cấp) gồm có: - Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X) - Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) - Kháng thể + Đối với PVX và PVY dùng kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody) + Đối với PLRV dùng kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) - Dịch rửa (PBS - Tween) - Đối chứng dƣơng (Positive control) - Đối chứng âm (Negative control) - Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme . PLRV bằng kỹ thuật RT -PCR. - Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT -PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này. 1.3 Yêu cầu - Thực hiện. - 62oC, thời gian tồn tại trong ống nghiệm là 7 - 50 ngày ở nhiệt độ 18 - 22oC, hiệu giá virus từ 1 0-2 - 1 0-6 . - Với các đặc điểm trên PVY có thể