Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: Vương Hồ Vũ

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: Vương Hồ Vũ

Giáo viên hướng dẫn:

PGS TS Bùi Cách Tuyến

iii

LỜI CẢM TẠ

Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con

Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho

em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua

Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng như tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp

Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này

TS Bùi Minh Trí, ThS Trần Nhật Phương cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài

trường đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích

Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phương, chị Hưng, chị Hà đã hết lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005

Vương Hồ Vũ

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

VƯƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2005 “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Hội đồng hướng dẫn:

PGS TS Bùi Cách Tuyến

Đề tài thực hiện các nội dung sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phường (5, 8, 9, 11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA

2 Khuếch đại đoạn gene có kích thước 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR

3 Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tương đồng của đoạn gen này

Kết quả đạt được

1 Xác định được tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phường như sau: - Phường 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97%

- Phường 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phường 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phường 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phường 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% 2 Phát hiện được virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR

3 Đã giải được trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tương đồng 100% sau khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về khoai tây và bệnh trên khoai tây 3

2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 4

2.2.1 Sơ lược về virus PVX (Potato virus X) 4

2.2.2 Sơ lược về virus PVY (Potato virus Y) 5

2.2.3 Sơ lược về virus PLRV (Potato leafroll virus) 6

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cây 8

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán bên ngoài 8

2.3.2 Phương pháp sinh học 8

2.3.3 Phương pháp quang phổ 8

2.3.4 Phương pháp so sánh độ đục của dịch cây 8

2.3.5 Phương pháp chiết quang kép 9

2.3.6 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 9

2.3.7 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 9

2.3.7.1 Phương pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich 10

2.3.7.2 Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) 10

vi

2.3.8 Phương pháp RT-PCR 10

2.3.9 Phương pháp giải trình tự gen 11

2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 12

2.4.1 Nghiên cứu trong nước về virus PVX, PVY và PLRV 12

2.4.2 Nghiên cứu nước ngoài về virus PVX, PVY, PLRV 13

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu nghiên cứu 14

3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV 14

3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 15

3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA 15

3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 16

3.3.2 Phương pháp điều tra và lấy mẫu 16

3.3.3 Phương pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV 17

3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA 17

3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phương pháp RT-PCR 20

3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV 25

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt 27

4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA 27

4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phường 27

4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống 29

4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ 30

4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi 30

-dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus

- PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20

- PLRV: Potato leafroll virus

- p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid

- RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction

- PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y

- VPg: Protein linked genome

Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme 19

Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu 20

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA 23

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA 24

Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phường 28

Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV 29

Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống 29

Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ 30

Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi 30

Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA 31

Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA 32

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG

Hình 2.1 Hình thái của virus PVX 5

Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX 5

Hình 2.3 Hình thái virus PVY 6

Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY 6

Hình 2.5 Hình thái virus PLRV 7

Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá 7

Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR 11

Hình 4.1 Kết quả điện di 33

Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer 34

Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer 34

Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer 35

Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV 36

Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen 36

Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phường 28

Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 29

Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ 29

Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi 31

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan

trọng nhất của con người (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch )

Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus

khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn,

đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá Sản lượng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982)

Ở nước ta, khoai tây được trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà Lạt (chiếm 15% sản lượng) với các loại giống chủ yếu như 06 và 07 Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng như những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh virus trên khoai tây còn rất hạn chế Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đưa ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây ra là hết sức cần thiết

Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện được Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán như ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng như phòng trừ bệnh virus trên khoai tây

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự”

1.2 Mục đích

- Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA

- Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR

- Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về khoai tây và bệnh trên khoai tây

Khoai tây vừa là lương thực vừa là thực phẩm có giá trị Ở nhiều nước Âu, Mỹ, khoai tây được sử dụng như là một lương thực chính sau lúa mì: 23 - 30% sản lượng khoai tây được dùng để ăn; còn ở những nước khác như châu Á thì khoai tây được sử dụng như là một loại thực phẩm hoặc là lương thực phụ

Khoai tây có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nước Chi Lê, Pêru, Braxin, Bôlivia, trên các miền núi có khí hậu mát và ẩm Hiện nay, ở những nước này vẫn còn tìm thấy những loài khoai tây hoang dại Tuy nhiên khoai tây được trồng đầu tiên ở các nước thuộc Châu Âu Năm 1561, khoai tây được trồng sớm nhất tại Tây Ban Nha, giống lấy từ Pêru

Ở Việt Nam, khoai tây được trồng khoảng 100 năm nay (cùng với bắp cải, cà chua, cải bông) Những nơi trồng khoai tây sớm nhất là Thường Tín (Hà Đông), Từ Sơn (Hà Bắc), Tú Sơn (Hải Phòng), ngoại thành Hà Nội với sản lượng chiếm 85% sản lượng khoai tây của Việt Nam Ở Đà Lạt khoai tây được trồng quanh năm và chiếm 15% sản lượng Vấn đề quan trọng cần lưu ý trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại, đặc biệt là những bệnh do virus gây ra

Khoai tây có thể bị đơn nhiễm hoặc tạp nhiễm khoảng 30 loại virus, chủ yếu là

Luteoviruses (PLRV), Potyviruses (PVY, PVA, PVV), Potexviruses (PVX) và Carlaviruses (PVM, PVS) Khoảng 50% số virus này sống kí sinh bắt buộc trên khoai

tây, số còn lại thì có thể sống trên các loại cây khác Các virus này có tính thích nghi cao và lây nhiễm dễ dàng thông qua củ bị nhiễm cũng như các yếu tố lan truyền khác

Virus và bệnh virus là một trong những nguyên nhân ức chế sự phát triển của khoai tây dẫn đến sự giảm sút về năng suất và chất lượng Những bệnh do virus thường khó phát hiện hơn các bệnh do vi khuẩn và nấm Khi cây bị bệnh sẽ có các triệu chứng khác nhau như dạng khảm, đốm, xoắn lá, lá nhăn nheo và hoại tử

Bệnh thường gây thiệt hại nặng khi bị nhiễm nhiều loại virus cùng lúc (ví dụ năng suất có thể giảm 80% khi nhiễm cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 1982) và chịu ảnh hưởng của môi trường canh tác Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS

Khi nhiễm nhiều virus thì bên cạnh việc các virus tác động tổng hợp còn ảnh hưởng đến khả năng đề kháng với mầm bệnh khác Ví dụ: Khi đã bị nhiễm PVX và PVY trước đó thì tính kháng với PLRV giảm (Jayasinghe và ctv, 1989), tăng tính mẫn cảm với bệnh thối (Karla và ctv, 1989)

Các kết quả nghiên cứu cho thấy có khoảng trên 20 loài rệp và côn trùng có thể là

vectơ truyền bệnh virus trên khoai tây, trong đó chủ yếu là loại rệp Myzus persicae

(Watson, 1956)

2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây

2.2.1 Sơ lược về virus PVX (Potato virus X)

- Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không có vỏ

bọc, có cấu trúc xoắn đối xứng, sợi virus ngoằn ngoèo, dài 515 nm, đường kính 13 nm (Brandes, 1964) Virus này có acid nucleic là một phân tử RNA (+ssRNA: +single strand RNA) trọng lượng phân tử là 2,1*106, chiếm 6% trọng lượng virus (Huisman và ctv, 1988), chứa khoảng 6435 base, có đuôi 3’ là poly A (Huisman và ctv, 1988), phần trăm về số mole tương ứng giữa các nucleotide G, A, C và U là 22%, 32%, 24% và 22% (Knight, 1963)

- PVX có vỏ protein có trọng lượng 30.000 dalton, chiếm gần 94% trọng lượng virus (Shaw và Larson, 1962) Trọng lượng phân tử của virus là 35*106

Da (Reichmann, 1959), thể tích của hạt virus là 0,73 cm3/g, hệ số lắng 117,7 S, điểm đẳng điện PI = 4,4, thời gian sống: 40 - 60 ngày, nhiệt độ bất hoạt trong khoảng 68 - 76o

C tùy từng dòng virus PVX duy trì hoạt lực ở 20oC trong vài tuần và trong glycerol hơn một năm, bị tiêu diệt khi xử lý bằng protease, phenol hay thuốc tẩy, hiệu giá virus: 10-5

- 10-6.

- Với những đặc điểm trên, virus PVX có ký chủ giới hạn trong những cây thuộc

họ cà (Solanaceae) và một số loại cây có quan hệ thân thuộc như Amaranthaceae và

Chenopodiaceae

- Khi bị nhiễm virus PVX thì thường biểu hiện triệu chứng nhẹ, ngầm, không thấy biểu hiện trên lá hoặc không tác động rõ ràng trên cây khỏe, tạo ra những đường vằn hoặc là vết hoại tử nhăn nheo ở giữa các gân lá, có thể làm thiệt hại năng suất từ 10 – 20% tùy theo giống và phương thức lây nhiễm (chỉ nhiễm PVX hoặc tạp nhiễm các loại virus khác) Bệnh chủ yếu lây nhiễm qua tiếp xúc với cây bệnh hoặc qua củ giống chứ không do rệp Đây là điểm khác biệt giữa virus PVX với PVY và PLRV

- Các biện pháp phòng trừ như dùng củ giống sạch bệnh, đốt cây bị nhiễm, giới hạn di chuyển trong phạm vi ruộng bị nhiễm thường được sử dụng để hạn chế sự lây nhiễm của virus PVX

2.2.2 Sơ lược về virus PVY (Potato virus Y)

- Virus PVY thuộc họ Potyviridae, giống Potyvirus, gồm có ba dòng chính là

PVYO (phổ biến nhất), PVYN (gây hoại tử gân lá thuốc lá) và PVYC (gồm cả potato

virus C, gây vết sần sùi trên lá), là nhóm virus hại thực vật lớn nhất, dạng sợi, xoắn

ngoằn ngoèo, không có vỏ bọc, dài 730 nm, rộng 11 nm, đường kính 3,3 nm (Varma và ctv 1968)

- Cấu trúc acid nucleic của virus PVY là sợi đơn RNA (+ssRNA : + single strand RNA) có trọng lượng phân tử là 3,1*106 chiếm 5,4 - 6,4% trọng lượng virus (Stace-Smith và Tremaine, 1970), có đuôi 3’ là poly A, đầu 5’ có một VPg (protein liên kết với genome) Kích thước genome là 10,4 kb (Makkouk và Gumpf, 1974)

- Vỏ protein của virus PVY có trọng lượng 34.000 dalton chiếm 93,6 - 94% trọng lượng virus, hệ số lắng của virus là 145 S (Huttinga, 1975), nhiệt độ bất hoạt: 50 - 62oC, thời gian tồn tại trong ống nghiệm là 7 - 50 ngày ở nhiệt độ 18 - 22oC, hiệu giá virus từ 10-2 - 10-6

- Với các đặc điểm trên PVY có thể gây nhiễm khoảng 120 loài Trong đó có

thuốc lá, cà độc dược (Datura stramonium) và Tinantia erecta với các triệu chứng từ

nhẹ đến hoại tử lá nặng Thông thường PVYO, PVYC gây bệnh nặng hơn PVYN

- Dòng PVYN phân bố chủ yếu ở Châu Âu, Châu Phi, và Nam Mỹ gây ra các triệu chứng chủ yếu như hoại tử dạng điểm hay lan rộng ở mức độ nhẹ có thể không phát hiện được, thường xuất hiện ở giai đoạn muộn của giai đoạn phát triển (ở vụ đầu)

Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX Hình 2.1 Hình thái của virus PVX

Những triệu chứng thứ cấp có thể xuất hiện ở vụ sau khi đó triệu chứng chấm lốm đốm có thể quan sát được và thường xuất hiện sớm trong mùa

- Dòng PVYO phân bố rộng khắp trên thế giới Tùy từng loại khoai tây có thể gây ra hoại tử, chấm lốm đốm hoặc làm vàng lá non, rụng lá và chết trước khi trưởng thành Khởi đầu, hoại tử là điểm hoặc lan tỏa trên lá non, có thể làm cong lá hoặc rụng lá Triệu chứng thứ phát là cây lùn, giòn, lá nhăn nheo, nhàu nát Đôi khi hoại tử xuất hiện ở tán lá hoặc đỉnh.Virus PVYO

kết hợp với PVX gây ra hiện tượng khảm và nhăn - Dòng PVYC gây triệu chứng sơ cấp như hoại tử, lốm đốm, nhăn nheo (hoại tử thường ở cuống lá, lá, đỉnh), biểu hiện thứ cấp thường xuất hiện vệt chấm, nhăn nheo hoặc lốm đốm Hoại tử có thể xảy ra ở củ

- Để hạn chế sự thiệt hại do virus PVY gây ra, người ta đưa ra các biện pháp quản lý như sử dụng giống sạch bệnh, sử dụng giống kháng, trồng sớm và loại bỏ cây bệnh

2.2.3 Sơ lược về virus PLRV (Potato leafroll virus)

- Virus PLRV thuộc họ Luteoviridae, giống luteovirus, có dạng cầu, đường kính

24 nm, phân tử protein vỏ có trọng lượng 26 kDa (Smith và Harris, 1990) PLRV là virus RNA có mang một sợi RNA dương (+) (+ssRNA: + single strand RNA), trọng lượng 6 kDa (Rowhani và Stace Smith, 1979), có mang 1 VPg (protein liên kết với genome), không có đuôi poly A và chứa sáu khung đọc mở (ORF – Open Reading Frame) (Van Der Wilk và ctv, 1997) Những khung đọc nằm ở đầu 5’ thì mã hóa cho các protein trực tiếp từ RNA genome (Matthews, 1991) Protein VPg và một protein 70 kDa (Van Der Wilk và ctv, 1997) được mã hóa bởi khung đọc đầu tiên (ORF1) (Gorbalenya và ctv, 1989) Khung đọc thứ hai (ORF0) mã hóa cho một protein 28 kDa chưa rõ chức năng nhưng khung đọc thứ ba (ORF1/2) được cho là mã hóa cho protein 108 kDa liên quan đến sự sao chép của virus (Koonin, 1991; Mayo và Ziegler – Graff,

Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY

Hình 2.3 Hình thái virus PVY

1996) Ba trong số sáu khung đọc này nằm ở đuôi 3’ và mã hóa cho phân tử protein vỏ (CP: coat protein) 23 kDa (ORF3), protein di chuyển 17 kDa (MP (P4) - Movement protein) (ORF4 nằm trong gen mã hóa protein vỏ nhưng có khung đọc khác) (Sokolova và ctv, 1997) và một protein 56 kDa liên quan đến sự tương tác giữa virus và vectơ rệp (ORF5) (Chay và ctv, 1996) Còn hai khung đọc khác ở đuôi 3’ là ORF6 và ORF7 đã được phát hiện nhưng chưa hiểu được chức năng của chúng (Ashoub và ctv, 1998)

- Virus PLRV bị bất hoạt ở 70oC trong 10 phút, hiệu giá virus: 10-4, thời gian tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2oC và trong dịch trích từ rệp là 12 đến 24 giờ ở 25oC (Murayama), là loại virus chỉ giới hạn ở mô libe của cây (Peter và ctv, 1981; Bagnall, 1988; Lobenstein và ctv, 1997; Singh và Sing, 1997) Virus PLRV có phổ ký chủ hẹp, không lây nhiễm qua nhựa cây nhưng có thể lây nhiễm thông qua khoảng 10 loài rệp nhờ phương thức liên kết bền vững giữa virus và rệp, tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2oC, trong rệp 12 - 24 giờ ở 25oC

- Virus PLRV là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất của khoai tây, có ở hầu hết các nước trên thế giới làm giảm năng suất tới 90% Những biểu hiện triệu chứng sơ cấp gây nên bởi sự lây nhiễm ở vụ đầu trên lá như lá bị cuốn lại ở đỉnh lá đặc biệt những lá ở gốc có xu hướng ở thế thẳng đứng và chuyển màu vàng nhạt, với các giống khác lá có màu hồng, đỏ hoặc tía Sự lây nhiễm muộn có thể không rõ triệu chứng, những giống có độ nhạy cao củ bị thối ở hệ thống mạch Triệu chứng thứ cấp ở cây trồng từ củ bị nhiễm bệnh làm lá gốc cuốn tròn, thẳng đứng, cây không phát triển và lá cuốn tròn trở nên cứng Ngoài ra các biểu hiện như xoắn lá, còi cọc, hoại tử mạch libe

và ảnh hưởng đến sự tích lũy carbonhydrate trong lá cũng hiện diện trên khoai tây bị nhiễm virus PLRV Virus PLRV có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm (khẩu vị),

đây là một trường hợp ngoại lệ vì rất ít virus ảnh hưởng đến chất lượng thức ăn

- Để hạn chế những thiệt hại do nhiễm virus PLRV cần chọn cây khỏe, giống không bị nhiễm virus PLRV, nhổ bỏ cây nhiễm bệnh, phun thuốc trừ rệp, dùng giống

kháng với virus PLRV

Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá Hình 2.5 Hình thái virus PLRV

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cây

Với đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn và đòi hỏi những dụng cụ máy móc hiện đại mới thực hiện được Những phương pháp chẩn đoán bệnh virus hiện nay thường dùng là:

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán bên ngoài

* Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh

Phương pháp này đơn giản và nhanh chóng nhưng không phải lúc nào cũng chính xác, vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài, hoặc thời kỳ tiềm phục của bệnh quá dài nên khó phát hiện ngay được Một số trường hợp vết bệnh không rõ ràng

*Ngoài ra cũng có thể xem tế bào bị bệnh dưới kính hiển vi để chẩn đoán một số bệnh virus như hoa lá thuốc lá có thể nhìn dưới kính hiển vi thấy trong tế bào lông tơ lá có những tinh thể virus kết tinh hình lục giác

2.3.2 Phương pháp sinh học

* Gieo hạt để chờ khi cây mọc có phát bệnh hay không Phương pháp này thường dùng trong kiểm dịch thực vật và để kiểm tra bệnh ở hạt giống Là một phương pháp tuy đơn giản, dễ làm nhưng mất thời gian

* Dùng cây chỉ thị và lây bệnh nhân tạo

Những cây chỉ thị là những cây cùng loại hay khác loại với cây ký chủ nhưng rất nhạy cảm đối với bệnh virus và khi lây bệnh nhân tạo virus, trên cây chỉ thị tạo ra vết bệnh điển hình nhất Có thể lây bệnh nhân tạo bằng dịch cây muốn chẩn đoán lên cây chỉ thị, hoặc ghép cành, ghép mắt cây chỉ thị lên cây bệnh Để chẩn đoán bệnh virus X

và virus Y hại khoai tây người ta dùng cây chỉ thị Nicotiana glutinosa, Nicotiana

tabacum, Datura tatula, Gomphrena globosa hoặc dùng cà độc dược (Datura stramomium) làm cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh virus hoa lá thuốc lá

2.3.3 Phương pháp quang phổ

Chủ yếu dựa vào đặc điểm của virus có khả năng hấp thụ tia cực tím do virus có chứa acid nucleic

2.3.4 Phương pháp so sánh độ đục của dịch cây

So sánh độ đục của dịch cây bằng máy đo độ đục, hoặc so sánh độ nhớt của dịch cây bằng bình đo độ nhớt Phương pháp này chỉ chẩn đoán bệnh virus nói chung, và chẩn đoán tương đối đúng khi nồng độ virus trong dịch cây khá cao

2.3.5 Phương pháp chiết quang kép

Dùng kính hiển vi phân quang khảo sát dịch cây đang chảy Phương pháp này chỉ dùng đối với các virus có hình gậy, còn virus hình cầu không dùng được

2.3.6 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử

Trong nghiên cứu virus, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô thực vật bị nhiễm bệnh Người ta dùng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 2 - 3 chục ngàn lần trở lên

Phương pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết và cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử Đây là phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất

Có thể dùng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác Phương pháp này giúp ta xác định được hai virus khác nhau trong một mẫu

Người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh

2.3.7 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1 ng / ml) So với với các kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Hai kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (direct Double Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Các enzyme thường dùng là β-galactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003)

2.3.7.1 Phương pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich

Gồm các bước sau

Bước 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA

Bước 2: Cố định dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA Bước 3: Cố định kháng thể có gắn enzyme

Bước 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA

Kết quả được đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 405 nm Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4oC và cần xem vào khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl

2.3.7.2 Phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

Kỹ thuật này thường được dùng để định tính và định lượng kháng thể hiện diện trong mẫu cần xác định Gồm các bước:

Bước 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng

Bước 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào Bước 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào

Bước 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003)

2.3.8 Phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction)

RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch

đại các phân tử RNA Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên người ta sử

dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) Trước hết RNA được chuyển thành cDNA (Complement Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngược từ Mo-MLV (murine leukemia virus) hoặc AMV (avian myeloblastosis virus) Primer sử dụng trong giai đoạn này có thể là primer ngược của PCR giai đoạn sau (Antisense primer), có thể là Oligonucleotic dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ

Taq polymerase Người ta cũng có thể sử dụng Tth DNA polymerase cho cả hai giai

đoạn Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng thấp, RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phương pháp khác như Northern blot

Một kỹ thuật mới phát triển - kỹ thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các

RNA ngay trên mô và tế bào Kỹ thuật này có nguyên tắc như trên, được tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame.

2.3.9 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp RT-PCR chỉ cho biết kích thước của đoạn gene ta có được, cho phép xác định đoạn gene đó có tồn tại trong virus hay không nhưng chưa thể kết luận về bản chất của nó, cụ thể là đoạn gen đó tương ứng với gene gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào, cá thể mang gene này có phải là biến thể mới không Thông tin này chỉ có thể rút ra từ việc xác định trình tự nucleotide của gen đó

Hai phương pháp chính trong xác định trình tự là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977)

- Nguyên tắc của phương pháp hóa học dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau

- Nguyên tắc enzyme học của Sanger dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau

Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR

Ở cả hai trường hợp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách thông qua điện di trên gel polyacrylamide hay polymer trong các mao quản có khả năng phân tách hai đoạn DNA chỉ chênh lệch nhau một nucleotide Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu, kết quả trình tự cần xác định được đọc từ bản điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây

2.4.1 Nghiên cứu trong nước về virus PVX, PVY và PLRV

Những nghiên cứu về bệnh virus thực vật nói chung và trên khoai tây nói riêng ở Việt Nam ngày càng phong phú và đa dạng, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung vào việc chẩn đoán và xác định bệnh

- Năm1967 Nguyễn Hữu Thụy (Ban điều tra cơ bản côn trùng bệnh cây) đã xác định sự có mặt của virus X khoai tây

- Từ năm 1973 – 1985, Vũ Triệu Mân đã xác định 7 virus chính gây hại trên khoai tây ở Việt Nam là PVY, PVX, PVA, PVS, PVM, PAMV, PLRV bằng phương pháp cây chỉ thị, phương pháp ELISA, phương pháp hiển vi điện tử

- Các tác giả Nguyễn Viết Tùng, Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Kim Oanh đã nghiên cứu các môi giới truyền bệnh ở vùng Gia Lâm (Hà Nội) – vùng Xuân Mai (Hòa Bình) truyền bệnh virus khoai tây

- Từ năm 1980 – 1985, đề tài cấp nhà nước chống bệnh virus, đã tổ chức phòng trừ bằng chọn lọc vệ sinh cho nhiều vùng sản xuất khoai tây ở miền bắc (Hà Nam, Nam Định, Hà Bắc, Hải Dương, Hưng Yên)

- 1985 – 1992, Trường Đại học Nông Nghiệp 1 đã đề xuất việc sản xuất khoai tây giống trên vùng cách li địa hình ngay ở đồng bằng sông Hồng chống bệnh virus có hiệu quả ở vùng Hà Tây

- Các virus PVX, PVY, PMV và một số virus khác đã được nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trường Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội Kỹ thuật ELISA được sử dụng từ năm 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995 để chẩn đóan bệnh

- Tại Trung tâm Nghiên cứu khoai tây Đà Lạt chỉ mới dừng lại ở kiểm tra ELISA trên các giống do Trung tâm sản xuất

- Các kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự chưa được áp dụng phổ biến trong công tác chẩn đoán virus PLRV

2.4.2 Nghiên cứu nước ngoài về virus PVX, PVY, PLRV

- Nie và Singh (2002) đã dùng kỹ thuật RT-PCR trong việc xác định trình tự nucleotide của PVY ở Châu Âu và Bắc Mỹ (PVYNTN gây đốm hoại tử ở củ ) Thông qua nghiên cứu này, họ muốn xác định khoảng cách di truyền và phương pháp phân biệt các chủng PVY, đồng thời cũng giúp xác định những trình tự mới xuất hiện ở những vùng địa lí khác nhau do biến chủng từ PVYNTN Nghiên cứu này dựa trên sự khác biệt ở đoạn gen P1 và 5’ - UTR

- Nie, Xianzhou, Singh và Rudra (2003) đã dùng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phân biệt các chủng PVYN, PVYO và PVYNTN.

- Nie và Singh (2000) đã sử dụng các primer ngẫu nhiên cho multiplex RT-PCR nhằm mục đích xác định sự hiện diện của virus và viroid trong rệp, lá và củ

- Singh, Kurz, Boiteau và Moore (1997) đã dùng kỹ thuật PT-PCR để xác định sự hiện diện của PLRV trong rệp bắt từ ruộng khoai tây Trong nghiên cứu này 3 loại rệp

là Myzus persicae: green peach aphid; buckthorn aphid và potatoaphid Macrosiphum

euphorbiae được lấy từ ruộng cây khoai tây thương mại New Brunswick (1988-1994)

đều cho kết quả dương tính với PLRV

- Singh, Nie, Sing, Coffin và Duplessis (2002) cho rằng phản ứng RT-PCR bị ức chế bởi hợp chất phenolic từ mô cây Nghiên cứu này xác định việc bổ sung Na2SO3trong bước cho dung dịch đệm li trích RNA có thể nâng cao hiệu quả của RT-PCR Bởi vì Na2SO3 (Sodium sulphite) có khả năng ức chế hợp chất phenolic hiện diện trong quá trình ly trích RNA

- Công ty Monsanto Canada Inc đã thành công trong việc tạo ra giống khoai tây “Newleaf-plusTM Russet Burbank” với các dòng RBMT 21-129, RBMT21-350 và RBMT22-082 có khả năng kháng lại PLRV Bằng cách chuyển gen CryIIIA từ

Bacillus thuringensis và hai trình tự ORF1, ORF2 từ PLRV , quá trình chuyển gen

được thực hiện nhờ Agrobacterium

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 21 tháng 03 đến ngày 15 tháng 07 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí

Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA để phát hiện PVX, PVY và PLRV

a Nguồn mẫu thí nghiệm

Tất cả các mẫu thí nghiệm được lấy từ năm phường (5, 8, 9, 11 và 12) tại Đà Lạt, được bảo quản trong điều kiện -20oC

b Hóa chất:

Các loại hóa chất cần cho quá trình chẩn đoán được cung cấp đầy đủ trong các bộ kit Potato virus X - PVX test kit 480 test, potato virus Y - PVY test kit 480 test và potato leafroll virus - PLRV test kit 480 test (do Bio – Rad cung cấp) gồm có:

- Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X) - Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer)

- Kháng thể

+ Đối với PVX và PVY dùng kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody) + Đối với PLRV dùng kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) - Dịch rửa (PBS - Tween)

- Đối chứng dương (Positive control) - Đối chứng âm (Negative control)

- Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (Conjugate buffer) - Kháng thể gắn enzyme alkaline-phosphatase (Conjugate antibodies) - Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu

- Chất chỉ thị màu p-NPP Ngoài ra cần phải chuẩn bị - Cồn 70o

- Nước cất hai lần khử ion và hấp khử trùng

3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA

RNA được ly trích theo quy trình của kit ly trích (The Aurum total RNA mini kit ) do Bio-Rad sản xuất

Những loại hóa chất có sẵn trong kit:

- Dịch rửa nhẹ 5X (Low stringency wash solution) 20 ml - Dịch rửa mạnh (High stringency wash solution) 40 ml

- Dịch hòa tan RNA (Elution solution) 10 ml Bên cạnh đó ta phải chuẩn bị một số hóa chất sau :

- Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP) 2% - Tris-base

- β-mercaptoethanol 14,2 M - Ethanol 95 - 100%

- NaOH 0,1 M - EDTA 1M

3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR

*Giai đoạn tổng hợp cDNA

Dùng kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit) do Bio - Rad cung cấp với thành phần như sau:

- Hỗn hợp phản ứng đã pha sẵn (5X iScript Reaction Mix)100 µl Hỗn hợp này đã được trộn với primer poly T (oligo dT) và các hexamer ngẫu nhiên, chúng có khả năng bắt cặp với những RNA mục tiêu khác nhau Hỗn hợp này sẽ cho kết quả tối ưu với những sản phẩm < 1 kb

- Nước không nhiễm enzyme thủy phân nucleotide (Nuclease free water) 1,5 ml - Enzyme phiên mã ngược (iScript Reverse Transcriptase) 25 µl, là enzyme MMLV với hoạt tính RNAse H+ có độ nhạy cao hơn những enzyme có hoạt tính RNAse H- Enzyme này được bổ sung thêm chất ức chế enzyme phân hủy RNA (RNAse) Ta chỉ cần bổ sung thêm RNA và chạy theo chu trình nhiệt của kit

+ Giai đoạn thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân tử cDNA