37 Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quả thu đƣợc nhƣ Bảng 4.5 sau: Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau Loại mẫu Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%) Máu 10 3 30 Da tai 10 7 70 Mẫu máu có tỉ lệ thành công thấp hơn mẫu da tai. Các loại protein của máu chủ yếu là các phân tử hemoglobin có chứa nhóm heme (Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003). Theo Erlich nhóm này ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase ( trích dẫn bởi Lê Thị Thu Phƣơng, 2003). Do Taq polymerase bị ức chế nên phản ứng PCR có hiệu quả thấp trong việc xác định gen PRLR. 1 2 3 4 5 6 7 8 Các băng phụ chuỗi ngắn 38 Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR Ghi chú: 1, 2,3 :sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của A.L Vincent LD (ladder): 100 bp 4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các nồng độ khác nhau Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòi hỏi chi phí cao khi thao tác trên số lƣợng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ, thể tích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế nhất là rất cần thiết. Kết quả của việc cắt enzyme theo các qui trình khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 4.6 dƣới đây: Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các nồng độ cắt enzyme khác nhau Nồng độ Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ % thành công 1 10 0 0 2 10 10 100 3 10 10 100 Xử lý enzyme theo qui trình của nhà sản xuất không thành công. Sản phẩm sau khi xử lý enzyme không thấy sự phân cắt của enzyme. Đây là qui trình chuẩn yêu cầu 1000 bp 400 bp 390 bp LD 1 2 3 4 5 39 lƣợng DNA của mẫu đƣa vào tƣơng đối chính xác, lƣợng enzyme sử dụng tƣơng đối cao. Sản phẩm PCR của chúng ta sau khi thu đƣợc thể tích khoảng 25 µl, nồng độ rất khó định lƣợng, không thể đạt đến mức 1000 ng / µl . Nhƣ vậy, việc thực hiện theo qui trình này vừa không hiệu quả, vừa tốn kém. Ở qui trình 2, qui trình 3 các sản phẩm sau khi điện di cho kết quả rất tốt, các băng thể hiện rất rõ. Nhƣ vậy không có sự khác biệt giữa qui trình 2 và qui trình 3. Nhƣng vì lý do kinh tế nên chúng tôi quyết định chọn qui trình 3 sử dụng trong công tác phân tích gen thụ thể prolactin. Trong việc xử lý enzyme giới hạn này có nhiều vấn đề cần đƣợc quan tâm: Nồng độ gel dùng để điện di: Sản phẩm phân cắt enzyme là các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đối ngắn từ 50 – 121 bp. Nên chúng ta cần sử dụng nồng độ gel cao từ 2.5 – 6 %. Nếu chúng ta sử dụng nồng độ gel thấp thì các băng DNA sau khi phân cắt sẽ bị nhoè, không phân biệt rõ ràng. Trƣờng hợp cụ thể ở đây là sử dụng nồng độ gel 3.5 %, nhƣng theo các nghiên cứu về gen PRLR của Vincent thì ông sử dụng nồng độ gel 6 %.Với nồng độ gel đậm đặc nhƣ thế sẽ tạo ra kích thƣớc lổ gel nhỏ giúp cho các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ phân biệt một cách rõ ràng, nhƣng khá tốn kém. Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % LD: ladder 25 bp Các giếng 1, 2, 3, ,16 không thể phân biệt đƣợc các băng DNA Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện 1 2 3 4 LD 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LD Các băng DNA bị nhoè 40 Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình điện di. Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện cao quá sẽ làm cho các đoạn DNA di chuyển nhanh, các đoạn DNA phân tán không tập trung lại thành một băng có kích thƣớc lớn gây khó khăn trong việc xác định, phân biệt kích thƣớc của các đoạn DNA. Hiện tƣợng này chỉ đƣợc thấy rõ qua các đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 100 bp. Các nghiên cứu của tác giả A.L. Vincent thì sự xuất hiện của các băng DNA có kích thƣớc 90 bp: alen A; 110 bp: alen B sau khi phân cắt là có thể xác định đƣợc kiểu gen của heo. Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % Các giếng bỏ trống và đánh số không phải sản phẩm cắt enzyme trong khoá luận này AB, BB: Các kiểu gen PRLR 4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể Sau khi xây dựng thành công qui trình thực hiện kỹ thuật PCR và qui trình cắt enzyme hiệu quả nhất thì chúng tôi tiến hành áp dụng các kết quả đạt đƣợc vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. 110 bp AB BB LA BB BB BB LA 66 bp 25 bp 76 bp 124 bp 41 Sự hiện diện của gen thụ thể prolactin Bảng 4.7: Tỉ lệ xuất hiện của gen PRLR Số mẫu Tỉ lệ % Có sự hiện diện của gen PLRL 23 76,67 Không có sự hiện diện của gen PLRL 7 23,33 Tỉ lệ sự xuất hiện của các kiểu gen PRLR Với 30 mẫu ly trích sau khi thực hiện phản ứng PCR thì thu đƣợc 23 mẫu có sự xuất hiện gen PRLR. Xử lý 23 mẫu này với AluI theo qui trình 2 bảng 3.3 để xác định kiểu gen. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 4.8 sau: Bảng 4.8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR Kiểu gen Số mẫu Tỉ lệ, % AA 1 3,33 AB 7 23,33 BB 15 50 42 3.33 23.33 50 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 Kiểu gen Series1 Hình 4.9: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR Tỉ lệ (%) AA AB BB 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian khảo sát chúng tôi ghi nhận đƣợc các kết quả sau: Tần số xuất hiện của gen thụ thể prolactin Qua quá trình phân tích kiểm tra 30 mẫu lấy lừ 30 heo nái giống Yorkshire thì tần số xuất hiện của gen này chiếm tỉ lệ 76,67 % so với tổng số mẫu phân tích. Tỉ lệ này chiếm khá cao. Tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen AA chiếm tỉ lệ thấp nhất (3,33 %). Các heo nái có kiểu gen AA theo các báo cáo của A. L. Vincent (1998), Drogemuller (2001)…có năng suất sinh sản cao hơn các kiểu gen khác nhƣng do số mẫu phân tích chƣa đủ lớn nên không có những kết luận về mối tƣơng quan giữa năng suất sinh sản với kiểu gen AA. 5.2 Kiến nghị Đƣa kỹ thuật xét nghiệm này vào công tác di truyền và chọn giống Tiếp tục khảo sát với lƣợng mẫu lớn hơn, thu thập đầy đủ các số liệu về năng suất sinh sản của các heo nái để có cơ sở đánh giá chính xác ảnh hƣởng của gen thụ thể prolactin lên năng suất sinh sản của nái. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 1999, Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM 2. Trần Thị Dân, 2000, Bài giảng sinh lý học gia súc, khoa Chăn Nuôi - Thú Y bộ môn sinh lý, sinh hóa trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 4. PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003, Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM 5. Lê Thị Thu Phƣơng, 2003, Ứng d ụng k ỹ thuật PCR phát hiện gen thụ thể estrogen và gen halothan, LVTS khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 6. W. D. Phillips – T.J. Chilton, 1998, Sinh học - Tập 1, NXB Giáo Dục 7. Trịnh Ngọc Thu Trang, 2004, Khảo sát sức sinh sản của một số nhóm giống tại xí nghiệp lợn giống Đông Á, LVTN khoa Chăn Nuôi - Thú Y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 8. Trần Thị Thuỳ Trang, 2003, Khảo sát ảnh hưởng của gen thụ thể estrogen và gen halothan lên năng suất sinh sản của heo nái, LVTN khoa chăn nuôi thú Y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 9. Bùi Trang Việt, 2003, Giáo trình sinh học phân tử, đại học quốc gia TP. HCM khoa sinh học trƣờng ĐH KHTN. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 1. T.A. Brown, 1999, Gen clonning an introduction – Third editor, Chapman and hall, London, UK 2. C. Drogemuller, H. Hamann, and O. Distl, 2001, Cadidate gene markers for litter size in different German pigs line, J. Anim. Sci. 2001. 79: 2565 – 2570 3. S.T Nicholl, 1994, An introduction to geneticengineering, Camdridge University, UK A.M Griffin, H.G Griffin, PCR technology current innovation, CRC press, London, UK 4. A. L. Vincent, G. Evans’, T.H. Short, C.K. Tuggle, and M.F. Rothschild’, 1998, The prolactin receptor gene is asociated with increased litter size in pigs, Department of Animal Science, Iowa State University, Ames 500011 45 CÁC TRANG WEB TỪ INTERNET: http://mark.asci.ncsu.edu/nsif/00proc/islerposter.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids =12559630&dopt=Citation http://iowa.thearkdb.org/browser?objtype=reference&objopr=retrieve&species=pig&r ef_uid=582 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=2894986 . của các kiểu gen thụ thể prolactin Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen. áp dụng các kết quả đạt đƣợc vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. 110 bp AB BB LA BB BB BB LA 66 bp 25. 4.8 sau: Bảng 4. 8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR Kiểu gen Số mẫu Tỉ lệ, % AA 1 3,33 AB 7 23,33 BB 15 50 42 3.33 23.33 50 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 Kiểu gen Series1