46 MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích - yêu cầu 1 1.2.1 Mục đích 1 1.2.2 Yêu cầu 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN 3 2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorshire 3 2.1.1 Prolactin 3 2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo 3 2.1.1.2 Tác dụng của prolactin 3 2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin 4 2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin 5 2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) 6 2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA 8 2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen 10 2.2.2.1 Gen 10 2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen 10 2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker 11 2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen 11 2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật 12 2.2.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA 13 2.2.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) 13 2.2.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di 13 2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR 14 2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 14 2.3.2.1 Taq polymerase 14 2.3.2.2 Các nucleotid 15 2.3.2.3 Primer (mồi) 15 2.3.2.4 Dung dịch đệm 15 47 2.3.2.5 DNA khuôn 16 2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng 16 2.3.2.7 Nhiệt độ và pH 16 2.3.2.6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 16 2.3.2.7 Ứng dụng của PCR 18 2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP 18 2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism) 18 2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP 19 2.5 Các enzyme giới hạn 20 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT 21 3.1 Thời gian, địa điểm 21 3.1.1 Thời gian 21 3.1.2 Địa điểm 21 3.2 Đối tƣợng khảo sát 21 3.3 Nội dung thực hiện 21 3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm 21 3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.4.2.1 Thu thập mẫu 22 3.4.2.2 Ly trích DNA 23 3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế 24 3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 24 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn 24 3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai 30 4.1.1 Mẫu máu 30 4.1.1 Mẫu da tai 31 4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR 33 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau 33 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau 33 48 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau 35 4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các qui trình khác nhau 38 4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể 40 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 49 PHỤ LỤC Khối lƣợng phân tử của một số hoá chất sử dụng trong thí nghiệm Tris HCl ( pH = 8) 157.64 g / mol Na 2 EDTA 372,24 g / mol SDS 288,38 g / mol MgCl 2 .6H 2 O 203,3 g / mol KCl 74,55 g / mol NaCl 58.5 g / mol H 3 PO 4 61.81 g / mol Sodium acetat 163.1 g / mol Hoá chất cho ly trích TE 1X Tris HCl Na 2 EDTA Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ Proteinase K Phenol / chloroform / isoamyl (25:24:1) Ethanol lạnh Ethanol tuyệt đối Hoá chất dùng cho PCR Taq polymerase Primer F Primer R dNTPs PCR buffer 10X Tris HCl Hoá chất dùng cho cắt enzyme Buffer 10 X BSA (Bovine serum albumin) AluI 50 Hoá chất dùng cho điện di TBE 0.5 X 0.9 M Na 2 EDTA 20 mM Tris bazơ 0.9 M Nƣớc cất vô trùng vừa đủ Hoá chất dùng cho nhuộm gel Dung dịch ethium bromide 10 mg / ml TBE 1X Loading dye Bromophenol blue 0.25 % Sucrose 40 % TE 1X vừa đủ 100 % DANH MỤC CÁC HÌNH 51 Hình 2.1: Cơ chế tác động của prolactin tại tế bào mục tiêu 4 Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ 7 Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide 7 Hình 2.4: Sự nhân bản DNA 9 Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR 14 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % 34 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % 34 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % 36 Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % 36 Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % 37 Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR 38 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % 39 Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % 40 Hình 4.9: Tỉ lệ % xuất hiện của các kiểu gen PRLR 42 DANH MỤC CÁC BẢNG 52 Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank 6 Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA 9 Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 17 Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR 25 Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR 26 Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI 27 Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu 30 Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai 32 Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau 33 Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau 35 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau 37 Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau 37 Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các qui trình cắt enzyme khác nhau 38 Bảng 4.7: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR 41 Bảng 4.8: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR 41 . 2.3.2 .6 Số chu kỳ phản ứng 16 2.3.2.7 Nhiệt độ và pH 16 2.3.2 .6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 16 2.3.2.7 Ứng dụng của PCR 18 2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật. pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR 24 3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn 24 3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định. phản ứng PCR 33 4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau 33 4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau 33 48 4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo