Phát hiện nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral reaction

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỎNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Phát nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral reaction Số hợp đồng: 2021.01.38 Chủ nhiệm đề tài: Trần Hồng Diễm Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 01/2021 - 06/2021 TP Hồ Chí Minh, ngày i tháng năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU V CHUÔNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tống quan hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (bệnh heo tai xanh PRRS) 1.1.1 Khái quát PRRS 1.1.2 Tác nhân gây bệnh 1.1.3 Sự xâm nhiễm virus gây bệnh lợn 1.1.4 Phương pháp phát bệnh PRRS 1.2 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng xoan Polymerase spiral reaction (PSR) 1.2.1 Tống quan phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt 1.2.2 Nguyên lí hoạt động PSR CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Thời gian địa điếm 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ .7 2.3.2 Hóa chất 2.3.3 Vật liệu sinh học 2.4 Phương pháp nghiên cứu 10 2.4.1 Phương pháp xác định trình tự thành phần phản ứng PSR 10 2.4.2 Phương pháp phát trình tự đặc trưng PRRSV bàng PSR 11 2.4.3 Phương pháp đọc kết PSR 12 2.4.4 Khảo sát điều kiện phản ứng 13 2.4.4.1 Phương pháp khảo sát nhiệt độ toi ưu cho phản ứng PSR 13 2.4.4.2 Phương pháp khảo sát thời gian phản ứng PSR 14 i 2.4.5 Phương pháp khảo sát giới hạn phát phản ứng PSR 14 2.4.6 Khảo sát tính đặc hiệu mồi phản ứng PSR 15 2.4.7 Phương pháp tách chiết RNA 15 2.4.8 Phương pháp PSR trực tiếp với mẫu bệnh phẩm - mẫu huyết lợn bệnh 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Ket kiểm tra mồi thành phần phản ứng PSR 16 3.2 Kết khảo sát thời gian cho phán ứng PSR 16 3.3 Ket khảo sát nhiệt độ 18 3.4 Giới hạn phát phương pháp PSR 20 3.5 Tính đặc hiệu moi thiết kế PRRSV 21 3.6 Hoạt động PSR RNA gen tách chiết 22 3.7 Hoạt động PSR RNA diện mẫu bệnh phẩm - mẫu huyết 23 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 25 4.1 Kết luận 25 4.2 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 ỉi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TÁT CSFV Classical Swine Fever virus DNA Deoxyribonucleic acid LAMP Loop-mediated Isothermal Amplification M Membrane NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PEDV Porcine Epidemic Diarrhea virus - virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - hội chứng rối loạn sinh hô hấp sản lợn PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn qPCR Real-time - Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT-PSR Reverse transcription- RT-PCR Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction TCID50 Median Tissue Culture Infectious Dose iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉƯ, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc PRRSV Hình 1.2 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vịng xoan PSR Hình 2.1 Sơ đồ hoạt động mồi PSR 11 Hình 2.2 Màu phản ứng PSR 13 Hình 3.1 Kct kiểm tra mồi quan sát màu sắc SYBR 16 Hình 3.2 Kết khảo sát thời gian phản ứng quan sát màu sắc sau phản ứng soi SYBR 18 Hình 3.3 Ket khảo sát nhiệt độ phản ứng quan sát màu sac sau phản ứng soi SYBR 19 Hình 3.4 Kết khảo sát giới hạn phát phương pháp PSR mục tiêu dạng tổng họp 20 Hình 3.5 Kết khảo sát giới phát phương pháp PSR RNA gen PRRSV 21 Hình 3.6 Ket khảo sát tính đặc hiệu mồi thiết ke 22 Hình 3.7 Khả phát PSR mẫu RNA có nồng độ khác 23 Hình 3.8 Khả phát PSR phát trực tiếp mầu bệnh phẩm khơng tách chiết RNA Hình 4.1 Quy trình phát mẫu huyết bệnh phẩm chứa PRRSV PSR 25 Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Danh mục hoá chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu Bảng 2.5 Các trình tự sử dụng nghiên cứu 11 Bảng 2.6 Chương trình phản ứng PSR 12 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PSR 12 Bảng 3.1 Ket khảo sát thời gian ba lần lặp lại 17 iv Bảng 3.2 K.ết khảo sát nhiệt độ ba lần lặp lại 18 Hình 4.1 Quy trình phát mẫu huyết bệnh phẩm chứa PRRSV PSR 27 V TÓM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN củ u STT Kết quà đạt Cơng việc thực Phát triển, tối ưu quy trình Xác định trình tự mồi đặc trưng, khuếch đại đẳng nhiệt PSR để thành phần phản ứng, tối ưu nhiệt độ, phát xác PRRSV thời gian phản ứng Thực mẫu bệnh phẩm Quy trình PSR có khả phát trực ticp RNA virus mẫu bệnh phẩm (huyết thanh) STT Hoàn thiện báo cáo đề tài Báo cáo hoàn chỉnh Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Hoàn thành thảo Bài báo khoa học Thời gian thực hiện: Thời gian nộp báo cáo : vi MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) bệnh phức tạp nguy lợn với tỷ lệ tử vong cao bệnh làm ảnh hưởng trực tiếp đến hệ thống miễn dịch phổi kết hợp với lây nhiễm thứ cấp vi khuẩn virus gây Tại Việt Nam, đợt bùng phát PRRS với quy mô vừa nhỏ xảy hàng năm nhiều tỉnh thành, đe dọa thiệt hại kinh tế người chăn nuôi rủi ro sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, phương pháp phát bệnh chủ yếu dựa vào chẩn đốn thơng qua triệu chứng lâm sàn, bên cạnh RT-PCR là tiêu chuẩn vàng chấn đoán bệnh, nhiên RT-PCR đòi hỏi thiết bị phức tạp, đắc tiền thực mơi trường phịng thí nghiệm chuyên biệt Gần phương pháp sinh học phân tử khác phương pháp khuếch đại nhiệt vòng xoắn PSR nghiên cứu phát nhanh loại mầm bệnh PSR thừa hưởng tất ưu diem PCR độ nhạy, độ đặc hiệu đồng thời kỹ thuật đon giản dễ thực Vì đề tài “Phát nhanh virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRSV) phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Polymerase spiral reaction” thực Quy trình PSR tối ưu nghiên cứu có khả phát trình tự mục tiêu PRRSV với giới hạn phát 10O 5TClD5O/ml, phản ứng thực nhiệt độ cố định (65°C) thời gian 40 phút Đồng thời, phương pháp phát trình tự mục tiêu diện mẫu phân khơng cần q trình tách chiết RNA, đọc kết nhanh bàng mắt thường thông qua màu sắc phán ứng, điều cho thấy khả ứng dụng cao phương pháp phát nhanh bệnh chồ vii CHƯƠNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (bệnh heo tai xanh - PRRS) 1.1.1 Khái quát PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn bệnh truyền nhiễm lợn giong, lứa tuổi (lợn nái, lợn theo mẹ, lợn sau cai sữa, lợn choai, lợn thịt lợn đực giống) [1], Bệnh có tính chất lây lan nhanh gây chết nhiều lợn ghép ke phát bệnh truyền nhiễm nguy khác như: dịch tả lọn, phó thương hàn, tụ huyết tràng Đặc trưng bệnh gây sảy thai, thai chết lưu lợn nái chửa; lợn ốm có triệu chứng điển hình sốt cao 40°C, viêm phổi nặng; đặc biệt lợn cai sữa viêm phổi chết nhanh [1, 2] 1.1.2 Tác nhân gây bệnh PRRS gây Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) loại Arterivirus, họ Arteriviridae [1] Virus PRRS (PRRSV) loại virus sợi đơn dương RNA, bao bọc bên lớp vỏ có đường kính từ 50-65 nm, bồ mặt tương đoi nhằn, bên chứa nucleocapsid hình khối có đường kính từ 25-35 nm, kích thước genome khoảng 15 kb bao gồm tám khung đọc mở (ORF) [3,4] Trong ORFla ORFlb chiếm 80% genome có chức cấu thành RNA polymerase cúa virus [3, 4] Virus phát triển, tăng nhanh số lượng đại thực bào, phá hủy giết chết tế bào đại thực bào, làm suy giảm nghiêm trọng sức đề kháng lợn bệnh; tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn thứ phát gây bệnh viên phổi bệnh dịch tả lợn, suyễn, liên cầu khuân, tụ cầu khuẩn, tụ huyết trùng phát sinh, phát triển làm cho bệnh ngày trầm trọng hơn, lợn bệnh chết yếu vi khuẩn kế phát [1,2] RNA ISkDa N protein (ORF product) 24 - 26kDa E protein (ORF product) 30 - 40kDa protein (ORF product) Q 18 - 19kDa M protein (ORF product) Lipid envelope Hình 1.1 Cấu trúc PRRSV [3] 1.1.3 Sự xâm nhiễm virus gây bệnh lọn Virus PRRS sau xâm nhập vào đích cơng chúng tế bào đại thực bào phế nang (PAMs) Nó khơng tạo suy giảm miễn dịch tồn diện làm cho chế phịng vệ phổi bị tổn thương Khi đó, mầm bệnh hô hấp, phụ nhiễm dễ dàng xâm nhập vào phổi Virus PRRS sinh sản tế bào đại thực bào phế nang PAMs Virus lưu hành lâu máu (~ tuần), tồn nhiễm lâu (~ 157 ngày) Độ lây nhiễm virus PRRS cao, Sau xâm nhập vào the lợn, - tuần virus PRRS tiêu diệt khoảng 50% tế bào đại thực bào phế nang Virus gây viêm vách phế nang dần đến viêm phổi kẽ, phù thũng phổi; phoi xuất lốm đốm đỏ đến đỏ nâu Khi vách phế nang bị viêm dễ dẫn đen bệnh kế phát khác Virus PRRS xâm nhập vào máu từ theo máu đến mơ khư trú đó, virus xâm nhập vào thai gây lên sảy thai vào giai đoạn cuối, đẻ non, thai chết lưu, động dục giả, Một đàn lợn bị nhiễm virus PRRS, virus có xu hướng lưu hành vĩnh viễn, khó để trừ Kháng thể mẹ truyền không đủ để báo hộ cho lợn chống lại virus PRRS, có thời gian miền dịch ngắn 11 Notomi, T et al Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Res 28, e63 (2000) 12 Myrmel, M et al Single primer isothermal amplification (SPIA) combined with next generation sequencing provides complete bovine coronavirus genome coverage and higher sequence depth compared to sequence-independent single primer amplification (SISPA) PLoS One 12, (2017) 13 Kumar, s., Kumar, A & Venkatesan, G Isothermal Nucleic Acid Amplification System: An Update on Methods and Applications Journal of Genetics and Genomes 2, 1-5 (2018) 14 Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method I Scientific Reports [Internet], [cited 2021 Jul 6] Available from: https://www.nature.com/articles/srep 12723 30 Sản phẩm dạng 2: So’ đồ, quy trình Sơ đồ quy trình phát PRRSV PRRSV Thu thập pha loảng mẫu Mầu máu toàn phin từ lợn thu nhận li tâm thu huyết Pha loãng mẩu 50 lân Pha trộn phản ứng Pha trộn thành phần phản ứng bao gôm mồi phàn ứng, mastermix Cho mẫu vào phàn ứng ủ phàn ứng Ù phàn ứng 65°c, 40 phút Phân tích kết Quan sát thay đồi màu sắc phàn ứng Chụp hình kết quà Đưa kết quà chẩn đoán Bước 1: Chuẩn bị mẫu huyết tù’ cá thể lọn cần chẩn đoán - - 10ml mẫu máu toàn phần lợn thu vào ống falcon 15ml - Li tâm mầu 4000 g/phút, 10 phút - Thu huyết từ ống falcon (lớp màu vàng sáng cùng) - Lấy 20 pl mầu huyết thu được, pha lỗng 50 lần Bưó'c 2: Chuẩn bị hỗn họp phản ứng - Tiến hành pha hỗn hợp phản ứng bao gồm: IX LAMP warmstart mastermix (New England Biolabs, UK), 1,6 pM mồi NF 1,6 pM moi NR - Cho pl mẫu huyết pha loãng vào phản ứng Bước 3: ủ phản ứng - Phản ứng ủ máy ổn nhiệt khô 65 c 40 phút Bước 4: Đọc, phân tích kết phản ứng - Quan sát kết màu sắc phản ứng: phản ứng dương tính có màu vàng, phản ứng âm tính giữ nguyên màu hồng ban đầu - Cho pl SyBr 100X vào phản ứng, quan sát kết đèn LED bước sóng 470 nm, phản ứng dương tính phát tính hiệu huỳnh quang soi đèn - Chụp hình ghi nhận kết - Đưa kết chẩn đoán Sản phâm dạng 2: Sơ đơ, quy trình Sơ đồ quy trình phát PRRSV PRRSV Thu thập phalông mầu Mầu máu toàn phần từ lợn thu nhận li tâm thu huyết Pha loãng mẫu 50 lần Pha trộn phàn ứng Pha trộn thành phần phàn ứng bao gôm mồi phàn ứng, mastermix Cho mẫu vào phàn ứng ủ phàn ứng ủ phàn ứng 65°c, 40 phút Phân tích kết Quan sát thay đổi màu sắc phàn ứng Chụp hình kết quà Đưa kết quà chẩn đoán Bước 1: Chuẩn bị mẫu huyết từ cá thể lợn cần chẩn đốn - - 10ml mầu máu tồn phần lợn thu vào ống falcon 15ml - Li tâm mầu 4000 g/phút, 10 phút - Thu huyết từ ống falcon (lớp màu vàng sáng cùng) - Lấy 20 JJ.1 mầu huyết thu được, pha loãng 50 lần Bước 2: Chuẩn bị hỗn họp phản úng - Tiến hành pha hồn họp phản ứng bao gồm: IX LAMP warmstart mastermix (New England Biolabs, UK), 1,6 pM mồi NF 1,6 pM mồi NR - Cho pl mầu huyết pha loãng vào phản ứng Bước 3: ủ phản ứng - Phản ứng ủ máy on nhiệt khô 65 °C 40 phút Bước 4: Đọc, phân tích kết phản ứng - Quan sát kết màu sắc phản ứng: phản ứng dương tính có màu vàng, phản ứng âm tính giừ nguyên màu hồng ban đầu - Cho pl SyBr oox vào phản ứng, quan sát kết đèn LED bước sóng 460 nm, phản ứng dương tính phát tính hiệu huỳnh quang soi đèn - Chụp hình ghi nhận kết - Đưa kết chẩn đoán Xác nhận trưởng đơn vị Chủ nhiệm đề tài Trần Hồng Diễm Bàn thào bào - Trần Hồng Diễm Hộp thư đẽn X Tran Hong Diem • texusoma@gmail.com> KHCN Kinh gút ban biên tập, Em Trán Hịng Diêm, Viện Kỳ thuật cóng nghệ cao NTT, em xin gũi bân thào bá: báo, kinh nhò ban biên tập xem qua giúp em, Em xin cám on, Trân trong, Hơng Diém tệp đinh kèm □ Phìeu dang ki nop □ 2021.10.19 -THDi- Tạp chi, KHCN tói tơi ■» Ban Biên táp tap chí Khoa học cơng nghê đà nhận đuoc thõng tin Trán trọng cám cm BBT TAP CHI KHOA HỌC CÓNG NGHẸ Journal of Science and Technology 300A Nguyên TÍt Thinh, P13, Q4, TPHCM - (làu 3, P.4O7) Đt: 023.3941.00sd (E»: 185) - Fax 02S.3940.47s9 □ Ptiiev dang ki nop Xây dựng quy trình khuếch đại đắng nhiệt vòng xoắn Polymerase spiral reaction (RT-PSR) phát nhanh vi rút gây hội chúng rối loạn sinh sản hô hấp lợn - PRRSV Trần Hồng Diễm , Tran Thị Hậu, Phạm Nguyễn Minh Trang, Phùng Thị Thu Hường Viện Kĩ thuật công nghệ cao, Đại Học Nguyễn Tất Thành, phường 13, quận 4, TP Hồ Chí Minh *thdiem(ã),ntt.edu.vn Tóm tắt Hội chứng rối loạn sinh sàn hô hấp lợn (PRRS) gây bời PRRSV bệnh phức tạp nguy lợn với tỷ lệ tử vong cao Tại Việt Nam, đợt bùng phát PRRS xảy hàng năm nhiều tinh thành mối đe dọa thiệt hại kinh tế người chăn nuôi rủi ro sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, RT-PCR tiêu chuấn vàng chấn đốn PRRS, bên cạnh phương pháp sinh học phân từ khác quan tâm phát triền nham tăng cường chấn đoán bệnh nhanh xác Trong nghiên cứu này, phương pháp khuếch đại đắng nhiệt vòng xoắn (PSR) phát triển tối UU hóa nham phát nhanh chóng đặc hiệu PRRSV điều kiện đắng nhiệt, đơn giản không yêu cầu thiết bị luân nhiệt đắt tiền Quy trình PSR tối ưu nghiên cứu có khả phát trình tự mục tiêu PRRSV với giới hạn phát 10°5 TCID.so/ml, phản ứng thực nhiệt độ cố định (65 °C) thời gian 40 phút Đồng thời, kết q chấn đốn có thề đọc kết nhanh bang mắt thường thông qua màu sắc cùa phàn ứng, cho thay tiềm ứng dụng cao cúa phương pháp phát bệnh chồ Từ khóa: RT-PSR PRRSV, isothermal Abstract Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) caused by PRRSV is one of the most complicated and dangerous diseases in pigs with a high mortality rate In many provinces in Vietnam, annual PRRS outbreaks continue to threaten farmers' livelihoods and consumers' health RT-PCR is currently the gold standard for diagnosing PRRS Other molecular biology tools, on the other hand, are constantly being developed to improve the ability to diagnose diseases rapidly and accurately The isothermal spiral amplification (PSR) method was developed and optimized in this study for rapid and specific detection of PRRSV under isothermal conditions The method is simple and does not require expensive thermal cycling equipment The optimized PSR could detect PRRSV target sequence with a detection limit of 10°5 TCID50/ml and the reaction was carried out at a constant temperature (65°C) for 40 minutes Simultaneously, the diagnostic results could be immediately confirmed by the color of the reaction, demonstrating the applicability potential for point - of - care diagnosis Keywords: RT-PSR PRRSV, isothermal Tong quan Hội chứng rối loạn sinh sản hô ấp lợn (PRRS) gây Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) loại Arterivirus, họ Arteriviridae [1] Vi rút phát triển, tăng nhanh làm suy giảm nghiêm trọng sức đề kháng lợn bệnh, từ tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn vi rút khác xâm nhập gây triệu chứng nặng cho lợn [1,2] PRRS phát thơng qua triệu chứng lâm sàngg quan sát trực tiếp, nhiên, biếu bệnh thường dễ nhầm lẫn vói bệnh nguyên nhân khác xảy lợn [3] Do đó, cần kết hợp phương pháp khác chẩn đoán bệnh phát kháng bang phương pháp ELISA (Enzyme linked immonosorbent assay) [3], phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) [3], phương pháp khuếch đại axit nucleic (RT-PCR) [3], Hiện RT-PCR coi tiêu chuẩn vàng việc chấn đốn có mặt PRRSV RT-PCR có thề cho kết với độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiên, phương pháp đòi hòi máy móc đắt tiền phịng thí nghiệm đạt tiêu chuấn xét nghiệm an toàn sinh học, kỹ thuật viên có kinh nghiệm sinh học phân tử [4, 5] Chính vậy, song song với việc phát triến kít xét nghiệm RT-PCR đế tăng hiệu định lượng vi rút phịng thí nghiệm trung tâm việc phát triền phương pháp sàng lọc có khả xét nghiệm nhanh vi rút với yêu cầu tối thiểu trang thiết bị đào tạo nhân chuyên môn thực địa tuyến sở cần thiết đế bồ sung cho máy y tế dự phịng Trong phương pháp khuếch đại đảng nhiệt vòng xoắn Polymerase spiral reaction (PSR) giới thiệu vào năm 2015 thừa hưởng tất ưu điếm PCR độ nhạy độ đặc hiệu [6] PSR phương pháp nhiệt phát triến thời gian gần với nhiều ưu điếm đế phát triền quy trình phát nhanh, chồ [7] Phương pháp cần hoạt động cùa cặp mồi thiết kế đặc biệt với khả tạo vòng xoắn khuếch đại DNA mục tiêu qua chu kỳ hoạt động enzyme Bst polymerase [6], phản ứng xây nhiệt độ cố định kết quan sát trực tiếp qua việc quan sát thay đổi màu sàn phấm sau phàn ứng có diện chất chi thị màu Với với kết hợp enzyme phiên mã ngược Bst polymerase, PSR có khả phát dược RNA mục tiêu phàn ứng [7] Vì thế, nghiên cứu này, phương pháp PSR tối ưu đề phát xác trình tự RNA mục tiêu PRRSV, kết q ghi nhận trực tiếp thơng qua màu sắc phân ứng với quy trinh thực đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp Ket quà chứng minh PSR có the trở thành phương pháp hữu ích cho chẩn đốn lâm sàng Vât liêu phuừng pháp Thiết kề mồi PSR đăc hiên cho PRRSi' Dựa theo nghiên cứu trước đó, gen M lựa chọn làm gen mục tiêu phát tính ổn định độ bảo tồn cao trình tự gen PRRSV [8, 9] Trình tự mồi PSR thiết kế đặc trưng cho PRRSV thiết kế bang phần mềm PrimerExplorerV5 dựa trình tự gen PRRSV có số hiệu JX512910, trình tự mồi kiếm tra PCR insilico bang phần mềm Geneious Prime trình tự tống hợp Phù sa (Việt Nam) sử dụng làm mồi cho tất thí nghiệm nghiên cứu Trình tự gen có vị trí từ 14510 đến 14805 gen PRRSV No JX512910.2 tổng hợp bới Công ty sinh hóa Phù sa (Việt Nam) dùng làm trình tự mục tiêu cho bước đánh giá điều kiện ban đầu, đồng thời làm chứng dương cho khảo sát Trình tự mục tiêu dạng tống hợp mồi Bảng Bảng Các trình tự sứ dụng nghiên cứu Tên Trình tự 5’-3’ PRRS_PSR_F ACGATTCGTACATAGAAGTATAG-AGAAAAACCCGGAGAAGCCC GATATGAAGATACATGCTTAGCA-ATCTGACAGGGCACAAGTTCC PRRS_PSR_R GGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGCCATAGAAACCT GGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTA CATCCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCG M_gblock ATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCA CTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGG TGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCC AA Tách chiết RNA vi rút Mầu RNA vi rút cung cap bời Học viện Nông nghiệp Việt Nam tách chiết kit tách chiết RNA - QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, USA) định lượng phương pháp nuôi cấy vi rút kết hợp phương pháp RT-qPCR Mầu RNA tách chiết sau kiếm tra nồng độ độ tinh lưu trữ -80 °C để sừ dụng cho phản ứng PSR Phương pháp PSR Tất phản ứng PSR thực nghiên cứu thực với the tích cuối 15 pl Hồn hợp phán ứng gồm pl mẫu, hồn hợp mồi (1,6 pM mồi PRRS-PSR-F, 1,6 |1M PRRS-PSR-R), 7,5 |1L WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (NEB, UK) nước sinh học phân tứ Các phản ứng PSR ban đầu thực 65 °C thời gian 45 phút Ket phân ứng ghi nhận thông qua màu sắc cũa phản ứng phương pháp nhuộm huỳnh quang Theo đó, phản ứng dương thề màu sac phản ứng thay đoi từ màu hồng ban đầu sang màu vàng, màu sắc không thay đối (màu hồng) phản ứng âm Mặt khác, pl SYBR Green I dye (Thermo Fisher Scientific, USA) nồng độ 100X cho vào mồi ống sản phấm quan sát phát quang ánh sáng 460 nm Kháo sát điều kiện phản ứng Thời gian rối ưu cùa phán ứng kháo sát khoáng 5-50 phút phàn ứng, mốc cách phút Phản ứng đặt nhiệt độ 65 °C, xác định kết thông qua màu sắc phàn ứng nhuộm SYBR Nhiệt độ tối ứu cùa phán ứng PSR khảo sát khoảng nhiệt độ từ 56-67 °C, mồi móc nhiệt độ cách °C Phản ứng ủ với thời gian tối ưu trước đó, kết quà quan sát màu sắc phản ứng nhuộm SYBR Kháo sát giới hạn phát cùa phân ứng Số DNA mạch khuôn tính tốn chương trình Endmem http://endmemo.com/bio/dnacopynum.php ; 109 bàn trình tự gen M đích PRRSV dạng tổng hợp, pha loãng theo bậc 10 nồng độ cuối 10s- 10'2 bàn tiến hành thực phản ứng với điều kiện thành phần theo nghiên cứu trước Sản phẩm phân tích màu sắc sau phản ứng nhuộm SYBR Mầu RNA tách chiết từ mầu virus ni cấy có nồng độ IO5’5 TCIDs(/ml pha loãng nồng độ cuối 10 5, IO35, IO25, IO15, 1O05 10° TCIDjo/ml tiến hành thực phàn ứng với điều kiện tối ưu Sản phẩm phân tích màu sấc sau phàn ứng nhuộm SYBR Kháo sát tinh đăc hiên cũa phán ứng PSR Trong khảo sát này, RNA vi rút gây bệnh phố biến lợn với triệu chứng gây bệnh có nhiều điếm tương đồng vói PRRS (CSFV, PEDV, ASFV) vi khuẩn thông thường phố biến ngồi mơi trường sử dụng đế thực phàn ứng PSR s enterica, s aureus, p aeruginosa, L monocytogenes với thành phần điều kiện khảo sát Ket Thiết lập phán ứng PSR Các phản ứng PSR ban đầu thực nhằm kiểm tra hoạt động cùa mồi thành phần phàn ứng Phản ứng thực 2X warmstart LAMP colorimetric mastermix diện phenolred - chất thị màu cho phàn ứng Phàn ứng đặt nhiệt độ 65 °C thời gian 45 phút, kết cho thấy, màu sắc phản ứng thay đổi từ màu hồng ban đầu sang vàng mẫu dương chứa trình tự mục tiêu dạng tống hợp giữ ngun màu sắc ban đầu đối vói mẫu âm (Hình 1A) Mặt khác kết PSR với RNA tinh cùa PRRSV Hình 1B cho thấy, PSR có khả khuếch đại RNA mục tiêu, màu sắc sau phản ứng rõ nét Ket quà phản ứng đồng thời ghi nhận bang phương pháp nhuộm SYBR, theo chứng dương phát quang ánh sáng có bước sóng 460 nm chứng âm khơng tính hiệu phát quang Các kết cho thay, mồi thiết ke có khả khuếch đại thành công trinh tự mục tiêu PRRSV dạng tong hợp dạng RNA gen tách chiết, kết có thề quan sát trực tiếp bang mắt thường qua màu sắc phàn ứng có kết tương đồng với phương pháp nhuộm huỳnh quang Vì mồi chọn với thành phần phản ứng áp dụng cho khảo sát DNAgblock Trước phán ứng Sau phàn ứng I H RNA Trước phin ứng Sau phin ứng "HV— Hình Phản ứng PSR kiếm tra thành phần phàn ứng Phàn ứng ú 65 °C 45 phút, kết quà qua màu sắc soi SYBR Trong đó: A Phàn ứng với trình tự mục tiêu dạng tống họp B Phàn ứng với RNA gen PRRSV Tối ưu nhiệt thời gian cho phan ứng PSR Thời gian kéo dài phản ứng PSR định tới số lượng sản phẩm hình thành phàn ứng Trong khảo sát này, phàn ứng PSR thực khoản thời gian 5-50 phút phàn ứng Tại Hình 2, kết quà soi SYBR cho thấy, 25 phút thời gian tối thiếu đế phản ứng xảy quan sát bang huỳnh quang Bên cạnh đó, với thời gian phản ứng 40 - 50 phút, phản ứng the thay đối màu sắc rõ quan sát bang mắt thường Qua kết khảo sát, 40 phút thời gian tối thiếu để phàn ứng PSR cho kết màu kết SYBR rõ Vì thời gian 40 phút thời gian tối ưu lựa chọn áp dụng cho khảo sát Phút 15 10 20 25 30 40 35 45 50 Hình Ket khảo sát thòi gian phản ứng Phàn ứng ủ nhiệt độ 65 °C mốc thời gian từ 50 phút Ket quà bang màu sắc tính hiệu phát quang Nhiệt độ phán ứng khảo sát khoảng 56 - 67 °C Kết quã Hình cho thấy, sản phẩm PSR quan sát bang SYBR nhiệt độ 61°c, nhiên phái từ nhiệt độ 64 - 67°c, thay đổi màu sắc phán ứng thay đồi rõ nét Cùng với chi dần nhà sản xuất nghiên cứu trước (nhiệt độ tối ưu phản ứng PSR vào khoảng 60 - 65 °C), nhiệt độ 65 °C nhiệt độ tối ưu cho phàn ứng nghiên cứu này, đồng thời nhiệt độ sừ dụng cho thí nghiệm *c 56 57 53 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Hình Ket khảo sát nhiệt độ phàn ứng Phán ứng ù thời gian 40 phút nhiệt độ khác khoảng 56 - 67 °C Ket ghi nhận bang màu sắc nhuộm SYBR Giới han phát hiên cúa phương phái} PSR DNA tồng hợp ban đầu có nồng độ 109 pha lỗng theo nồng độ khoảng (107 - 10'1) thực phản ứng PSR với điều kiện tối ưu trước Ket q Hình 4A cho thấy, phản ứng PSR phát DNA tống hợp có phản ứng, kết q âm tính đoi vói phàn ứng có số lượng bàn DNA mục tiêu bé hon Đồng thời, mẫu RNA gen tách chiết từ mẫu vi rút nuôi cay, 105 TClDS0/ml pha loãng nồng độ cuối 1045 - 10° TCTD.so/ml tiến hành thực phản ứng PSR Kết Hình Hình 4B cho thấy, phàn ứng PSR tối ưu có khả phát 10°5 TClDjo/ml, kết có giá trị ngang với giới hạn phát số kit RT-qPCR chấn đoán PRRSV cỏ thị trường Điều khả phát tối ưu PSR mẫu có nồng độ vi rút thấp thời gian ú bệnh Copies 1O’ 10* lơ* lơ* lơ* lơ* lơ* 1O° lơ‘ Hình Ket khảo sát giới hạn phát cũa phản ứng PSR Phân ứng đặt nhiệt độ 65 °C thời gian 40 phút Trong đó: A Ket quà với trình tự mục tiêu dạng tống hợp, B Ket với trình tự mục tiêu RNA tách chiết từ vi rút ni cấy Tính đăc hiên cùa bơ moi thiết ke đoi với PRRSV Tính đặc hiệu moi cho PRRSV đánh giá việc thực phàn ứng PSR với chủng vi rút gây bệnh lợn với triệu chứng tương đong với PRRS bao gồm CSFV, ASFV, PEDV số vi khuẩn phố biến chuồng trại bao gồm vi khuẩn s enterica, s aureus, p aeruginosa, L monocytogenes V parahaemolyticus Ket khảo sát cho thấy phương pháp PSR tối ưu nghiên cứu phân biệt trinh tự gen mục tiêu cùa PRRSV so với vi khuẩn gần gũi, PSR khuếch đại RNA mục tiêu PRRSV có phản ứng (Hình 5) Kết quà cho thấy, mồi lựa chọn thực phương pháp PSR tối ưu có tính chun biệt cao cho PRRSV 23456789 -1 Mầu Hình Ket khảo sát tính đặc hiệu PSR Phán ứng thực nhiệt độ 65 °C 40 phút, phàn ứng quan sát bang màu sắc soi SYBR Trong (-) chứng âm khơng chứa DNA/RNA, mẫu từ 1-9 tương ứng: PRRSV, CSFV, ASFV, PEDV, s enterica, s aureus, p aeruginosa, L monocytogenes, K parahaemolyticus Hoat đông PSR đoi với RNA bô gen đươc tách chiết RNA gen PRRSV cung cấp bời Học viện nông nghiệp Việt Nam tách chiết trực tiếp từ mẫu huyết bệnh phẩm, kiểm tra xác nhận bang phương pháp RT-qPCR RNA dùng đe làm mạch khuôn cho phương pháp PSR Kết cho thay, phương pháp PSR tối ưu nghiên cứu có khả phát RNA gen PRRS (Hình 6) 10 mầu RNA tách chiết có nồng độ khác nhau, mẫu RNA tách chiết từ huyết thương mại, không chứa vi rút cho kết q âm tính (Hình 6, 11-13) Quan sát màu phàn ứng cho thay thay đối màu sắc từ hồng sang vàng phàn ứng chứa RNA mục tiêu, màu phàn ứng giữ nguyên phản ứng âm Ket đồng soi chất nhuộm SYBR Mẩu - + 34 678 10 11 12 13 Hình Khã phát cùa PSR đối vói mẫu RNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác Trong đó: (-) mẫu âm không chứa trinh tự mục tiêu, (+) mẫu dương chưa trinh tự mục tiêu dạng tống hợp, (1-10) mẫu RNA PRRSV tách chiết từ mẫu huyết bệnh phấm khác nhau, (11-13) mầu tách chiết từ mẫu huyết thương mại không chứa RNA PRRSV Thảo luận Từ trước đến nay, thịt lợn sản phẩm thịt quan trọng hàng đầu ngành chăn ni Việt Nam, the mà nhiễm PRRSV trở thành mối quan tâm lớn khả lây nhiễm gây nên tỷ lệ từ vong cao lợn Hiện tại, việc kiếm soát lây nhiễm PRRSV phụ thuộc vào việc xác định sớm để ngăn chặn lây lan thêm cũa vi rút Do đó, việc phát triển phương pháp chẩn đốn đơn giãn nhanh chóng cho PRRSV vơ quan trọng Bên cạnh đỏ, phương pháp phát xác bệnh đòi hòi trang thiết bị đắc tiền mơi trường chun biệt, chúng khơng thích hợp đế phát PRRSV chỗ phịng thí nghiệm trang bị Trong nghiên cứu này, phương pháp PSR với cặp mồi đặc hiệu gen M thực tối ưu thành cơng phát xác PRRSV thời gian 40 phút nhiệt độ cố định (65 °C) Với kết hợp cùa enzyme phiên mã ngược có phàn ứng hoạt động thay the mạch cùa enzyme Bst DNA polymerase, RNA mục tiêu khuếch đại đặc hiệu xác thời gian ngan, đồng thời mồi lựa chọn có tính chun biệt cao so với chúng vi rút gây bệnh lợn, vốn dễ nhầm lẫn với PRRSV xét dấu hiệu lâm sàng ban đầu Với quy trình tối ưu nghiên cứu, PSR có khả phát trình tự mục tiêu PRRSV nồng độ copy trình tự dạng tống hợp 10°5 TCID50/ml đối vói RNA gen tinh Đây nghiên cứu phát triển phương pháp phát PRRSV bang phương pháp PSR quan sát kết trực tiếp bang mắt thường thông qua chất chi thị màu phenolred Việc phát xác RNA mục tiêu tách chiết từ mẫu bệnh phẩm PRRSV cho thấy khả ứng dụng cao cùa phương pháp cho chan đoán lâm sàng phương pháp tiềm cho việc phát triến kít chân đốn nhanh chồ Lịi cảm