xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh Staphyloccous aureus kháng kháng sinh (MRSA) bằng kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt vòng xoắn Polymerase Spiral Reaction (PSR)

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẮP co SỞ NĂM 2020 -2021 Tên đề tài: Xây dựng phương pháp chấn đoán nhanh Staphylococcus aureus kháng kháng sinh Methicilin kỳ thuật khuếch đại đắng nhiệt vòng xoắn Sổ hợp đồng: 2020.01.172 Chủ nhiệm đề tài: Tiến sĩ Vũ Quang Hiếu Đơn vị công tác: Viện Kỳ Thuật Công Nghệ Cao, Đại Học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 09/2020 - 06/2021 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 20 tháng 05 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐÀU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẮT MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus SCCmec: Staphylococcal Cassette Chromosome mec PBP: Penicillin-Binding Protein PSR: Polymerase Spiral Reaction PCR: Polymerase Chain Reaction LAMP: Loop-mediated isothermal amplification MCDA: Multiple Cross Displacement Amplification CPA: Chirped Pulse Amplification HA-MRSA: Healthcare-associated MRSA CA-MRSA: Community-associated MRSA PBPs: Penicillin-Binding Proteins CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide PCI: Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) EDTA: Ethylenediamine Triacetic Acid TBE: Tris-Borate-EDTA TSB: Tryptone Soya Broth TSA: Tryptic Soy Agar MSA: Mannitol Salt Agar rpm: revolutions per minute OD: Optical Density DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ minh họa vị trí gen mecA vùng SCCmec Hình 1.2 Sơ đo minh họa chế kháng methicillin nhờ gen mecA cùa MRSA 10 Hình 1.3 Sơ đo minh họa nguyên tắc bàn cùa phàn ứng PSR 13 Hình 2.1 Hình thái aureus môi trường MSA 17 Hình 2.1 Sơ đo minh họa vị trí hoạt động cùa cặp mồi phàn ứng PSR 18 Hình 3.1 Ket quà điện di sàn phấm PCR với cặp primer Fl+Nr/Rl+N 25 Hình 3.2 Phồ đọc kết giải trinh tự từ primer xuôi Bioedit 26 Hình 3.3 Phồ đọc kết giải trình tự từ primer ngược Bioedit 27 Hình 3.4 Kết quà giống cột thẳng hàng Seaview 27 Hình 3.5 Ket quà điện di sản phấm PCR với cặp primer F2/R2 28 Hình 3.6 Kết quà kiểm tra thành phần phản ứng PSR 29 Hình 3.7 Ket quà kháo sát nhiệt độ phản ứng PSR 30 Hình 3.8 Ket quà kháo sát thời gian phản ứng PSR 32 Hình 3.9 Ket quà kháo sát nồng độ primer quan sát bang mắt thường 33 Hình 3.10 Ket khảo sát giới hạn phát DNA tách chiết 35 Hình 3.11 Ket khảo sát giới hạn phát tế bào vi khuẩn 36 Hình 4.12 Ket khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu cùa kỳ thuật PSR 37 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cửu STT Kết qủa đạt Công việc thực Nội dung 1: Xác định thiết kế trinh tự mồi sử dụng cho việc khuếch Trình tự mồi đặc hiệu cho gen MecA đại gen mecA Nội dung 2: Tối ưu hố điều Tìm điều kiện toi ưu cho phản kiện phàn ứng PSR bao gồm khảo sát ứng nhiệt độ, thời gian phàn ứng nồng độ mồi phản ứng Nội dung 3: Khảo sát giới hạn Tìm giới hạn phát phát phàn ứng PSR DNA tách chiết tế bào vi khuẩn STT Sản phẩm đăng ký Bài báo đăng tạp chí Sản phẩm đạt Đã hồn thành thảo, nộp vào tạp chí KHCN ĐH Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 09/2021 - 06/2021 Thời gian nộp báo cáo : MỞ ĐÀU Nghiên cứu tiến hành để xây dựng quy trinh phát nhanh gen mecA s aureus kỹ thuật PSR (Polymerase Spiral Reaction) Nội dung nghiên cứu bao gồm phần Thứ thiết kế cặp primer sử dụng cho phán ứng PSR đặc hiệu với trinh tự gen mecA aureus Thứ hai tối ưu hóa phàn ứng PSR việc khảo sát nhiệt độ phàn ứng từ 55 - 68°c (cách 1°C), khảo sát thời gian phàn ứng từ 30 - 65 phút (cách phút) khảo sát nong độ primer phù hợp cho phàn ứng thông qua thay đổi tỳ lệ nồng độ primer Fl+Nr/Rl+N từ 0,4 - 3,2 ,uM; nồng độ primer F2/R2 từ 0,05 - 0,4 pM Thứ ba xác định giới hạn phát DNA tách chiết tế bào vi khuẩn cùa phàn úng Ket cùa nghiên cứu đà xác định quy trinh tối ưu cùa phản ứng PSR có nhiệt độ 65°c 50 phút, với nồng độ tối ưu primer Fl+Nr/Rl+N 1,6 pM nong độ tối ưu primer F2/R2 0,1 pM Giới hạn phát DNA tách chiết 10'3 ng/pl giới hạn phát tế bào vi khuẩn tế bào vi khuẩn Từ khóa: Staphylococcus aureus, PSR, gen mecA CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Staphylococcus aureus kháng methicillin 1.1.1 Staphylococcus aureus kháng methicillin gì? Staphylococcus aureus kháng methicillin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, viết tat MRSA) chùng tụ cầu vàng có khả đề kháng với kháng sinh phố biến bao gồm penicillin, methicillin, oxacillin số kháng sinh khác, chúng xem “siêu vi khuẩn” (Groves ctv, 1994) Theo WHO, MRSA chia thành nhóm HA-MRSA (Healthcare-associated MRSA), CAMRSA (Community-associated MRSA) LA-MRSA (Livestock-acquired) Trong đó, LA-MRSA chùng MRSA liên quan đen vật ni, chúng lây truyền giừa động vật người Các chủng HAMRSA có xu hướng kháng với nhiều loại kháng sinh, có khã gây nhiễm khuẩn nặng lan tràn bệnh viện Trong đó, hầu hết chùng cộng dong CA-MRSA nhạy với kháng sinh khơng thuộc nhóm p-lactam thường chi gây nhiễm khuẩn da, mô mềm người trẻ, khỏe mạnh Tuy nhiên, CA-MRSA có khả sàn xuất độc tố Panton-Valentine gây hại cho tế bào miền dịch (Diep ctv, 2006) 1.1.2 Lịch sử phát Theo báo cáo Tạp chí Y học Anh (1961), giáo sư Patricia Jevons đà quan sát trình ni cấy MRSA phịng thí nghiệm Colindale London Năm 1968, trường họp nhiễm MRSA ghi nhận bệnh viện thành phố Boston Mỳ lan rộng khắp the giới (Barrett ctv, 1968) Năm 1981, phân lập MRSA lần đầu báo cáo Canada (Low ctv, 1981) Tỷ lệ tăng từ 0,46/1000 ca năm 1995 lên 5,9/1000 ca năm 2004 (Goetghebeur ctv, 2007) Trong nghiên cứu khảo sát 48 bệnh viện Canada vào năm 2006, kết quà cho thấy 11.700/29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng 1.1.3 Khả gây bệnh Các bệnh nhiễm trùng khu trú da niêm mạc mụn nhọt, áp xe, eczema Nhiễm tụ cầu da thường gặp trè em người suy giám hệ miễn dịch Tùy thuộc vào độc lực vi khuẩn đề kháng cũa the mà mức độ nhiễm khuấn nặng hay nhẹ (Nguyền Đồ Phúc, 2013) Nhiễm khuẩn huyết bệnh nhiễm khuẩn toàn thân, chù yếu aureus gây Từ nhiễm khuẩn da, vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết Ngồi ra, s aureus cịn vào quan khác gây nên O áp xe (tủy, gan, não, phoi), viêm nội tâm mạc viêm tắc tĩnh mạch Theo Lê Thị Thu Nguyệt Chu Thị Hồng Ngọc (2016), nghiên cứu khoa hồi sức tích cực Bệnh viện Thanh Nhàn cho thấy trung bình 7,62 ngày có bệnh nhân xuất nhiễm khuẩn huyết, chù yếu độ tuối 50 80 tuối, nhiễm trùng huyết s aureus chiếm 20% Ngồi ra, aureus cịn gây hội chứng nghiêm trọng hội chứng da phồng rộp (scalded skin syndrome) thường gặp trẻ sơ sinh trẻ nhó, gây viêm da hoại tử phồng rộp Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome) thường gặp phụ nữ trè kỳ kinh nguyệt sữ dụng băng không đàm bão vệ sinh Một số loại băng thấm có khã gan với ion magnesium, dần đến làm giảm lượng ion âm đạo phụ nừ Nhờ đó, vi khuẩn tăng cường sản xuất ngoại độc tố gây sốc Ngồi ra, cịn có hội chúng Thukydides xuất thiếu niên cá hai giới, thường gặp bội nhiễm tụ cầu sau bị cúm Hội chứng đặc biệt cùa hội chứng sốc nhiễm độc với tỷ lệ từ vong cao (>50%) (Nguyễn Đồ Phúc, 2013) Ngộ độc thực phẩm độc tố ruột cùa tụ cầu ben với nhiệt tụ cầu cư trú ruột chiếm ưu the Ngộ độc thức ăn tụ cầu vàng gây viêm dày ruột, viêm ruột non viêm đại tràng Theo thống kê từ năm 2010 đen tháng 11 năm 2018, địa bàn TP Ho Chí Minh xày 54 vụ ngộ độc thực phẩm, có 14 vụ ngộ độc tụ cầu 1.2 Giói thiệu gen mecA Gen mecA mà hóa protein gắn penicillin 2a (PBP-2a) có khối lượng phân từ 78 kDa (Utsui Yokota, 1985) Theo Katayama ctv (2000), gen mecA nằm yếu tố di truyền gọi Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCC/nec) SCCmec gọi “vùng kháng kháng sinh” di chuyển khịi gắn vào nhiễm sắc tụ cầu vàng nhờ hoạt động cùa enzyme tái tổ họp Vi vậy, tiếp họp chuyển từ tụ cầu vàng kháng thuốc sang tụ cầu vàng nhạy thuốc (Ray ctv, 2016) Theo Hiramatsu (1995), 90% trường họp lâm sàng kháng methicillin chùng tụ cầu có đặc điểm chung mang gen mecA nhiễm sắc thể cùa chúng SCCmec chromosome Hình 1.2 Sơ đồ minh họa vị trí gen rnecA vùng SCCmec (Palavecino, 2014) Thông thường methicillin gan với PBP-2, protein cần thiết cho sinh tống họp màng tế bào, từ ngăn cản hình thành liên kết chéo peptidoglycan, làm cho màng tế bào vi khuẩn bị ly giãi Tuy nhiên, gen MRSA có mang gen mecA mà hóa cho PBP-2a Protein có lực thấp với methicillin nên có diện methicillin MRSA có the sinh tống họp màng tế bào (Hartman Tomasz, 1984) Tóm lại, chế kháng methicillin cùa s aureus diện cùa gen mecA mã hóa PBP-2a, từ việc tống hợp thành tế bào vi khuẩn vần diễn bình thường diện cùa methicillin Hình 1.3 Sơ đồ minh họa chế kháng methicillin nhờ gen mecA cùa MRSA (Chang ctv, 2019) 1.3 Tình hình nghiên cứu phát MRSA Việt Nam giói 1.3.1 Trên giói Trước tình hình lan rộng tồn cầu cùa MRSA, nhiều nghiên cứu thực với mục tiêu phát nhanh MRSA Trước đây, Coudron ctv (1986), Hindler Warner (1987), Mouton ctv (1989), họ đà thực thành cơng phương pháp sàng lọc đìa thạch với oxacillin đe phát MRSA Moriki ctv (1995), Pillai ctv (2012) đà thành công việc phát nhanh MRSA bang kỳ thuật PCR khuếch đại trình tự gen mecA Vannuffel ctv (1995) đà sừ dụng phương pháp Multiplex PCR đế phát MRSA phân biệt s aureus với tụ cầu khác dựa vào gen mecA gen femA Keams ctv (1999) thành công việc sử dụng kỳ thuật Multiplex PCR để phát gen mà hóa coagulase gen mecA chủng tụ cầu 10 Anand ctv (2009) tiến hành nghiên cứu so sánh xét nghiệm khuếch tán đĩa cefoxitin, sàng lọc đìa thạch với oxacillin PCR dựa vào trình tự gen mecA để phát MRSA Kết quà cho thấy xét nghiệm khuếch tán đìa cefoxitin tương thích với kết kỳ thuật PCR khuếch đại gen mecA Kimura ctv (2009) nghiên cứu giới hạn phát MRSA dựa vào kỳ thuật Real-time PCR Sumitani (2010) nghiên cứu đánh giá khà phát nhanh MRSA bang Multiplex Real-time PCR trực tiếp từ cấy máu dương tính Hầu hết nghiên cứu gần phát MRSA thường sừ dụng kỳ thuật LAMP để khuếch đại đoạn gen đặc trưng cùa MRSA, đặc biệt gen mecA Misawa ctv (2007), Koide ctv (2010) sử dụng kỳ thuật LAMP đế khuếch đại gen spa gen mecA Wang ctv (2014) nghiên cứu phát nhanh MRSA kỳ thuật LAMP dựa vào gen nuc gen mecA Tương tự, Nawattanapaiboon ctv (2016) thực nghiên cứu phát nhanh gen rnecA NzfemB cùa s aureus Các nghiên cứu khuếch đại thành công gen mục tiêu nhiệt độ dao động từ 62 - 65°c, khoáng thời gian 60 phút, đáp ứng mục tiêu phát MRSA thời gian ngắn 1.3.2 Tại Việt Nam Tại Việt Nam, tỷ lệ MRSA ngày tăng cao gây nhiều khó khăn cho y bác sĩ việc điều trị Theo thống kê nghiên cứu, thừ nghiệm với mầu bệnh phấm lấy từ số bệnh viện nước ta từ năm 2004 đến 2006, cho thấy 654 chúng s aureus phân lập tỳ lệ CA-MRSA 30,1% Trong đó, tỷ lệ HA-MRSA 74,1% số 147 chùng s aureus phân lập (Song ctv, 2011) Như vậy, việc phát MRSA cần thiết để kiểm sốt lây lan có biện pháp điều trị thích hợp Theo Quyết định số 1539/QĐ-BYT Bộ trường Bộ Y tế Việt Nam ban hành ngày 20/4/2017, phương pháp sinh hóa sừ dụng xét nghiệm phát MRSA bệnh viện Trong nghiên cứu trước đây, việc phát MRSA yếu sử dụng kỳ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp kháng sinh khuếch tán (Kirby-Bauer), có nghiên cứu trội cùa Phùng Thị Thường Phan Nữ Đài Trang Trong nghiên cứu xác định tính nhạy cảm kháng sinh cùa aureus 293 chủng s aureus phân lập từ mầu bệnh phẩm Khoa Sinh học Lâm sàng, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh từ 12/2012 đến 2/2015 đà xác định 49,7% chúng MRSA (Phan Nừ Đài Trang ctv, 2016) Phùng Thị Thường ctv (2019) phát 48 chùng MRSA (chiếm 45,7%) 105 chùng s aureus phân lập từ mầu bệnh phẩm nhiềm khuẩn huyết bệnh viện Bạch Mai từ 10/2013 đến 6/2014 Ngoài ra, cịn có số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tứ đế phát MRSA kỳ thuật PCR, Multiplex Real-time PCR Năm 2011, Bùi Minh Giao Long sữ dụng phương pháp KirbyBauer kết hợp với kỳ thuật PCR khuếch đại trình tự gen mecA đế phát MRSA Gần nghiên cứu sừ dụng kỳ thuật Multiplex Real-time PCR để phát MRSA xác định yếu to SCCmec IIV cùa chúng thực phấm (Vương Xuân Vân ctv, 2019) 11 cặp primer Fl+Nr/Rl+N F2/R2 thành phần phàn ứng PSR sử dụng cho khảo sát 3.1.5 Tối ưu hóa phản ứng PSR 3.1.5.1 Khảo sát nhiệt độ Trong nghiên cứu này, nhiệt độ phản ứng PSR khảo sát khoảng nhiệt độ 55 - 68°c, mồi khoảng cách rc Hồn hợp phàn ứng đặt máy PCR thiết lập mức nhiệt độ tương ứng ủ thời gian 60 phút 55 56 57 58 59 60 61 62 63 b) M 55 56 57 58 59 60 61 62 64 65 66 68 < w > W 63 64 65 66 68 ị 200 bp-^ c) Hình 3.13 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát ánh sáng xanh có bơ sung SYBR Green, c) Quan sát băng điện di gel agarose Trong đó: (M) Ladder ỉ kb; (55 - 68) sán phâm PSR lân lượt nhiệt độ 55 68°C; (-) đối chứng âm Kết quà từ Hình 3.13 cho thấy khoảng nhiệt độ từ 64 - 68°c, phàn ứng có xãy khuếch đại gen mục tiêu Khi quan sát trực tiếp mắt thường cho thấy khoảng nhiệt độ 64 - 68°c có thay đồi màu sắc so với đối chứng âm, màu phản ứng chuyền từ màu hồng sang màu vàng (Hình 3.13a) Ket lần nừa xác nhận bo sung SYBR Green, xuất màu xanh đặc trưng khoảng 30 nhiệt độ 64 - 68°c (Hình 3.13b) soi ánh sáng xanh chứng tở có diện DNA mạch đôi với số lượng lớn sau phàn ứng Đồng thời, Hình 3.13c thể kết điện di sàn phẩm PSR gel agarose 1,5% cho kết quà tương tự Đặc biệt, kết quà điện di nhiệt độ 65°c cho band sáng rô nhất, cho thấy nhiệt độ khuếch đại đạt hiệu suất cao Từ kết quà trên, rút kết luận nhiệt độ tối ưu cùa phàn ứng PSR khuếch đại gen rnecA 65°c nhiệt độ sè sứ dụng cho thí nghiệm khảo sát 31 3.1.5.2 Khảo sát thời gian Hình 3.14 Kêt khảo sát thời gian phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát ảnh sảng xanh có bo sung SYBR Green, c) Quan sát điện di gel agarose Trong đó: (M) Ladder 100 bp; (30 - 65) sán phâm PSR lân lượt sau 30 phút, 35 phút, 40 phút, 45 phút, 50 phút, 55 phút, 60 phút, 65 phút; (-) đối chứng âm Thời gian phàn ứng PSR khảo sát khoảng 30 - 65 phút, mồi khoáng cách phút Hồn hợp phán ứng đặt máy ú nhiệt nhiệt độ 65°c Khi quan sát mắt thường thấy có thay đổi màu sắc rò ràng từ 45 phút trở (Hỉnh 3.14a) Ket quà chụp ánh sáng xanh với 32 SYBR Green cho thấy sau 30 phút đà có sản phấm khuếch đại, thể bới xuất màu xanh đặc trưng khác với màu cùa đối chứng âm (Hình 3.14b) Quan sát kết điện di sàn phấm PSR Hình 3.14c, cho thấy sau 30 phút, 35 phút chĩ xuất vệt smear mờ, chứng tị phàn ứng xãy chưa hồn tồn nên số lượng sán phẩm khuếch đại cịn Từ 40 - 65 phút xuất vệt smear với band sáng rô Đặc biệt, kết quà điện di sau 50 phút cho kết band điện di rô ràng, cho thấy 50 phút thời gian ngắn mà khuếch đại đạt hiệu suất cao Vì vậy, thời gian tối ưu phán ứng PSR 50 phút thời gian sữ dụng cho thí nghiệm khảo sát 3.1.5.3 Kháo sát nồng độ printer Trong nghiên cứu này, cặp primer Fl+Nr/Rl+N kháo sát khoảng nồng độ 0,4 - 3,2 pM, cặp primer F2/R2 khảo sát khoảng nồng độ 0,05 - 0,4 pM Phàn ứng ù nhiệt độ 65°c 50 phút Hình 3.15 Kết khảo sát nồng độ primer quan sát mắt thường Trong đó: (1 - 25) sản phãm PSR tương ứng với nghiệm thức Bảng 2.8 Bảng 3.11 Kết khảo sát nồng độ primer F2/R2 (pM) — Fl+Nr/Rl+N(pM) 0,4 0,05 2,4 3,2 - 1,6 + + + 0,8 0,1 - + - + + 0,2 + + - + + 0,3 + + - + + 0,4 + + - + + (+): thê phản ứng xảy 33 (-): thể phàn ứng không xáy Từ kết quà Hình 3.15, 25 nghiệm thức màu phàn ứng nghiệm thúc tương ứng với nồng độ primer F2/R2 0,1 ụM nong độ primer Fl+Nr/Rl+N 1,6 pM cho kết quà thay đoi màu sắc rô ràng Điều chứng tở nồng độ primer phàn úng khuếch đại đạt hiệu q Vì vậy, primer F2/R2 có nồng độ 0,1 pM primer Fl+Nr/Rl+N có nồng độ 1,6 pM nồng độ primer tối ưu phàn ứng sừ dụng cho thí nghiệm khảo sát 3.1.6 Giói hạn phát phản ứng PSR 3.1.6.1 Giới hạn phát DNA tách chiết Nồng độ DNA ban đầu cùa mầu ATCC 33592 64,93 ng/pl, DNA pha loãng theo bậc 10 liên tiếp nồng độ - 10’5 ng/ul kháo sát giới hạn phát DNA tách chiết nồng độ pha loãng tương ứng với điều kiện đà tối ưu trước 101 10 10‘3 10~4 10'5 a) 101 10'2 10'3 104 10'5 Hình 3.16 Kêt khảo sát giới hạn phát DNA tách chiêt a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát ánh sảng xanh có bơ sung SYBR Green Trong đó: (-) đôi chứng 34 âm; (1 - 10 s) sán phẩm PSR tương ứng với nồng độ DNA pha loãng 1, 10'1, 10~s, 1O'S, 10'4, 1O'S ng/pl Ket quà quan sát trực tiếp bang mắt thường Hình 3.lóa cho thấy thay đối màu sắc diền nồng độ 1, 10'1, 10'2, 10'3 ng/pl Tại nồng độ DNA IO-4 ng/pl, 1O'5 ng/pl màu sắc phàn ứng không thay đổi, vần giữ nguyên màu hồng Đồng thời, quan sát với SYBR Green the Hỉnh 3.16b cho kết quà tương tự, xuất màu xanh sáng nồng độ DNA từ - 10‘3 ng/pl nồng độ DNA 10’4 ng/pl, 10'5 ng/ụl thỉ có màu giống với màu cùa đối chứng âm Từ kết quà trên, chúng tở từ nong độ DNA 10‘4 trở không xãy khuếch đại sản phẩm Từ kết luận nồng độ DNA 10’3 ng/pl nồng độ DNA thấp phát gen mục tiêu 3.1.6.2 Giới hạn phát tế bào vi khuẩn Bằng phương pháp đem khuẩn lạc, xác định số lượng tế bào vi khuẩn 1O8 tế bào vi khuấn (xem phụ lục 2) Tiến hành pha loãng với nồng độ tế bào vi khuẩn tương ứng 5x1 o5 - tế bào vi khuấn/pl Khảo sát giới hạn phát tế bào vi khuẩn mức độ pha loãng với điều kiện tối ưu trước 5xlO5 5xlO5 1O5 105 5xl04 5xlO3 5xlO25X1O1 5x10° 5xl04 5xlO3 5xl02 5X101 5x10° Hình 3.17 Kêt khảo sát giới hạn phát tê bào vi khuân, a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát ảnh sảng xanh có bơ sung SYBR Green Trong đó: (-) đơi chửng âm; (5x10s, 10s, 5x1 o4, 5x10s, 5x10s, 5x1 o', 5x10°, 1) sản phẩm PSR ticơng ứng với nồng độ tế bào vi khuẩn 5x10s, 10s, 5xl04, 5x10s, 5x10s, 5XỈ01, 5x10°, tế bào vi khuẩn/pl Kết quan sát trực tiếp mắt thường Hình 3.17a cho thấy có thay đối màu sắc phàn ứng xày nồng độ pha loãng 5x1 o5 - tế bào vi khuẩn/pl, thực phản ứng với tế bào 35 vi khuẩn/pl màu sắc phán ứng vần giữ nguyên màu hồng Đồng thời, quan sát với SYBR Green Hình 3.17b, cho thấy chì nồng độ tế bào vi khuẩn 5x1 o5 - tế bào vi khuẩn/pl phát sáng ánh sáng xanh Từ kết luận tế bào vi khuẩn/pl nồng độ tế bào vi khuẩn thấp mà phương pháp PSR phát gen mục tiêu 3.1.7 Khảo sát độ đặc hiệu độ nhạy kỹ thuật PSR Thực phàn ứng PSR đồng loạt với 25 mầu DNA tách chiết từ loài vi khuân Trong đó, có mầu dương tính 17 mầu âm tính với gen mecA xác định phương pháp PCR kết hợp với kiếm tra sinh hóa Trong tống số 17 mầu âm tính, có mầu DNA tách chiết từ loài vi khuân khác Streptococcus pyogenes, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus subtilis, Vibrio cholera, Enterococcus faecali, Escherichia coll Thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu, độ nhạy cùa kỳ thuật PSR thực với đối chứng dương ATCC 33592 đối chứng âm nước khử ion - 12345 + 17 10 18 11 19 12 20 13 21 14 22 678 15 23 16 24 25 Hình 3.18 Kết khảo sát độ nhạy độ đặc hiệu kỳ thuật PSR Trong đó: (1 - 25) thứ tự mẫu liệt kê Báng (xem phụ lục 3) 36 Bảng 3.12 Kết độ nhạy độ đặc hiệu kỳ thuật PSR Kỳ thuật PSR PCR kết họp kiếm tra sinh hóa Tổng Dương tỉnh Âm tính 8 17 17 Tổng 17 25 Chi số Se = 100% Sp = 100% Dương tính , Am tính Se (Sensitivity): độ nhạy, Sp (Specificity): độ đặc hiệu Kết q khào sát Hình 3.18 cho thấy có thay đối màu sắc từ màu hồng chuyển sang màu vàng mầu dương tính khơng có thay đối màu 17 mầu âm tính Từ cho thấy kết quà cùa phàn ứng PSR tương đồng với kết xác định PCR kiếm tra sinh hóa Ket tống hợp Bàng 3.12 cho thấy nghiên cứu này, độ nhạy độ đặc hiệu cua kỳ thuật PSR 100% 3.2 Thảo luận Đặc trưng cùa phương pháp PSR khuếch đại DNA điều kiện đẳng nhiệt, nhiệt độ phù họp cho phàn ứng dao động từ 50 - 70°C Ket khảo sát nhiệt độ cùa phản ứng PSR cho thấy nhiệt độ 65°c khuếch đại đạt hiệu suất cao Đây nhiệt độ thích hợp de primer gắn vào mạch khn, đồng thời nhiệt độ mà enzyme Bst DNA polymerase hoạt động tốt Theo Ji ctv (2019), nhiệt độ tối ưu cho việc khuếch đại PCV3 phàn ứng PSR 62°c Điều cho thấy khơng có chênh lệch lớn so với nhiệt độ tối ưu khuếch đại gen niecA nghiên cứu Phương pháp PSR khuếch đại gen mục tiêu nhiệt độ nhất, khác với phương pháp PCR phải trài qua giai đoạn nhiệt độ khác Trong điều kiện sở vật chất tối giãn vùng sâu, vùng xa thỉ phương pháp PSR lựa chọn phù hợp cho việc phát tác nhân gây bệnh Thời gian tối ưu nghiên cứu 50 phút, thời gian ngắn mà khuếch đại xày hồn tồn Trong đó, thí nghiệm khuếch đại gen mecA phương pháp PCR truyền thống khống 90 - 120 phút Ngồi ra, thời gian tối ưu để khuếch đại gen mecA phương pháp LAMP 60 phút (Nawattanapaiboon ctv, 2016; Wang ctv, 2014) Từ cho thấy thời gian phát gen mục tiêu phương pháp PSR nghiên cứu ngắn so với phương pháp khác Trong phán ứng PSR, primer không hoạt động riêng lẻ phàn ứng PCR mà chúng kết hợp với để bắt cặp với đoạn gen mục tiêu khuếch tạo bàn Do đó, thay đối nồng độ hay tỷ lệ cặp primer có ánh hưởng đến khâ khuếch đại sàn phẩm phàn ứng Phương pháp PSR chì sử dụng - primer, phương pháp LAMP phải sữ dụng 4-6 primer nên việc thiết kế primer cho phàn ứng PSR đơn giản Đồng thời, phương pháp PSR hạn chế xảy trường hợp primer-dimer phàn ứng LAMP 37 Giới hạn phát tế bào vi khuấn cùa phàn ứng PSR tế bào vi khuấn/pl, nồng độ tế bào vi khuấn thấp mà phàn ứng PSR phát gen mục tiêu Đối với DNA tách chiết, giới hạn phát phàn ứng PSR 10’3 ng/pl (tương ứng với pg/pl) Trong đó, giới hạn phát phàn ứng LAMP cho gen mecA 14,7 pg/pl (Wang ctv, 2014) 10 pg/pl (Nawattanapaiboon ctv, 2016) Điều cho thấy phàn ứng PSR phát gen mục tiêu nghiên cứu ngưỡng thấp ngưỡng phát phàn ứng LAMP Tóm lại, việc phát gen mecA s aureus phương pháp PSR có nhiều ưu điềm vượt trội so với phương pháp PCR phương pháp LAMP thời gian phát ngắn, quy trinh đơn giàn, độ nhạy độ đặc hiệu cao Trong điều kiện phòng xét nghiệm đơn giàn, khơng có đầy đù trang thiết bị thi xét nghiệm phương pháp PSR triền khai kết quâ khà thi, bão đảm phát nhanh, xác MRSA đế lựa chọn kháng sinh phù hợp cho việc điều trị 38 CHƯƠNG KẾT LƯẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Bộ primer thiết kế nghiên cứu hoạt động tốt, có tính đặc hiệu cao với gen mecA aureus Ket quà nghiên cứu hoàn thiện quy trình phát nhanh gen mecA s aureus kỳ thuật PSR, với nhiệt độ 65°c 50 phút, nồng độ tối ưu primer Fl+Nr/Rl+N 1,6 pM primer F2/R2 0,1 pM Giới hạn phát cùa phương pháp PSR DNA tách chiết 10’3 ng/pl giới hạn phát tế bào vi khuẩn tế bào vi khuẩn Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp PSR nghiên cứu 100% Phương pháp PSR đáp ứng yêu cầu phát nhanh xác gen mecẢ vi khuẩn S' aureus, từ có thê chọn làm công cụ để phát ca bệnh nhiễm trùng MRSA 4.2 Đề nghị Thử nghiệm với mầu bệnh phấm bệnh viện Phát trien kít phát nhanh MRSA phương pháp PSR Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Minh Giao Long, Lý Trọng Minh, Trân Cát Đông 2011 Khâo sát đê kháng kháng sinh cũa sô chúng Staphylococci phân lập từ mơi trường bệnh viện Tạp chí Y học Thành phố Hồ chí Minh 15: 164 - 169 Lê Thị Thu Nguyệt, Chu Thị Hồng Ngọc 2016 Nghiên cứu tỷ lệ mắc số yếu tố liên quan bệnh nhân nhiêm khuân máu bệnh viện khoa Hơi sức tích cực bệnh viện Thanh Nhàn từ 2014 đến 2015 Tạp chí Y học dự phòng 26: 138 Phan Nữ Đài Trang, Vũ Lê Ngọc Lan, Uông Nguyễn Đức Ninh, Cao Hữu Nghĩa 2016 Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh gen quy định độc tô exfoliative toxins chùng Staphylococcus aureus phân lập Viện Pasteur TP HCM Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 19: 15-23 Phùng Thị Thường, Đặng Văn Xuyên, Đoàn Mai Phương, Nguyễn Thái Sơn 2019 Nghiên cứu nịng độ ức chê tơi thiêu cùa vancomycin với chùng Staphylococcus aureus phân lập từ bệnh nhân nhiêm khuân huyêt bệnh viện Bạch Mai Tạp Chí Nghiên cứu Và Thực hành Nhi Khoa 3: 56 - 63 Vương Xuân Vân, Nguyền Thị Nguyệt, Nguyễn Văn Trí, Đỗ Huy Nhật Minh, Trần Thị Thúy Hăng, Cao Hữu Nghĩa 2019 Xây dựng quy trình Multiplex Real Time PCR phát Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) xác định yêu tô SCCmec cùa MRSA thực phàm Tạp chí Y học dự phịng 29: 205 Nguyễn Đơ Phúc 2013 Staphylococcus aureus Tạp chí Y tế công cộng Tiếng Anh Anand K., Agrawal p., Kumar s., and K Kapila 2009 Comparison of cefoxitin disc diffusion test, oxacillin screen agar, and PCR for mecA gene for detection of MRSA In: Indian Journal of Medical Microbiology, pp 27-29 Barrett F.F., McGehee R.F., and M Finland 1968 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus at Boston City Hospital New England Journal ofMedicine 279: 441-448 Chang Y.W., Huang W.C., Lin C.Y., Wang W.H., Hung L.C., and Y.H Chen 2019 Tellimagrandin II, A Type of Plant Polyphenol Extracted from Trapa bispinosa Inhibits Antibiotic Resistance of Drug-Resistant Staphylococcus aureus International Journal of Molecular Sciences 20: 5790 10 Coudron P.E., Jones D.L., Dalton H.P., and G.L Archer 1986 Evaluation of laboratory tests for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Journal of Clinical Microbiology 24: 764-769 11 Diep B.A., Gill S.R., Chang R.F., Phan T.H Van, Chen J.H., Davidson M.G., Lin F., Lin J., Carleton H.A., Mongodin E.F., Sensabaugh G.F., and Perdreau-F Remington 2006 Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus Lancet 367: 731-739 12 Gardam, M A 2000 Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus an emerging community pathogen? A review of the literature In Canadian Journal of Infectious Diseases, Pulsus Group Inc, pp 202-211 40 13 Goetghebeur, M., Landry, P.A., Han, D., and Vicente, c 2007 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: A public health issue with economic consequences In: Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology, pp 27-34 14 Groves p., Searle M.S., Mackay J.P., and D.H Williams 1994 The structure of an asymmetric dimer relevant to the mode of action of the glycopeptide antibiotics Structure 2: 747-754 15 Hartman B J and A Tomasz 1984 Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus Journal of Bacteriolog 158: 513-516 16 Hindler J.A., and N.L Warner 1987 Effect of source of Mueller-Hinton agar on detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus using a screening methodology Journal of Clinical Microbiology 25: 734-735 17 Hiramatsu K 1995 Molecular Evolution of MRSA Microbiology and Immunology 39: 531-543 18 Jevons, M p 1961 “Celbenin” - resistant Staphylococci In: British Medical Journal, pp 124 19 Ji J., Xu X., Wang X., Zuo K., Li z„ Leng c„ Kan Y„ Yao L., and Y Bi 2019 Novel polymerase spiral reaction assay for the visible molecular detection of porcine circovirus type BMC Veterinary Research 15: 322 20 Katayama Y., Ito T and K Hiramatsu 2000 A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus Antimicrobial Agents and chemotherapy 44: 1549-1555 21 Kearns A.M., Seiders R.R., Wheeler J., Freeman R., and M Steward 1999 Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococci by multiplex PCR Journal of Hospital Infection 43: 33-37 22 Kimura T., Komori T., Hirose Y., Kurahashi s., Yamada Y., Kyotani N., Yuasa s ichi, and N Fujita 2010 Evaluation of MRSA rapid detection by real-time PCR directly from positive blood cultures Kansenshõgaku Zasshi The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases 84: 199-205 23 Klevens R.M., Morrison M.A., Nadle J., Petit s., Gershman K., Ray s., Harrison L.H., Lynfield R., Dumyati G., Townes J.M., Craig A.S., Zell E.R., Fosheim G.E., McDougal L.K., Carey R.B., and S.K Fridkin 2007 Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States Journal of the American Medical Association 298: 1763-1771 24 Koide Y., Maeda H., Yamabe K., Naruishi K., Yamamoto T., Kokeguchi s., and s Takashiba 2010 Rapid detection of mecA and spa by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method Letters in Applied Microbiology 50: 386-392 25 Kõck, R., Becker, K., Cookson, B., van Gemert-Pijnen, J.E., Harbarth, s., Kluytmans, J., Mielke, M., Peters, G., Skov, R.L., Struelens, M.J., Tacconelli, E., Torné, A.N., Witte, w., and Friedrich, A.w 2010 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): Burden of disease and control challenges in Europe In Eurosurveillance, pp 19688 26 Liu w., Dong D., Yang z., Zou D., Chen z., Yuan J., and L Huang 2015 Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method Scientific Reports 5: 12723 27 Minas K., Mcewan N.R., Newbold C.J., and K.p Scott 2011 Optimization of a highthroughput CTAB-based protocol for the extraction of qPCR-grade DNA from rumen fluid, plant and bacterial pure cultures FEMS Microbiology Letters 325:162-169 41 28 Misawa Y., Yoshida A., Saito R., Yoshida H., Okuzumi K., Ito N., Okada M., Moriya K., and K Koike 2007 Application of loop-mediated isothermal amplification technique to rapid and direct detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in blood cultures Journal of Infection and Chemotherapy 13: 134-140 29 Moriki s., Iwata Y., Ishikura H., J Endo 1995 Detection of heterogeneous MRSA by using the PCR method and population analysis The Japanese journal of clinical pathology 43: 487-492 30 Mouton R.P., Mulders S.L.T., de Knijff J., and J Hermans 1989 Comparison of test systems for recognition of methicillin resistance in Staphylococcus aureus European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 8: 968-973 31 Nawattanapaiboon K., Prombun p., Santanirand p., Vongsakulyanon A., Srikhirin T., Sutapun B., and w Kiatpathomchai 2016 Hemoculture and Direct sputum Detection of /MecJ-Mediated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Combination With a Lateral-Flow Dipstick Journal of Clinical Laboratory Analysis 30: 760-767 32 Palavecino E.L 2014 Rapid methods for detection of MRSA in clinical specimens Methods in Molecular Biology 1085: 71-83 33 Pillai M.M., Latha R., and G Sarkar 2012 Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction and Conventional Methods: A Comparative Study Journal ofLaboratory Physicians 4: 083-088 34 Ray M.D., Boundy s., and G.L Archer 2016 Transfer of the methicillin resistance genomic island among staphylococci by conjugation Molecular Microbiology 100: 675-685 35 Song J.H., Hsueh P.R., Chung D.R., Ko K.S., Kang C.I., Peck K.R., Yeom J.S., Kim S.W., Chang H.H., Kim Y.S., Jung S.I., Son J.S., Man-Kit So T., Lalitha M.K., Yang Y., Huang S.G., Wang H., Lu Ọ., Carlos C.C., p Hung Van 2011 Spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus between the community and the hospitals in Asian countries: An ANSORP study Journal ofAntimicrobial Chemotherapy 66: 1061-1069 36 Sumitani, Y 2010 Detection limits of a rapid MRSA detection assay based on multiplex real-time PCR Journal ofInfection and chemotherapy 16: 223 37 Utsui, Y and Yokota, T 1985 Role of an Altered Penicillin-Binding Protein in Methicillinand Cephem-Resistant Staphylococcus aureus In: Antimicrobial agents and chemotherapy, pp 397-403 38 Vannuffel, p., Gigi, J., Ezzedine, H., Vandercam, B., Delmee, M., Wauters, G., and Gala, J.L 1995 Specific Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus Species by Multiplex PCR In: Journal of clinical microbiology, pp 2864-2867 39 Wang X.R., Wu L.F., Wang Y„ Ma Y.Y., Chen F.H., and H.L Ou 2014 Rapid Detection of Staphylococcus aureus by Loop-Mediated Isothermal Amplification Applied Biochemistry and Biotechnology XIS' 882-891 Internet 40 Nhà xuất Y học Hà Nội (2017), “Bộ Y te hướng dần thực hành kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng” 41 “Superbug infections climbing in Canadian hospitals: report I CBC News.” https://www.cbc.ca/news/canada/superbug-infections-climbing-in-canadian-hospitals-report1.699179 42 “Cành báo ve thù phạm gây vụ ngộ độc tập the” http://cand.com.vn/y-te/Canh-baove-thu-pham-gay-ra-cac-vu-ngo-doc-tap-the-524598/ 42 43 PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM SẢN PHÀM DẠNG (hình ảnh sản phẩm đạt ) SẢN PHÀM DẠNG 2: (quy trình, sơ đồ, bảng vè, sở dừ liệu ) SẢN PHÀM DẠNG 3: (toàn văn báo, sách chuyên khảo ) SẢN PHẦM ĐÀO TẠO: gồm hồ sơ sau - Quyết định hướng dần sinh viên (hoặc giấy xác nhận Ban chủ nhiệm Khoa) - Biên họp hội đồng luận văn sinh viên (có the tên sinh viên, giảng viên hướng dần, tên đề tài, kết quả) 44 ... ngày 20/4/2017, phương pháp sinh hóa sừ dụng xét nghiệm phát MRSA bệnh viện Trong nghiên cứu trước đây, việc phát MRSA yếu sử dụng kỳ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp kháng sinh khuếch tán (Kirby-Bauer),... Displacement Amplification) khuếch đại acid nucleic điều kiện đăng nhiệt Phản úng PSR thực nhiệt độ 61 - 65°c với độ nhanh, nhạy xác cao PSR khác với kỳ thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác chi sừ dụng... (2019), nhiệt độ tối ưu cho việc khuếch đại PCV3 phàn ứng PSR 62°c Điều cho thấy khơng có chênh lệch lớn so với nhiệt độ tối ưu khuếch đại gen niecA nghiên cứu Phương pháp PSR khuếch đại gen