chẩn đoán nhanh virus mumps gây bệnh quai bị bằng kỹ thuật real time rt pcr trên vùng gene sh

Phát hiện tác nhân gây bệnh virus bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR được thực hiện cho ra kết quả nhanh, độ chính xác cao và đã được áp dụng bởi một số tác giả như Kazue Uchida và cộng sự 2

TỔNG QUAN

Sơ lược về bệnh quai bị

Theo (WHO) bệnh quai bị là một bệnh lây nhiễm do virus xảy ra ở người, ảnh hưởng chủ yếu đến các tuyến nước bọt Bệnh xảy ra chủ yếu ở trẻ em từ 5-9 tuổi, virus quai bị cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn, trong đó có các biến chứng nguy hiểm như viêm não, viêm màng não, viêm tinh hoàn và một số di chứng thần kinh vĩnh viễn [43], [44].

Quai bị do virus mumps, là virus có vật chất di truyền là RNA thuộc Rubulavirus họ paramyxoviridae gây nên Cho đến nay chỉ mới ghi nhận được virus này gây nhiễm trên người, mà con đường lây lan qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp qua đường hô hấp và có trong không khí do hắt hơi từ đường hô hấp trên của bệnh nhân

Virus sẽ xuất hiện trong tuyến nước bọt sau 5 ngày tính từ khi bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng Sau một tuần, số lượng virus giảm đáng kể Trong nước tiểu, virus có thể tồn tại vài tuần

Bệnh quai bị xảy ra quanh năm, nhưng tỷ lệ mắc bệnh cao hơn vào cuối mùa đông và đầu mùa xuân

Theo thống kê của (WHO) tỷ lệ mắc bệnh quai bị hàng năm ở hầu hết các nơi trên thế giới trong khoảng 100-1000/100000 dân, với những đợt dịch lớn xảy ra mỗi 2-5 năm một lần

1.1.3 Tình hình quai bị ở Việt Nam [28]

Bệnh quai bị phân bố rộng trên toàn cầu Tuy nhiên, tỷ lệ mắc cao hơn ở những vùng dân cư đông đúc, đời sống thấp kém, vùng khí hậu ôn đới, tập trung cao hơn ở các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên Việc tiêm vắc xin dự phòng chưa phổ cập rộng rãi nên tỷ lệ mắc hàng năm gần như không giảm đi trong vòng 10 năm gần đây Bệnh quai bị lưu hành rộng rãi ở 100% tỉnh thành toàn quốc Tỷ lệ mắc bệnh quai bị trung bình trong 5 năm là 28,37/10 5 dân, có xu hướng tăng dần lên từ 28,98 (năm 2006) tới 39,34 (năm 2010), trong đó khu vực Tây Nguyên có tỷ lệ mắc cao nhất

(51,20) và miền Nam thấp nhất (12,39) Tỷ lệ tử vong do quai bị trung bình trong 5 năm là 0,0058 Bệnh quai bị xuất hiện quanh năm, có số mắc cao nhất trong khoảng tháng 4 tới tháng 6 Dựa trên đường phân bố ca mắc trung bình 5 năm, đã xác định đường “ngưỡng dịch” quai bị của 63 tỉnh cả nước với giá trị ngưỡng cao nhất là 301,9/10 5 dân/năm (tỉnh Lào Cai) và thấp nhất là 1,26/10 5 dân/năm (tỉnh Hậu Giang) [46]

1.1.4 Triệu chứng của quai bị

Người bị quai bị sẽ có thời gian ủ bệnh trong vòng 2 - 3 tuần, thông thường vào khoảng 17 - 18 ngày Trong thời gian này, người bệnh không có biểu hiện gì rõ rệt (30 tới 40% trường hợp nhiễm quai bị không có triệu chứng lâm sàng và đó là nguồn lây khó tránh nhất [44]) Sau đó, người bệnh có biểu hiện sốt 38 o C, đau cổ họng, người mệt mỏi, chán ăn, có thể đau tuyến nước bọt dưới hàm hoặc dưới lưỡi, đau khi há miệng hoặc khi nuốt, tuyến mang tai sưng to kèm đau nhức ở một bên, lan dần sang tuyến mang tai bên kia và sưng to đến khoảng 1 tuần thì từ từ nhỏ lại [26], [44], [45]

1.1.5 Biến chứng của quai bị

Bệnh quai bị ở người lớn tuy ít gặp, nhưng thường nặng và có nhiều biến chứng hơn ở trẻ em và các trẻ em trong lứa tuổi đang dậy thì Có thể gặp các biến chứng sau: Viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn: Biến chứng này có tỷ lệ 20-35% ở người sau tuổi dậy thì mắc phải, khoảng 50% số trường hợp tinh hoàn teo dần và có thể dẫn đến tình trạng giảm số lượng tinh trùng và vô sinh [26], [29]

Nhồi máu phổi: Là biến chứng có thể xảy ra sau viêm tinh hoàn do quai bị vì hậu quả của khối huyết từ tĩnh mạch tuyến tiền liệt [26]

Viêm buồng trứng: Có tỷ lệ mắc phải là 7% ở nữ, sau tuổi dậy thì, ít khi dẫn đến vô sinh

Viêm tụy: Có tỷ lệ mắc phải là 3% - 7% [26], là một biểu hiện nặng của quai bị Bệnh nhân bị đau bụng nhiều, buồn nôn, có khi tụt huyết áp

Các tổn thương thần kinh: Viêm não có tỷ lệ mắc phải là 0,5% Tổn thương thần kinh sọ não dẫn đến điếc, giảm thị lực, viêm tủy sống cắt ngang, viêm đa rễ thần kinh [26]

Bệnh quai bị ở phụ nữ có thai: Những phụ nữ bị quai bị trong 3 tháng đầu của thai kỳ có thể gây sẩy thai với tỷ lệ 25% hoặc sinh con dị dạng [26] Trong 3 tháng cuối của thai kỳ có thể sinh non hoặc thai chết lưu

Một số biến chứng khác: Viêm cơ tim, viêm tuyến giáp, viêm tuyến lệ, viêm thần kinh thị giác (gây giảm thị lực tạm thời), viêm thanh khí phế quản, viêm phổi, rối loạn chức năng gan, xuất huyết do giảm tiểu cầu [26]

Hiện nay, chưa có một loại thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh quai bị [26], [31] chỉ có thể phòng bệnh bằng vắc xin Vắc xin phòng bệnh quai bị thường kết hợp với phòng sởi và rubella (Trimovax, MMR) [31]

Vắc xin phòng bệnh quai bị có tác dụng kích thích cho trẻ em sản sinh kháng thể kháng quai bị, kháng thể đạt mức độ cao nhất sau khi tiêm chủng 6 – 7 tuần

Ngoài ra còn phòng bệnh quai bị thụ động với globulin miễn dịch, dùng cho người tiếp xúc với virus quai bị mà chưa được tiêm vắc xin trước đó [44]

Hiện nay, các phương pháp chuẩn đoán bệnh quai bị được thực hiện với một số xét nghiệm tiêu biểu như:

Test ELISA: Nguyên tắc dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Dùng kháng nguyên để phát hiện kháng thể quai bị trong máu hoặc dịch não tủy

Miễn dịch huỳnh quang: Phát hiện nhanh kháng nguyên virus trong tế bào họng - thanh quản

Sơ lược về virus Mumps gây bệnh quai bị

Virus mumps gây bệnh quai bị thuộc chi Rubulavirus, họ Paramyxoviridae, phân họ paramyxovirinae, bộ Mononegavirales, ssRNA negative-strand viruses, ssRNA viruses, Viruses [37].

1.2.1.1 Cấu tạo chung Đa hình thái có vỏ ngoài với các gai, đường kính 150 nm

Gồm có 7 protein chính : Nucleocapsid (N), Phospho (P), Membrane (M), Fusion (F), Small Hydrophobic (SH), Hemagglutinin-Neurominidase (HN) và Large (L ) protein [17].

Nucleocapsid xoắn gồm 2 RNA mạch đơn (-) và 3 protein liên quan là N, L và P Protein L, P : tham gia vào hoạt tính của RNA-polymerase phụ thuộc vào RNA Protein N : là Proteincapside bao quanh genome

Protein F, HN : là 2 glycoprotein bề mặt, là các gai nằm trên mặt vỏ ngoài Protein

HN giúp virus bám vào thụ thể bề mặt tế bào chủ Protein F giúp vỏ ngoài virus dung hợp với màng sinh chất của tế bào, đưa nucleocapsid vào bên trong tế bào, làm tan hồng cầu

Protein M : được phân bố dọc theo màng sinh chất của tế bào để tiến hành lắp ráp virion [48]

Bộ gene có dạng thẳng chiều dài 16-20 Kb, khối lượng phân tử 5-7x10 6 dalton

Bộ gene của virus là RNA sợi đơn có chứa bảy gene mã hóa các protein: Nucleocapsid (N), Phospho (P), Membrane (M), Fusion (F), Small Hydrophobic (SH), Hemagglutinin-Neurominidase (HN) và Large (L ) protein [17].

Hình 1.2 :Bộ gene virus mumps [4]

Gene có chiều dài lớn nhất là gene L (6786 nucleotides), HN (1749nts), NP

(1650nts), F (1617nts) V/P (1174nts), M (1128nts), SH (316nts) [4]

(A) Hình ảnh virus mumps được chụp bằng kính hiển vi

Lớp vỏ ngoài là pleomorphic có kích thước khoảng 100–600 nm

1.2.1.3 Sự nhân lên của virus [47]

- Hấp thụ và xâm nhập

Virus gắn gai HN vào thụ thể bề mặt (sialic acid) của tế bào chủ ở pH trung tính

Protein F được protease của tế bào chủ cắt và cho phép dung hợp với màng tế bào để đưa nucleocapsid vào tế bào chất

Protein M gắn vào protein N, ức chế tổng hợp mRNA, được thực hiện trước khi phiên mã sớm

Các gene tách biệt nhau nhờ trình tự ngắn nằm giữa các gen gọi tắt là ICS (short intercistronic nucleotide sequences)

Các sản phẩm của các gene chồng lớp và tiếp đó là các sản phẩm của các gene dùng trong điều hoà chu trình nhân lên

Phiên mã tiến hành bắt đầu tại đầu 3’ và kết thúc khi thêm đuôi poly (A) vào gene đầu tiên

Số lượng bản sao mRNA nhiều hay ít tuỳ thuộc vào sự tái khởi động phiên mã Phiên mã hết gene này rồi đến gene khác rồi quay lại tái khởi đầu phiên mã để được các protein của virus

Tiến hành tổng hợp protein từ mRNA trong tế bào chất

Protein F và HN cài vào màng mạng lưới nội chất, hình thành bọng rồi chuyển đến gắn vào màng tế bào

Protein M liên kết với protein gai trong màng tế bào chất

Protein NP phong bế vị trí khỏi đầu và ICS cho phép bắt đầu phiên mã sợi RNA

Từ sợi RNA (-) làm khuôn để tổng hợp genome RNA

RNA mới sinh lại làm khuôn để tổng hợp mRNA

RNA liên kết với các protein NP, P và L để tạo cấu trúc lõi

- Lắp ráp và giải phóng

Protein NP gắn vào vị trí đặc hiệu bao quanh RNA tạo nucleocapsid nảy chồi ra ngoài

Các protein (HN) cắt acid sialic nằm trên bề mặt tế bào cho phép virus thoát khỏi tế bào.

Gene SH-gene mục tiêu

Gene SH mã hóa cho protein màng type 1 gồm 57 acid amin được cho là để ngăn chặn quá trình chết theo chu trình trong tế bào bị nhiễm bệnh [17], là khu vực biến động nhất của bộ gene virus [21] Do sự đa dạng giữa các chủng khác nhau, gene

SH đã được sử dụng như một dấu hiệu để phân loại các chủng virus quai bị [21] Cho đến nay, có 12 kiểu gene (geneotype) A, B, C, D, F, G, H, I, J, K, L, N (geneotype: là các kiểu khác biệt cấu trúc gene của các sinh vật cùng loài dựa vào sự khác biệt các đặc trưng trên bộ gene của vi sinh vật đó [36]) đã được đề xuất dựa trên sự đa dạng trong gene SH [9], [10], [25]

Hình 1.4: Sự phân chia kiểu gene (geneotype) của virus mumps theo khu vực

Dựa vào hình 1.4 thì phần lớn virus mumps ở Việt Nam chủ yếu thuộc kiểu gene G Theo những nghiên cứu trước tôi đã thu thập được đại diện là Rebecca H và cộng sự (2007) trong bài báo:“Detection of RNA of Mumps Virus during an Outbreak in a

Population with a High Level of Measles, Mumps, and Rubella Vaccine Coverage” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [19], Watson-Creed và cộng sự

(2006) trong bài báo: “Two successive outbreaks of mumps in Nova Scotia among vaccinated adolescents and young adults” được đăng trên tạp chí CMAJ [24], Jin và cộng sự (2004) trong bài báo: “Genetic diversity of mumps virus in oral fluid specimens: application to mumps epidemiological study” được đăng trên tạp chí J Infect Dis[11], Boddicker và cộng sự (2007) trong bài báo: “Real-time reverse transcription-PCR assay for detection of mumps virus RNA in clinical specimens” được đăng trên tạp chí J Clin Microbiol [2]…đều sử dụng gene SH làm gene mục tiêu để phát hiện virus mumps vì gene SH có sự đa dạng giữa các kiểu gene khác nhau, là gene đặc trưng của bộ gene virus mumps và là khu vực biến động nhất của bộ gene virus, do đó trong đề tài này tôi sử dụng gene SH genotype G (chủ yếu xuất hiện ở châu Á, Việt Nam [42]) làm gene mục tiêu để thực hiện.

Tổng quan về Real-time RT-PCR

Là phương pháp PCR chuyển đổi RNA thành cDNA.Trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (Reverse transcription) thành cDNA rồi sau đó sẽ dùng phương pháp PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này

Enzyme được sử dụng trong giai đoạn phiên mã ngược là Reverse transcriptase được tách chiết từ Moloney murine leukermia virus (M-MLV), hay từ A vian myeloblastosis virus (AMV) Enzyme Reverse transcriptase là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm mạch khuôn để tổng hợp nên DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA) Để enzyme Reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ RNA mạch đơn, cần phải có mồi bắt trên mạch khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme Reverse transcriptase khi trượt trên mạch khuôn có thể kéo dài được mạch cDNA

Mồi đặc hiệu: Mồi được sử dụng trong giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA

Mồi ngẫu nhiên: Một loại mồi chỉ có 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên để phiên mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành cDNA

Mồi oligo(dT)15: Ngoài mồi đặc hiệu và mồi ngẫu nhiên, có thể dùng mồi oligo(dT)15 (còn được gọi là mồi poly T) vì mRNA luôn có đuôi là poly(A)+ Mồi oligo(dT)15 thường được dùng để làm thư viện cDNA của biểu hiện gene hay dùng để phát hiện vi khuẩn sống trong bệnh phẩm

Hình 1.5: Mồi trong RT-PCR [43]

Trong giai đoạn phiên mã ngược mẫu được giữ 42 o trong 10-15 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA và enzyme reverse transcriptase tổng hợp được cDNA Nếu dùng mồi đặc hiệu thì thời gian ủ 42 o có thể kéo dài 60 phút Sau khi hoàn tất tổng hợp cDNA ở 42 o enzyme reverse transcriptase phải bị huỷ đi bằng cách đưa nhiệt

23 độ lên 85 o trong vòng 5 phút Sản phẩm cDNA này có thể được đưa vào khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu

1.4.1.4 Các biến thể của RT-PCR

Two-step RT-PCR: Là phương pháp RT-PCR mà người thí nghiệm thực hiện giai đoạn RT để tổng hợp cDNA trong một ống nghiệm, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để thực hiện giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm

One-step RT-PCR: Người thí nghiệm thực hiện cả hai giai đoạn RT và giai đoạn PCR trong cùng một ống phản ứng Để thực hiện được One-step RT-PCR trong ống phản ứng phải có đủ các thành phần hoá chất và thuốc thử để chạy RT và PCR, nghĩa là phải có cả enzyme reverse transcriptase và taq polymerase Ngoài ra cũng có một loại DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus, được đặt tên là TthPol enzyme này có hai khả năng: có thể thực hiện phiên mã ngược khi có sự hiện diện của Mn 2+ và nhân bản DNA khi có sự hiện diện của Mg 2+ do đó có thể sử dụng enzyme này để thực hiện One-step RT-PCR

Trong phương pháp One-step RT-PCR toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT

1.4.2.1 Nguyên tắc của phản ứng Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản

Real-time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase (tổng hợp DNA từ đầu 5’-3’) của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991 Trong phản ứng Real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX )

Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung dịch)

Các tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, … được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau.

Mẫu dò lai (hybridization probe): Gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên mạch khuôn Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng PCR Mẫu dò phía đầu có mang nhóm huỳnh quang ở đầu 3’ còn mẫu dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang ở đầu 5’ Khi hai mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA, nhóm huỳnh quang “cho” (donor dye) và nhóm “nhận” (acceptor dye) trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành trong quá trình Real-time PCR

Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): Với ví dụ thông dụng nhất là TaqMan probe (còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease) Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye) Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập” Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi nhận

Hình 1.7: Mẫu dò thủy giải [41]

Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe): Điển hình như “Molecular beacon”: bao gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược Các nhóm “phát” (reporter) và “dập”(quencher) được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò, do đó sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung dịch Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích, nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi nhận

Hình 1.8: Mẫu dò kẹp tóc [41]

Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt Real-time PCR thu nhận và xử lý Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (Standard Curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ Định lượng nucleic acid là ứng dụng mạnh nhất của phương pháp này Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, kỹ thuật Real-time PCR được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi điều trị

1.4.3.4 Các vấn đề cơ bản của Real-time PCR Đường nền (baseline): Được định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Theo mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được bắt đầu nghiên cứu từ tháng 10/2015 đến tháng 5/2016 tại công ty Cổ phần Công Nghệ Việt Á

Mẫu chứng dương được công ty Việt Á cung cấp Mẫu lâm sàng cho qui trình thực nghiệm là mẫu dịch phết vòm họng có được từ bệnh viện Nhi Thanh Hóa được nhận thông qua công ty Việt Á

Dựa vào các thông tin đã thu thập được thông qua quá trình tìm kiếm tài liệu và nghiên cứu trong thời gian qua thì cặp mồi và mẫu dò được lựa chọn sau các phân tích (trên máy tính) một cách chi tiết là cặp mồi và mẫu dò được thu nhận từ công bố của Boddicker J và cộng sự (2007) [2] và đã được chỉnh sửa cho phù hợp với mục tiêu nghiên cứu của bài nghiên cứu này

Bảng 2.1: Cặp mồi, mẫu dò được công bố của Boddicker J và cộng sự (2007)

Tên mồi Trình tự mồi Chiều dài

Tài liệu tham khảo SH61F 5’GTG ACC CTG CCG TTG CA 3’ 17

[2] SH147R 5’GTT ATG ATC AGA GAG AGA

AGA ATT AGC AAT AG 3’ 32

SH79P2 5’FAM-TAT GCC GGC GAT CCA

ACC TCC CTT ATA-BHQ 3’ 27

Bảng 2.2: Trình tự của cặp mồi và mẫu dò mới đã được chỉnh sửa và thiết kế mới

Tên mồi/mẫu dò Trình tự

R1 (mồi ngược) 5’ CAT GTC GCA CCG CAG TCT TAT 3’

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ:

2.2.3.1 Thiết bị dùng để khảo sát in silico

Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico các trình tự gene mục tiêu và các mẫu dò bằng các phần mềm tin sinh học: PUBMED (NCBI), annhyb, seaview, chương trình BLAST (NCBI), Oligo Analyzer (IDT), Bioedit…

Một số công cụ tin sinh học được sử dụng trong quá trình phân tích, khảo sát các cặp mồi, mẫu dò:

- IDT analyzer: Giúp xác định các thông số của mồi như kích thước, thành phần

GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo homo-dimer, hetero-dimer,…

- Annhyb: Kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm

- BLAST: Với các thông số mặc định sẵn trên NCBI nhằm xác định độ đặc hiệu và tính phổ quát của cặp mồi

- Bioedit: Hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp giống cột các trình tự, phát hiện vùng biến động giữa các loài và dùng làm mẫu dò đặc hiệu cho loài

- Seaview: Hỗ trợ sắp giống cột các trình tự tương đồng

2.2.3.2 Thiết bị và dụng cụ chạy thực nghiệm:

- Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng

- Cỏc dụng cụ khỏc như: micropipettes (10àl, 200àl, 1000àl), đầu tip, eppendorf các loại

- Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang …

Dung dịch 1(Trizol): Phenol 38%; guanidium thyocianate 0,8M; glycerol 5%; sodium acetate 0,1M; pH 4.0

Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa

Dung dịch 5: Nước cất 2 lần đã xử lí với DEPC

Master mix (dNTPs, enzyme phiên mã ngược M-Mul V Reverse transcriptase, MgCl 2, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (50mM KCl, Tris pH 8,0 10mM))

Nước cất đã hai lần xử lý DEPC

Master mix (dNTPs, Taq DNA polymerase, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR

50mM KCl, 10mM Tris pH8, MgCl 2 1,5mM)

Nước cất 2 lần vô trùng

Primer xuôi, primer ngược và probe

Master mix (dNTPs, Taq DNA polymerase, Dung dịch đệm cho phản ứng PCR

50mM KCl, 10mM Tris pH8, MgCl2 1,5mM)

Nước cất 2 lần vô trùng

Thu thập thông tin, khai thác dữ liệu từ các bài báo khoa học về bệnh quai bị, kỹ thuật Real-time RT-PCR để phát hiện nhanh virus gây bệnh quai bị thông qua các cơ sở dữ liệu PUBMED (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) với các từ khóa:

Mump virus, Real-time RT-PCR, SH gene…

2.3.2.1 Thu thập trình tự gene mục tiêu

Thu nhận các trình tự gene mục tiêu gene SH của virus mumps từ ngân hàng gene NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để tìm hiểu và lựa chọn vùng thích hợp để thiết kế mồi và các mẫu dò sử dụng cho kỹ thuật Real-time RT-PCR

2.3.2.2 Thu thập trình tự các cặp mồi, mẫu dò

Thu thập tất cả các cặp mồi, mẫu dò từ các bài báo nghiên cứu khoa học về kỹ thuật Real-time RT-PCR để phát hiện nhanh vius gây bệnh quai bị

2.3.2.3 Khảo sát đánh giá và thiết kế mới các cặp mồi mẫu dò

Mồi và mẫu dò là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gene

Basic Local Alignmemt Search Tool (BLAST) trên NCBI được dùng để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi và mẫu dò Bên cạnh đó dựa vào các công cụ phân tích trên trang web IDT, mồi và mẫu dò đã được tiến hành đánh giá các thông số quan trọng như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer-dimer của hệ thống mồi với một số tiêu chí sau:

Các chỉ tiêu của mồi và mẫu dò [1]:

- Chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thông thường dao động 18bp-25bp Tuy nhiên trong các trường hợp cụ thể chiều dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn chiều dài chuẩn, giới hạn trong khoảng 15bp-30bp

- Thiết kế các mồi với hàm lượng GC khoảng 50-60% Các vùng với hàm lượng

GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong tiến trình PCR, dẫn đến phản ứng kém hiệu quả

- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là một thông số rất quan trọng Dựa trên đó người ta có thể quyết định nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR Theo nhiều nghiên cứu, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và ngược không nên quá

5 0 C Nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50-65 0 C

- Mồi được thiết kế có nhiệt độ lai trong khoảng 55-60 0 C để tránh sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu

- Cấu trúc thứ cấp: Cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop-tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide), homo dimer (hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp) và hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau)

Phân tích khảo sát các đặc tính, thông số vật lý, và tính đặc hiệu của các cặp mồi, mẫu dò thu thập được từ các bài báo nghiên cứu khoa học, từ đó hướng tới việc thiết kế mới các cặp mồi, mẫu dò

2.3.3 Phương pháp xử lý mẫu Đối với mẫu bệnh dịch phết hầu họng thì cho vào ống eppendorf 1,5ml chứa sẵn 500ml dung dịch TEX1 Sau đó voxtex 30s trữ ở -20 o C cho đến khi tách chiết RNA

2.3.4 Phương pháp tách chiết RNA

2.3.4.1 Nguyên tắc Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những chất tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein Nguyên tắc của tách chiết RNA là dựa trên sự hòa tan khác nhau các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan nhau (phenol, chloroform/nước) RNA là các phân tử mạch đơn kém bền nên để có kết quả tốt nhất thì việc thao tác phải thực hiện trong những điều kiện nghiêm ngặt và cần chú ý tránh mọi tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy RNA

Nguyên tắc tách chiết RNA gồm 3 bước chính:

- Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý hóa học hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng RNA ra môi trường

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico

Qua quá trình khai thác dữ liệu, tôi đã tổng hợp 13 tài liệu tham khảo (tính đến thời điểm 5/2016) có liên quan đến việc sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phát hiện nhanh virus mumps gây bệnh quai bị dựa trên vùng gene SH và một số vùng gene khác

Bảng 3.1: Thống kê các gene mục tiêu thu tập được trên ngân hàng dữ liệu gene

Gene mục tiêu Phương pháp Tài liệu tham khảo

Real-time (TaqMan) RT-PCR [3]

Real-Time Reverse Transcription-PCR [3], [4]

F gene Real-Time One-Step Reverse Transcriptase

PCR Using the LightCycler Platform [14]

Bảng 3.2: Các trình tự gene SH thu nhận trên ngân hàng gene

Loài virus Mã số truy cập

KM234040 KF438184 KP670895 KP052650 KJ175083 KJ878859 KT762347

3.1.2 Kết quả khảo sát in silico

3.1.2.1 Thu thập và đánh giá cặp mồi, mẫu dò được chọn

Bảng 3.3: Một số cặp mồi, mẫu dò thu nhận được

Tên mồi/mẫu dò Trình tự mồi/mẫu dò (1) (2) (3) (4) (5) (6) Gene mục tiêu (7)

Reverse SH2 5’ GCT CAA GCC TTG ATC

5’ GTA TGA CAG CGT ACG ACC AAC CT 3 23 52,2 58,7 0,59 -3,61

5’GCG ACC TTG CTG CTG

5’FAM CC GGG TCT GCT GAT CGG CGA T BHQ 3’ 21 66,7 64,1 -0,61 -9,75 -6,69/

SH61F 5’GTG ACC CTG CCG TTG

5’GTT ATG ATC AGA GAG AGA AGA ATT AGC AATAG 3’

5’ FAM-TAT GCC GGC GAT CCA ACC TCC CTT

(1): Chiều dài (nts) (2): %GC (3): Tm ( o C) (4): Cấu trúc kẹp tóc (5): Homodimer (6): Heterodimer (7) Tài liệu tham khảo

Dựa vào các công cụ đánh giá các tiêu chí của mồi thì cặp mồi SH61F- SH147R và mẫu dò SH79P2 đạt những tiêu chí về độ đặc hiệu, tính phổ quát của mồi nên cặp mồi SH61F- SH147R và mẫu dò SH79P2 được chọn để tiến hành đánh giá và tối ưu cho phù hợp với kiểu gene tại Châu Á và tiêu biểu có Việt Nam Cặp mồi và mẫu dò được tôi lựa chọn sau các phân tích (trên máy tính) một cách chi tiết là cặp mồi và mẫu dò được thu nhận từ công bố của Boddicker J và cộng sự (2007) [2]

Bảng 3.4: Các thông số vật lý của cặp mồi, mẫu dò được công bố của Boddicker J và cộng sự (2007)

Tên mồi/ mẫu dò Trình tự mồi/mẫu dò (1) (2) (3) (4) (5) (6) Gene mục tiêu (7)

SH61F 5’GTG ACC CTG CCG

5’GTT ATG ATC AGA GAG AGA AGA ATT AGC AAT AG 3’

5’FAM-TAT GCC GGC GAT CCA ACC TCC CTT ATA-BHQ 3’

(1): Chiều dài (bp) (2): %GC (3): Tm ( o C) (4): Cấu trúc kẹp tóc

(5): Homodimer (6): Heterodimer (7) Tài liệu tham khảo

Các thông số vật lí này được đánh giá bằng công cụ IDT cho thấy các chỉ tiêu về chiều dài, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, các cấu trúc thứ cấp (homodimer, heterodimer, hairpin) đều đạt chỉ tiêu và chấp nhận ngoại trừ:

- Chiều dài của mồi ngược SH147R là 32bp và mẫu dò SH79P2 là 27bp dài làm nhiệt độ bắt cặp của mồi cao và bắt cặp không đặc hiệu

- Phần trăm CG của mồi xuôi 64.7% là cao điều này sẽ dẫn đến không biến tính tốt trong tiến trình PCR dẫn đến phản ứng kém hiệu quả

- Cấu trúc thứ cấp của mẫu dò (homodimer) -16.03 là thấp sẽ làm mẫu dò tự bắt cặp trước khi bắt cặp với trình tự gene mục tiêu

Kết quả bắt cặp đặc hiệu của mồi và mẫu dò với vùng gene mục tiêu

Trên đây là kết quả bắt cặp của cặp mồi và mẫu dò được chọn trên vùng gene SH được sắp giống cột bằng chương trình seaview và hiển thị kết quả bằng bioedit

- Từ kết quả hiển thị của hình 3.1 thì mồi xuôi SH61F bắt cặp đặc hiệu hoàn toàn trên vùng gene mục tiêu từ vị trí nu thứ 32 đến 48

- Từ kết quả hiển thị của hình 3.2 thì mồi ngược SH147R bắt cặp đặc hiệu trên vùng gene mục tiêu từ vị trí nu thứ 87 đến 118 nhưng chưa đặc hiệu hoàn toàn và còn sai khác ở các nu 104, 106

- Từ kết quả hiển thị của hình 3.3 thì mẫu dò SH79P bắt cặp được trên vùng gene mục tiêu từ vị trí nu thứ 50 đến 76 nhưng chưa đặc hiệu hoàn toàn và còn sai khác ở các nu 68, 71

Vì các mồi và mẫu dò không đạt được nhiều chỉ tiêu đề ra:

- Chiều dài mẫu dò và mồi ngược dài và chưa bắt cặp đặc hiệu hoàn toàn trên vùng gene mục tiêu

- Cấu trúc thứ cấp của mẫu dò (homodimer) thấp

Nên từ những ưu và khuyết điểm trên tôi đã chỉnh sửa mẫu dò (về chiều dài và các nu thay thế) cho phù hợp với các chỉ tiêu vật lý của mồi đồng thời thiết kế mới mồi ngược để tăng được độ đặc hiệu của mồi cũng như phù hợp với các chỉ tiêu thông số vật lý đề ra

3.1.2.2 Đánh giá in silico cặp mồi, mẫu dò mới:

Bảng 3.5: Trình tự của cặp mồi và mẫu dò mới đã được chỉnh sửa và thiết kế mới:

Tên mồi/mẫu dò Trình tự

F1 (mồi xuôi) 5’GTG ACC CTG CCG TTG CA 3’

R1 (mồi ngược) 5’ CAT GTC GCA CCG CAG TCT TAT 3’

(Các vị trí màu đỏ là các vị trí đã được chỉnh sửa)

Việc sử dụng cặp mồi để khuếch đại gene đích là gene SH genotype G được lựa chọn là cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 với các lý do sau:

Cặp mồi trong quá trình khảo sát in silico với trình tự gene đích của virus mumps cho thấy cặp mồi được thiết kế trong vùng bảo tồn của virus mumps đặc hiệu với trình tự gene SH genotype G của virus mumps

Với cặp mồi F1-R1, đoạn trình tự được khuếch đại của mồi xuôi và mồi ngược có sự biến động, phù hợp với tiêu chí đề ra của việc thiết kế mẫu dò đặc hiệu cho các vi sinh vật mục tiêu

Kết quả bắt cặp đặc hiệu trên gene (được sắp gióng cột bằng seaview và hiển thị kết quả bằng bioedit) của cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 là bắt cặp đặc hiệu hoàn toàn trên gene SH genotype G

Mồi F1-R1 và mẫu dò P1 đã được kiểm tra độ đặc hiệu, độ phổ quát thông qua các công cụ như Basic Local Alignmemt Search Tool (BLAST) trên NCBI, Seaview, Bioedit Bên cạnh đó dựa vào các công cụ phân tích trên trang web IDT, tôi đã tiến hành đánh giá các thông số quan trọng của các cặp mồi thiết kế như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer- dimer của hệ thống mồi.

3.1.2.3 Kết quả đánh giá in silico cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1

Kết quả kiểm tra các thông số vật lý của cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1

Bảng 3.6: Các thông số vật lý của cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1

Trình tự mồi/mẫu dò (1) (2) (3) (4) (5) (6)

5’GTG ACC CTG CCG TTG

5’CAT GTC GCA CCG CAG

(1): Chiều dài (bp) (2): %GC (3): Tm ( o C) (4): Cấu trúc kẹp tóc (5): Homodimer (6): Heterodimer (7) Tài liệu tham khảo

Các thông số vật lí này được đánh giá bằng công cụ IDT cho thấy các chỉ tiêu về chiều dài, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, các cấu trúc thứ cấp (homodimer, heterodimer, hairpin) đều đạt chỉ tiêu và chấp nhận được

Kết quả bắt cặp đặc hiệu trên gene (được sắp gióng cột bằng seaview và hiển thị kết quả bằng bioedit) của cặp mồi ngược R1 và mẫu dò P1 đã được chỉnh sửa:

Hình 3.5: Kết quả bắt cặp đặc hiệu của mồi ngược R1

Hình 3.6: Kết quả bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò P1

Trên đây là kết quả bắt cặp của cặp mồi ngược R1 và mẫu dò P1 trên vùng gene SH genotype G được sắp giống cột bằng chương trình seaview và hiển thị kết quả bằng bioedit

Từ kết quả hiển thị của hình 3.5 thì mồi ngược R1 bắt cặp đặc hiệu hoàn toàn trên vùng gene mục tiêu từ vị trí nu thứ 151 đến 171

Từ kết quả hiển thị của hình 3.6 thì mẫu dò P1 bắt cặp được trên vùng gene mục tiêu từ vị trí nu thứ 54 đến 80

Kết quả BLAST cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1

Hình 3.7: Kết quả BLAST mồi xuôi F1

Hình 3.8: Kết quả BLAST mồi ngược R1

Hình 3.9: Kết quả BLAST mẫu dò P1

Dựa vào kết quả BLAST (Hình 3.7, 3.8, 3.9) tôi nhận thấy cặp mồi F1-R1 và mẫu dò P1 cho kết quả bắt cặp đặc hiệu với các chủng virus mumps

Mồi xuôi F1có thể bắt cặp đặc hiệu với trình tự gene SH genotype G của nhiều chủng virus mumps và tương đồng nhất là chủng có mã số Acession KU662000.1 với giá trị tương đồng 100% và phần tương đồng nhiều nhất đạt giá trị max score là 34.2 được bao phủ hoàn toàn 100% và có giá trị evalue là 12

Kết quả khảo sát bộ mồi mẫu dò trên thực nghiệm

3.2.1 Kết quả khảo sát sự hoạt động của bộ mồi

Sau khi hoàn tất việc kiểm tra các đặc tính của mồi trên lý thuyết mồi và mẫu dò đạt tiêu chuẩn được tổng hợp tại hãng IDT (Hoa Kỳ) Sản phẩm đưa về sẽ được kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi trên chứng dương của virus mumps Đầu tiờn tụi thực hiện phản ứng RT với 15 àl chứng dương của virus mumps và 10 àl master mix RT (Primer, dNTPs, Enzyme Reverse transcriptase, MgCl 2 , nước cất vô trùng) cho vào eppendorf 0,2 ml Đậy nắp eppendorf thật kĩ và cho vào máy luân

54 nhiệt Lập trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 25 o C trong 5 phút, 42 o C trong 30 phút, 85 o C trong 5 phút, giữ ở 4 o C

Sau đó cDNA thu được sẽ dùng để thực hiện phản ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR:

- 2.5 àl cDNA (dịch cDNA từ phản ứng RT trờn)

- Thờm nước Bio-pure cho đủ thể tớch 25 àl/phản ứng

Phản ứng được thực hiện theo chương trình luân nhiệt đã được trình bày ở phần II, mục 2.3.5

Hình 3.11: Kết quả điện di khảo sát hoạt động của mồi

Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy: có một vạch sản phẩm với kích thước như mong đợi (140 bp) ở mẫu chứng dương, trong khi đó ở mẫu chứng âm không có sản phẩm khuếch đại Không thấy xuất hiện các vạch kí sinh ở mẫu chứng dương (Hình 3.11 ).

3.2.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của bộ mồi: Ở thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lai nhằm xác định nhiệt độ lai tối ưu, mà ở đó mồi hoạt động tốt nhất, cho băng kết quả điện di sáng nhất

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi

Hình 3.12: Kết quả diện di khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi

55, 2 o C là nhiệt độ tối ưu của mồi vì cho kết quả điện di rõ nhất

3.2.3 Kết quả khảo sát sự hoạt động của mẫu dò cDNA thu được từ phản ứng RT sẽ dùng để thực hiện phản ứng Realtime-PCR Thành phần phản ứng Realtime-PCR:

- 2.5 àl cDNA (dịch cDNA từ phản ứng RT trờn)

- Thờm nước Bio-pure cho đủ thể tớch 25 àl/phản ứng

Phản ứng được thực hiện theo chương trình luân nhiệt đã được trình bày ở phần II, mục 2.3.7, tỉ lệ mồi và mẫu dò là 1:1

Hình 3.13: Thí nghiệm Realtime PCR kiểm tra hoạt động của mẫu dò

Kết quả thí nghiệm Realtime PCR cho kết quả dương tính (Ct = 24,69) ở mẫu virus mumps, mẫu chứng âm (nước cất) cho kết quả âm tính

3.2.4 Kết quả giải trình tự

Tôi sử dụng kĩ thuật giải trình tự để khẳng định sản phẩm được khuếch đại chính là trình tự mục tiêu Kết quả nhận được sẽ được sử dụng chương trình BLAST trên NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng với đoạn trình tự đã nhân bản được

Sau khi sản phẩm Real-time-PCR được gửi đến công ty Macrogen để giải trình tự, tôi được kết quả như sau:

Hình 3.14: Kết quả giải trình tự sản phẩm Realtime-PCR

Bảng 3.8: Trình tự sản phẩm Realtime-PCR

Trình tự sản phẩm Realtime PCR Kích thước

Sau khi BLAST sản phẩm thu được bằng công cụ BLAST trên NCBI thu nhận được kết quả:

Hình 3.16 : Kết quả BLAST sản phẩm giải trình tự

Kết quả trên cho thấy sản phẩm Realtime PCR hoàn toàn tương đồng với các chủng virus mumps ở trên thế giới trên GeneBank

3.2.5 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mẫu dò Ở thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lai nhằm xác định nhiệt độ lai tối ưu, mà ở đó mồi, mẫu dò hoạt động tốt nhất, cho tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng (Ct) sớm nhất và rõ ràng

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát nhiệt độ của mẫu dò

Giếng/Mẫu A1/(+) B1/(+) C1/(+) D1/(+) E1/(+) F1/(+) Nhiệt độ ( o C) 55.0 56.0 57.0 58.0 59.0 60.0 Tín hiệu ngưỡng (Ct) 23,77 23,89 24,55 25,57 25,77 26,66

Hình 3.17: Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai của mẫu dò ở 55 o C được đánh dấu màu

Khảo sát nhiệt độ lai từ 55-60 o C của virus mumps cho thấy ở 55 o C cho tín hiệu huỳnh quang vượt ngưỡng sớm nhất (Ct = 23,77) Nên nhiệt độ 55 o C được đánh giá là nhiệt độ lai tối ưu của bộ mồi và mẫu dò virus mumps

3.2.6 Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình

Sau khi có nhiệt độ lai tối ưu của quy trình, tôi tiếp tục khảo sát độ nhạy của quy trình Dùng mẫu dương nồng độ 10 7 copies/ml đem pha loãng thành nhiều nồng độ và thực hiện phản ứng realtime-PCR với cùng nhiệt độ lai là 55 o C

Hình 3.18: Đồ thị khảo sát độ nhạy của quy trình Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình

Nồng độ (copies/ml) 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 Chất phát huỳnh quang FAM FAM FAM FAM FAM FAM FAM Tín hiệu ngưỡng (Ct) 17.05 20.98 24.32 27.41 31.19 35.02 No Ct

Mỗi phương pháp xét nghiệm đều có giới hạn về độ nhạy của nó Khảo sát về độ nhạy quy trình real-time PCR cho thấy, nồng độ thấp nhất mà quy trình còn cho kết quả dương tính là 10 2 copies/ml (Ct = 35,02) Vậy quy trình có độ nhạy là 10 2 copies/ml

3.2.7 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mồi, mẫu dò

Một phương pháp được xem là có độ tin cậy cao ngoài việc có độ nhạy cao còn phải có độ đặc hiệu cao Do đó mồi mẫu dò được thiết kế phải đặc hiệu, chỉ khuếch đại trình tự DNA virus đích là virus mumps, không có phản ứng khuếch đại với các chủng vi sinh vật khác Bố trí thí nghiệm gồm các chứng dương virus Human papiloma virus (HPV), Hepatitis B virus (HBV), Measles virus (virus sởi), parainfluenzae virus (virus Á cúm), respiratory syncytial virus (RSV virus hợp bào

60 hô hấp) , một mẫu chứng dương DNA virus mumps chạy phản ứng realtime PCR với bộ mồi và mẫu dò virus mumps

Hình 3.20: Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò của virus mumps được đánh dấu màu FAM

Các mẫu chứng dương virus RSV, HPV, HBV, measles, parainfluenzae virus cho kết quả âm tính với bộ mồi, mẫu dò của virus mumps Mẫu chứng dương virus mumps cho kết quả dương tính (Ct(,9) với hệ mồi, mẫu dò của virus mumps

Tuy nhiên, để chắc chắn rằng các mẫu virus chứng dương là các chủng virus ta cần khảo sát Tôi còn cho chạy đồng thời thêm phản ứng giữa các chủng virus với hệ mồi, mẫu dò đặc hiệu của chúng để làm đối chứng

Bố trí thí nghiệm gồm các chứng dương virus Human papilomavirus (HPV),

Hepatitis B virus (HBV), Mealse virus (virus sởi), parainfluenzae virus (virus Á cúm), respiratory syncytial virus (RSV virus hợp bào hô hấp), một mẫu chứng dương DNA virus mumps chạy phản ứng realtime PCR với bộ mồi và mẫu dò của từng loại virus

Hình 3.20: Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò của từng loại virus được đánh dấu màu FAM Đồ thị hình 3.20 cho thấy, các mẫu chứng dương với hệ mồi đặc hiệu của chúng đều cho kết quả dương tính, chứng minh mẫu chứng dương ta dùng chính là các chủng vi khuẩn cần khảo sát

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi và mẫu dò của từng loại virus

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu cho thấy, chỉ có mẫu chứa virus mumps là cho kết quả dương tính với mồi và mẫu dò được khảo sát Như vậy bộ mồi, mẫu dò đươc khảo sát có độ đặc hiệu cao với virus mumps độ đặc hiệu đạt 100%

Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm lâm sàn

Sau khi xây dựng quy trình Realtime-PCR, tôi tiến hành ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm lâm sàn 12 mẫu bệnh phẩm đã được thu thập và xét nghiệm ban đầu bằng một trong 2 phương pháp ELISA và PCR Kết quả ứng dụng quy trình được trình bày và được tóm tắt, thống kê lại ở bảng dưới đây:

Hình 3.21: Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm

Bảng 3.12: Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm

Tên mẫu Realtime PCR virus mumps Ct Phương pháp khác

Tổng hợp kết quả từ bảng cho thấy, quy trình được ứng dụng trên mẫu bệnh phẩm cho kết quả trùng khớp hoàn toàn với kết quả xét nghiệm phát hiện virus mumps ban đầu

Hai mẫu 4 và 6 dương tính yếu trong khi kết quả xét nghiệm bằng phương pháp PCR và ELISA là âm chứng tỏ quy trình của tôi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp khác, có thể phát hiện virus mumps ở nồng độ thấp

Trong bài báo: “Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Detection of Mumps Virus RNA in Clinical Specimens” (2007) của tác giả Jennifer D Boddicker và cộng sự được đăng trên tạp chí Journal of clinical microbiology [2] Tác giả đã sử dụng gene SH là gene mục tiêu để phát hiện virus mumps và độ nhạy của quy trình mà tác giả đạt được là 10 bản sao có giá trị Ct khoảng 36, với hiệu quả khảo nghiệm đạt hơn 90%, độ đặc hiệu đạt 100% từ đó cho thấy được kết quả nghiên cứu của tôi là phù hợp với những công bố của các nghiên cứu trước

Tỉ lệ số mẫu dương tính là 67% âm tính là 33% phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Kazue Uchida và cộng sự (2005) trong bài báo: “Rapid and sensitive detection of mumps virus RNA directly from clinical samples by Real-time PCR” được đăng trên tạp chí Journal of medical virology [22].Trong bài nghiên cứu này tác giả sử dụng 73 mẫu lâm sàn bao gồm cả mẫu dịch phết vòm họng và dịch não tủy được thực hiện phản ứng Real-time PCR và đã phát hiện được RNA virus mumps khoảng 70% ở cả hai mẫu dịch phết họng và mẫu dịch não tủy

Vì vậy quy trình phát hiện virus mumps của tôi xây dựng có độ đặc hiệu cao, chính xác, mà còn tiết kiệm thời gian để phát hiện virus mumps genotype G