Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi ở những người nhận thận ghép cho thấy sự xuất hiện rất sớm BKV trong máu và nước tiểu, thậm chí trong những giờ đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao nhất x
T Ổ NG QUAN TÀI LI Ệ U
D ị ch t ễ h ọ c
BK virus là tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến ở người, thường không gây ra triệu chứng lâm sàng rõ ràng Tuy nhiên, virus này vẫn có thể gây ra tình trạng nhiễm trùng tiềm ẩn trong cơ thể Theo các nghiên cứu, tỷ lệ huyết thanh dương tính với BK virus ở người trưởng thành là khá cao, cho thấy sự phổ biến của virus này trong cộng đồng.
Sự tái hoạt động của BKV xảy ra khi phản ứng miễn dịch trung gian qua tế bào suy giảm, đặc biệt ở những người có hệ miễn dịch yếu như bệnh nhân AIDS, phụ nữ mang thai, và bệnh nhân tiểu đường Sau khi nhân lên, BKV xâm nhập vào mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu và tấn công các bộ phận ghép, gây ra tổn thương Khi BKV phát triển ở vùng vỏ thận, nó liên quan đến hoại tử tế bào biểu mô ống thận và tăng nồng độ creatinine huyết thanh Cơ chế gây rối loạn chức năng mô ghép thận bao gồm sự rò rỉ và chảy ngược nước tiểu từ ống thận bị tổn thương vào các khoang kẽ và mao mạch quanh ống thận, dẫn đến tổn thương và hoại tử ống thận cấp Khoảng 1/3 bệnh nhân có BKV trong nước tiểu sẽ phát triển BKV trong máu, và nếu không được can thiệp kịp thời, có thể tiến triển thành BKVN với tỷ lệ từ 1 đến 10% Sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận lần đầu tiên được xác nhận qua sự phát tán virus trong nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến 60% bệnh nhân.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương về thận ghép liên quan đến BKV là 7,5% (70/938) trong năm 2009 và 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68]
Một số yếu tố nguy cơ nhiễm BKV trước ghép thận bao gồm giới tính nữ, mô ghép từ người cho chết não, chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể BKV cao ở người cho, sự không phù hợp HLA và người cho là người Mỹ gốc Phi Mức độ ức chế miễn dịch là yếu tố quan trọng nhất dẫn đến nhiễm BKV và phát triển BKVN, nhưng chưa có tiêu chuẩn rõ ràng về liều lượng ức chế miễn dịch liên quan đến sự xuất hiện của BK trong nước tiểu Nghiên cứu của Shah và cộng sự chỉ ra rằng người nhận BKV âm tính trong huyết thanh nhưng dương tính ở người cho có nguy cơ cao nhất phát triển BKVN (43%) Ngược lại, Bohl và cộng sự ghi nhận nhóm có nguy cơ cao nhất (50%) là nhóm huyết thanh dương tính với BKV ở cả người cho và người nhận Cả hai nghiên cứu đều cho thấy nguy cơ nhiễm BKV thấp nhất (10%) khi huyết thanh của cả hai đều âm tính Hơn nữa, Bohl cũng chỉ ra rằng sự vắng mặt của HLA-C7 ở người nhận có liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng.
Các yếu tố nguy cơ dẫn đến BKVN sau ghép bao gồm tổn thương niệu quản, đái tháo đường, độ trễ chức năng thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, và điều trị thải ghép cấp tính bằng thuốc ức chế calcineurin hoặc steroid Bên cạnh đó, bệnh nhân có HLA và ABO không tương thích với người cho, cũng như tổn thương niệu quản do đặt stent niệu quản, có thể làm tăng nguy cơ mắc BKVN.
Nhiều báo cáo chỉ ra rằng BKV có thể được phát hiện trong máu hoặc nước tiểu của bệnh nhân ghép tạng, bao gồm ghép tim, phổi và gan Tuy nhiên, sự hiện diện của BKV trong các mẫu này không phải lúc nào cũng có ý nghĩa lâm sàng rõ ràng.
Luận văn thạc sĩ Khoa học chỉ ra rằng chức năng thận suy giảm ở bệnh nhân ghép tế bào gốc có liên quan đến sự tái hoạt động của virus BKV, dẫn đến viêm bàng quang xuất huyết với các triệu chứng như khó tiểu và tiểu ra máu Tỷ lệ nhiễm BKV trong nước tiểu ở những người nhận ghép tủy xương và ghép tế bào gốc tạo máu có thể dao động từ 50% đến 100% trong vòng 2 tháng sau khi cấy ghép.
BKV được xác định là nguyên nhân gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng như hẹp niệu quản, hội chứng thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu và bệnh đa hồng cầu liên quan đến polyomavirus Nghiên cứu cho thấy BKV có thể liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống thông qua việc tạo ra kháng thể chống lại DNA và histones, cũng như có mối liên hệ với các khối u và ung thư Hẹp niệu quản do BKV đã được ghi nhận ở cả người nhận ghép thận và ghép tế bào gốc tạo máu Barasa.N và cộng sự (2010) đã báo cáo trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu với nhiều biến chứng như hẹp niệu quản và viêm bàng quang xuất huyết Bệnh nhân này đã có sự xuất hiện của herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép và BKV sau 28 ngày Ngoài ra, sự lan rộng nhiễm trùng nội mô do BKV dẫn đến tổn thương tế bào nội mô, gây tổn thương mao mạch và phù nề trên cả hai bên thận Một báo cáo của Bratt G và cộng sự (1999) chỉ ra rằng BKV có liên quan chặt chẽ đến viêm phổi ở bệnh nhân AIDS tiến triển, với hai trường hợp tử vong do viêm phổi được ghi nhận, trong đó có một bệnh nhân sau ghép tế bào gốc và một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính trong giai đoạn hóa trị liệu.
T ổ ng quan v ề BKV
1.2.1 L ịch sử phát hiện BKV
BKV, hay virus Bk, lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1971 tại phòng thí nghiệm nghiên cứu virus ở London, Anh Trong một nghiên cứu dịch tễ học về nhiễm cytomegalovirus ở những người nhận ghép thận, nhà nghiên cứu Sylvia Gardner đã ghi nhận sự xuất hiện của loại virus này.
Luận văn thạc sĩ Khoa học nghiên cứu về mụn cóc sinh dục ở một bệnh nhân nam người Sudan cho thấy sự hiện diện của virus tương tự papillomavirus Mặc dù đã có nhiều báo cáo về tình trạng mụn cóc ở bệnh nhân ghép thận, nhưng trường hợp này đặc biệt do có hiện tượng hẹp niệu quản, yêu cầu can thiệp phẫu thuật Khi tiêm nước tiểu của bệnh nhân vào tế bào thận khỉ rhesus và tế bào thận phôi thai người, đã phát hiện bệnh học tế bào nhưng không phải do papillomavirus gây ra Virus này được xác định là một loại virus mới, được đặt tên là BK, theo tên viết tắt của bệnh nhân đầu tiên được phân lập.
BKV là một virus thuộc họ Polyomaviridae, trong chi Polyomavirus, và có mối quan hệ gần gũi với JC virus (JCV) và virus Simian 40 (SV40) Cả ba loại virus này đều thuộc họ polyomavirus và chia sẻ sự tương đồng cao về trình tự DNA cũng như protein promoter.
Sự tương đồng trong trình tự gen giữa virus BKV, JCV và SV40 lần lượt đạt 72% và 69% Cả ba loại virus này đều mã hóa cho 6 loại protein, với sự tương đồng axit amin trong vùng sớm là 88% giữa BKV và JCV, 81% giữa BKV và SV40, và 79% giữa JCV và SV40 Trong khu vực mã hóa muộn, sự tương đồng axit amin là 86% giữa BKV và JCV, 85% giữa BKV và SV40, và 82% giữa JCV và SV40.
BKV không có vỏ bao ngoài nhưng sở hữu vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có đường kính từ 40-44 nm Capsid được cấu thành từ các protein VP1, VP2 và VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng kết hợp với protein histone Cấu trúc capsid gồm 360 phân tử VP1 được sắp xếp thành 72 patamers, mỗi patamer liên kết với một trong hai protein capsid VP2 hoặc VP3 VP1 là protein duy nhất bộc lộ ra ngoài virion, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ và thúc đẩy quá trình xâm nhập Gần đây, khi quan sát BKV bằng kính hiển vi điện tử, các nhà khoa học đã phát hiện những điểm tương đồng đáng chú ý.
Luận văn thạc sĩ nghiên cứu mối quan hệ giữa protein VP2, VP3 và protein histone trong hệ gen Có nhiều giả thuyết cho rằng VP2 và VP3 đóng vai trò cầu nối giữa VP1 và cấu trúc chromatin.
Bộ gen BKV có kích thước khoảng 5,3 kb, chứa các gen mã hóa cho các protein cấu trúc như VP1, VP2, VP3, cùng với các protein hỗ trợ quá trình nhân lên của virus như LTA, STA và agnoprotein, cũng như vùng không mã hóa NCCR NCCR là vùng biến thể cao, chứa nhiều vị trí liên kết với các yếu tố điều hòa của tế bào chủ, được gọi là vùng điều hòa biến thể (HVRR) Khung đọc mở nằm ở trung tâm bộ gen, thúc đẩy sao chép theo hai chiều Trong quá trình nhân lên, LTA tạo phức hợp đa phân với vị trí khởi đầu sao chép (Ori) và hoạt động như helicase, hỗ trợ sao chép vùng mã hóa muộn LTA cũng đóng vai trò điều hòa quan trọng, thúc đẩy tế bào chủ vào pha S của chu trình tế bào bằng cách liên kết với các protein ức chế khối u như Rb, p107, p130 và p53 STA liên quan đến khả năng nhân lên của virus và vận hành chu trình tế bào Các protein capsid VP1, VP2, VP3 được tổng hợp trong tế bào chất và sau đó được vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng, dẫn đến sự lan truyền của virus.
Hình 1 1 Cấu trúc virion BKV [3]
Con đường lây nhiễm BKV vẫn chưa được xác định rõ ràng, nhưng nhiều bằng chứng cho thấy rằng đường hô hấp và tiêu hóa là hai con đường lây truyền chính của virus này.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Các con đường lây nhiễm BKV bao gồm truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng và từ mẹ sang con Nhiễm trùng tiên phát thường không có triệu chứng rõ ràng hoặc chỉ gây viêm đường hô hấp nhẹ, cho thấy BKV có thể thâm nhập vào máu qua nhiễm trùng ở amidan Sau khi vào tế bào máu ngoại vi, virus lây lan sang các mô khác, đặc biệt là thận, nơi BKV tồn tại dai dẳng trong các tế bào ống thận Sự tái hoạt động không triệu chứng của BKV xảy ra khi virus được bài tiết qua nước tiểu, nhưng hiện tượng này hiếm gặp ở người khỏe mạnh và bệnh nhân có khả năng miễn dịch tốt BKV cũng được phát hiện trong tế bào bạch cầu, não và hạch bạch huyết với sự xuất hiện của BKV-DNA Sự phát tán BKV trong nước tiểu phổ biến hơn ở bệnh nhân ghép thận, tuy nhiên, cơ chế tồn tại dai dẳng và điều kiện tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng.
Quá trình nhân lên của BKV bắt đầu khi kháng nguyên VP1 gắn với acid sialic hoặc GD1b/GT1b trên màng tế bào chủ Sau khi gắn kết, BKV thâm nhập vào tế bào qua con đường nhập bào và được vận chuyển tới lưới nội chất nhờ các microtubule Qua VP2, VP3 và con đường importin, BKV tiếp cận nhân tế bào và giải phóng DNA vào tế bào vật chủ Tuy nhiên, genome của BKV không tích hợp vào hệ gen người, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng tích hợp genome BKV vào hệ gen ở động vật gặm nhấm có thể dẫn đến sự hình thành khối u Hiện nay, hiểu biết về cơ chế tương tác giữa BKV-DNA và hệ gen động vật gặm nhấm trong việc hình thành khối u vẫn còn hạn chế Sau khi DNA được giải phóng vào nhân, quá trình phiên mã sớm diễn ra nhờ phức hệ enzyme của tế bào chủ, tạo ra các protein hỗ trợ cho quá trình sao chép của virus.
Tiếp theo, các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) được hình thành từ tế bào chất và
Luận văn thạc sĩ Khoa học vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins
Một khi các proteins capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra
Hình 1 2 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV [3]
• Đáp ứng miễn dịch tự nhiên
Nghiên cứu về mối tương tác giữa BKV và hệ thống miễn dịch tự nhiên chủ yếu tập trung vào sự tái hoạt động của BKV và BKVN ở bệnh nhân ghép thận Womer và cộng sự đã phát hiện sự giảm số lượng tế bào tua (DC) trong máu ngoại vi của bệnh nhân BKVN Các nghiên cứu bổ sung cho thấy bệnh nhân có số lượng DC thấp trước khi ghép có nguy cơ cao mắc BKVN.
Luận văn thạc sĩ Khoa học đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt là quá trình biệt hóa thành các tế bào T đặc hiệu với virus BKV.
Tế bào giết tự nhiên (NKs) có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát lây nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận, với các thụ thể giống kháng thể (KIR) góp phần vào đề kháng miễn dịch đối với virus này Nghiên cứu gần đây cho thấy chiến lược giám sát miễn dịch của BKV có thể thông qua việc ức chế nhận diện của tế bào NK Ngoài ra, các yếu tố trung gian khác của hệ miễn dịch tự nhiên như defensins cũng đóng góp vào việc kiểm soát BKV, với Defensins 5 (HD5) có khả năng ức chế sự bám dính của BKV vào tế bào chủ bằng cách kết tụ virus HD5, thường có mặt trong đường niệu sinh dục, có thể bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết sự tái hoạt động không triệu chứng của virus trong hệ tiết niệu sinh dục.
Yếu tố trung gian trong hệ miễn dịch tự nhiên có khả năng ảnh hưởng đến việc mất mô ghép ở bệnh nhân ghép thận do nhiễm BKV Nghiên cứu cho thấy nhiễm BKV không chỉ làm gia tăng xơ hóa mô ghép mà còn dẫn đến sự tăng biểu hiện của collagens nền, các yếu tố tăng trưởng khối u beta (TGF-β), MMP2 và -9, cùng với tín hiệu của quá trình chuyển đổi biểu mô (EMT) trong mẫu sinh thiết thận.
Đáp ứng miễn dịch thích ứng đối với virus BKV thường xảy ra nhanh chóng sau khi tiếp xúc với kháng nguyên Virus BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến sự phát triển của các kháng thể trung hòa đặc hiệu Nghiên cứu của Egli và cộng sự đã chỉ ra tầm quan trọng của phản ứng này trong việc bảo vệ cơ thể chống lại BKV.
Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận
1.3.1 Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận
Luận văn thạc sĩ Khoa học nhận như là một dấu ấn liên quan đến sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép với liều quá cao [35]
Năm 2002, nghiên cứu của Hirsch và cộng sự đã theo dõi sự hoạt động của BKV ở 78 bệnh nhân ghép thận Kết quả cho thấy BKV được phát hiện trong máu trung bình vào tuần thứ 23 sau ghép, trong khi 5 bệnh nhân phát triển BKVN trung bình vào tuần thứ 28.
Nghiên cứu cho thấy tải lượng BKV-DNA ở bệnh nhân BKVN cao hơn so với bệnh nhân không BKVN Thakur và cộng sự đã theo dõi sự tái hoạt động của BKV ở 32 bệnh nhân ghép thận trong 3 năm, phát hiện tỷ lệ BKV cao nhất trong nước tiểu và máu khoảng 1 tháng sau ghép Almeras và cộng sự cũng đã thực hiện các nghiên cứu liên quan.
Trong một nghiên cứu kéo dài 12 tháng với 119 bệnh nhân, tỷ lệ dương tính với BKV là 10,9%, với thời gian phát hiện trung bình là 90 ngày (dao động từ 23 đến 214 ngày) Đặc biệt, 77% bệnh nhân có virus trong máu trước tháng thứ 4 Tất cả bệnh nhân dương tính đều có sinh thiết mô ghép, nhưng chỉ một người được chẩn đoán BKVN, với tải lượng virus ban đầu
10 7 copy/ml hay trong máu > 10 4 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm
Sau khi BKV tái hoạt động, virus có thể xuất hiện trong nước tiểu và trong máu sau vài tuần Mặc dù hiếm gặp, đã có báo cáo về những trường hợp bệnh nhân phát triển virus trong máu mà không có virus trong nước tiểu.
BKV trong máu có giá trị chẩn đoán dương cao hơn so với BKV nước tiểu, làm cho việc sàng lọc BKV máu trở thành chiến lược lý tưởng được nhiều tổ chức thận uy tín áp dụng Bệnh nhân ghép thận có dấu hiệu nghi ngờ BKVN nên thực hiện xét nghiệm real-time PCR để xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và nước tiểu Khi chỉ số BKV vượt ngưỡng cho phép, cần tiến hành sinh thiết thận để khẳng định chẩn đoán Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh nhân có nguy cơ mất chức năng thận ghép hoặc mất thận ghép cao Do đó, việc theo dõi và giám sát hoạt động của BKV là rất quan trọng trong việc chẩn đoán sớm BKVN và quản lý điều trị thuốc ức chế miễn dịch.
1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận
BKV được phân lập từ nhiều khu vực địa lý khác nhau trên toàn cầu, và được phân loại thành bốn kiểu gen (BKV-I, II, III, IV) dựa trên phương pháp huyết thanh học.
Kiểu gen BKV phổ biến nhất trong quần thể người khỏe mạnh là kiểu gen I, chiếm 80%, tiếp theo là kiểu gen IV với 15%, trong khi kiểu gen II và III rất hiếm, chỉ khoảng 2% Phân loại BKV-I được chia thành 4 phân nhóm: I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c, trong khi BKV-IV có 6 phân nhóm đa dạng hơn: IV/a-1, IV/a-2, IV/b-1, IV/b-2, IV/c-1, IV/c-2 Sự phân bố của các kiểu gen BKV và phân nhóm BKV đã được nghiên cứu rộng rãi trên toàn cầu, với phân nhóm I/a phổ biến ở châu Phi, I/b-1 ở Đông Nam Á, I/b-2 ở châu Âu và I/c ở Đông Bắc Á Mỗi phân nhóm BKV-IV cũng tương ứng với một vị trí địa lý cụ thể.
Trong nghiên cứu huyết thanh học, các kiểu gen BKV (I-IV) là các kiểu huyết thanh hoàn toàn khác biệt Hầu hết người khỏe mạnh có kháng thể trung hòa kiểu gen I, trong khi không hình thành kháng thể trung hòa cho kiểu gen III hoặc IV Các phân nhóm I/b-1, I/b-2 hoạt động như các kiểu huyết thanh riêng biệt, và sự khác biệt này được chi phối bởi vị trí gắn kết thụ thể glycan trên bề mặt virion Tất cả các phân nhóm kiểu gen IV có cùng một kiểu huyết thanh duy nhất Mỗi kiểu huyết thanh trung hòa liên kết với một phổ thụ thể bề mặt tế bào riêng biệt, cho thấy sự khác biệt về mức độ nhân lên và khả năng gây bệnh của các kiểu gen BKV Những cá thể đã nhiễm một kiểu huyết thanh BKV vẫn có nguy cơ tổn thương khi nhiễm kiểu huyết thanh khác sau điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch tế bào T, điều này quan trọng vì nhiễm BKV sau ghép thận thường xuất phát từ người cho thận Người nhận ghép thiếu kháng thể trung hòa chống lại BKV có nguy cơ cao về nồng độ BKV-DNA trong máu sau ghép thận Nghiên cứu cho thấy 83 đến 98% dân số có phản ứng kháng thể với protein capsid chính (VP1) của kiểu gen BKV-I khi họ 21 tuổi.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Các kiểu gen BKV I-IV và các biến thể khác đã được phát hiện ở bệnh nhân BKVN Phân tích trình tự gen VP1 từ mẫu thận của bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép cho thấy sự tồn tại của các "điểm nóng" đa hình, với sự biến đổi không ổn định theo thời gian Các đột biến tập trung tại vòng lặp BC trong vùng VP1, nơi liên kết với thụ thể, dẫn đến khả năng lây nhiễm kém hơn so với chủng hoang dã trên một số dòng tế bào Tuy nhiên, những "điểm nóng" này có thể giúp virus thoát khỏi sự kiểm soát của hệ miễn dịch Thêm vào đó, sự thay đổi chuỗi axit amin có thể ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein, tạo ra nguy cơ tiềm ẩn.
Sự thay đổi axit amin trong khu vực VP1 đã được phát hiện ở các mẫu nước tiểu từ nhóm bệnh nhân ghép thận không phát triển BKVN và nhóm bệnh nhân BKVN Phân tích di truyền cho thấy khu vực này chứa vùng biến đổi cao của bộ gen BKV từ nucleotide 1744 đến 1812, tương ứng với axit amin 61.
Nghiên cứu của Tremolada S và các cộng sự chỉ ra rằng có 83 sự thay thế axit amin, trong đó một số thay thế được bảo tồn vĩnh viễn ở kiểu gen I-IV, trong khi một số khác chỉ mang tính tạm thời.
(2010) cho thấy sự thay đổi axit amin K69R và E73Q chỉ gặp ở những bệnh nhân BKVN [84]
Các phương pháp xét nghiệ m ch ẩn đoán BKV
Chẩn đoán sớm bệnh virus BK (BKVN) sau khi ghép thận gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu Nhiều trường hợp có thể bị nhầm lẫn với giai đoạn thải ghép cấp tính khi bệnh nhân đang sử dụng thuốc ức chế miễn dịch.
Quy trình chẩn đoán BKV hiện nay thường bao gồm xét nghiệm nước tiểu để phát hiện "tế bào bẫy" (decoy cell) và thể "Haufen", cũng như định lượng BKV trong nước tiểu và máu bằng kỹ thuật real-time PCR Thể Haufen có thể được phát hiện qua kính hiển vi điện tử và có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, với giá trị chẩn đoán dương tính và âm tính đều trên 97% Nước tiểu có thể được sàng lọc cho BKV thông qua phương pháp tế bào học hoặc định lượng BKV-DNA, trong đó tế bào decoy là các tế bào biểu mô ống thận nhiễm BKV So với PCR nước tiểu, tế bào decoy có độ nhạy chỉ 25% và độ đặc hiệu 84%, trong khi PCR nước tiểu đạt độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 78% Tuy nhiên, các kết quả ban đầu này cần được nghiên cứu thêm.
Luận văn thạc sĩ Khoa học cho thấy việc sử dụng số mẫu lớn hơn có thể tạo ra một phương pháp sàng lọc BKVN không xâm lấn và tiết kiệm chi phí, nếu được kiểm chứng.
Xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học, bao gồm hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ hay PCR, kết hợp với bằng chứng viêm thận kẽ hoặc creatinine huyết thanh cao, vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN Xét nghiệm này nên được thực hiện ít nhất hai lần để giảm thiểu sai số trong việc lấy mẫu, ưu tiên các mẫu chứa mô tế bào tủy thận Khi có kết quả BKV trong máu kèm theo creatinine huyết thanh tăng cao hoặc tình trạng virus trong máu kéo dài dù đã giảm ức chế miễn dịch, bệnh nhân cần được chỉ định xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học Chiến lược này dựa vào sự giảm BKV trong máu có giá trị trong vòng 6 tháng sau khi giảm ức chế miễn dịch, vì vậy việc theo dõi thường xuyên sự hiện diện của BKV trong máu rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận.
Hình 1 3 Các tếbào decoy trong nước tiểu [71]
1.4.3 Ch ẩn đoán sinh học phân tử
1.4.3.1 Dấu ấn sinh học Biomarker
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Dấu ấn sinh học mRNA trong BKVN đang thu hút sự chú ý, với giá trị 6,5 × 10^5 VP1 mRNA/ng RNA được xác định là ngưỡng dự báo BKVN, đã được xác nhận qua nghiên cứu sinh thiết Ngoài ra, mRNA granzyme B và mức mRNA protease inhibitor -9 trong nước tiểu cũng cho thấy khả năng dự đoán sự suy giảm chức năng ghép Cơ sở dữ liệu mRNA nước tiểu hứa hẹn cung cấp thông tin chẩn đoán và tiên lượng bổ sung cho sinh thiết thận trong tương lai.
Phát hiện BKV trong huyết plasma bằng kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy lên tới 100% và độ đặc hiệu khoảng 90%, với giá trị dự đoán dương tính (PPV) là 50% và âm tính (NPV) là 100%, vượt trội hơn so với việc phát hiện BKV-DNA trong nước tiểu Phương pháp này là lựa chọn lý tưởng cho các trung tâm ghép tạng, vì BKV trong máu có thể xuất hiện trong nước tiểu ở 30% người ghép thận Với ưu điểm của real-time PCR huyết plasma, không cần thực hiện xét nghiệm nước tiểu trước Tuy nhiên, sự khác biệt trong kỹ thuật giữa các phòng thí nghiệm gây khó khăn trong việc so sánh kết quả và xác định giá trị ngưỡng cho chẩn đoán BKVN Nghiên cứu của Bechert cho thấy sự khác biệt giữa các kỹ thuật real-time PCR, trong khi Hirsch xác định rằng mức BKV huyết plasma > 10^4 copy/ml trong hơn 4 tuần có độ đặc hiệu 93% liên quan đến BKVN, thông tin này cũng được nhấn mạnh trong các hướng dẫn gần đây.
Luận văn thạc sĩ Khoa học ghép tạng sử dụng và cùng khảo nghiệm, sự thay đổi được xác nhận là ít nhất 1 log nồng độ [24]
Xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học, bao gồm các phương pháp như hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ và PCR, cùng với bằng chứng viêm thận kẽ hoặc creatinine huyết thanh tăng cao, vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán BKVN Xét nghiệm nên được lặp lại ít nhất 2 lần để giảm thiểu sai số, ưu tiên mẫu có chứa mô tế bào tủy thận Khi có kết quả BKV trong máu kèm theo creatinine huyết thanh tăng cao hoặc tình trạng virus trong máu cao kéo dài, bệnh nhân cần được chỉ định sinh thiết mô bệnh học Chiến lược này dựa trên việc giảm BKV trong máu có giá trị trong 6 tháng sau khi giảm ức chế miễn dịch, do đó việc theo dõi thường xuyên BKV trong máu là rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận.
Tình hình nghiên c ứ u BKV
1.5.1 Tình hình nghiên c ứu phát triển kit
Nồng độ BKV-DNA được xác định bằng kỹ thuật real-time PCR với đầu dò huỳnh quang, so sánh số lượng bản sao khuếch đại với đường cong chuẩn từ các pha loãng nồng độ BKV-DNA đã biết Sự phát triển xét nghiệm tại các phòng thí nghiệm khác nhau dẫn đến sự khác biệt về kết quả định lượng và ngưỡng phát hiện Các yếu tố như nguồn mẫu, quy trình tách chiết DNA, trình tự primer, probe và chủng BKV sử dụng để thiết lập đường chuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng, gây khó khăn trong quyết định can thiệp điều trị lâm sàng Phần lớn các xét nghiệm real-time PCR định lượng dựa vào chủng BKV kiểu gen I (Dunlop) làm trình tự tham chiếu cho thiết kế mồi và probe.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Năm 2008, Hoffmann và cộng sự đã so sánh kết quả từ 7 kit thương mại khác nhau, phát hiện sự không nhất quán trong 23% xét nghiệm sử dụng mẫu lâm sàng (MPS) và 94% xét nghiệm sử dụng chủng Dunlop Hiện tượng này chủ yếu xảy ra ở kiểu gen III và IV do sự không phù hợp của primer, probe và đa hình trình tự BKV-DNA Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng các thử nghiệm PCR BKV sử dụng kiểu gen I làm mẫu tham chiếu có thể ít nhạy hơn với các dòng biến thể, với ngưỡng phát hiện 104 copy/μl cho biến thể so với 10 copy/μl cho kiểu gen I Điều này cần được lưu ý vì các biến thể phụ hiếm gặp của BKV có liên quan đến BKVN, gây khó khăn trong việc phát hiện với tải lượng virus thấp Để khắc phục, các xét nghiệm nên được thực hiện tại một phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn, và trong trường hợp nghi ngờ về các biến thể hiếm gặp, cần thực hiện phân tích sâu hơn về kiểu gen Với các lựa chọn điều trị BKVN hiện còn hạn chế, việc sàng lọc BKV theo quy trình giúp chẩn đoán sớm và can thiệp điều trị phù hợp trước khi bệnh phát triển thành BKVN là rất quan trọng.
Nghiên cứu của Iwaki KK và cộng sự năm 2010 tại Nhật Bản đã phát triển kỹ thuật real-time PCR để định lượng BKV, tập trung vào phân tích các điểm đa hình trong vùng VP2 của BKV Nghiên cứu sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích, bao gồm biến đổi trình tự nucleotide và so sánh axit amin trong vùng gen đích của các thành viên họ Polyomaviridae, từ đó thiết kế mồi và probe cho xét nghiệm PCR Kết quả sơ bộ cho thấy thử nghiệm BKV có dải nồng độ rộng 6 log, với giới hạn phát hiện thấp nhất là 1,5 x 10^1 copy/phản ứng và độ chính xác cao.
Luận văn thạc sĩ Khoa học ứng thấp (CV < 5%) cung cấp thông tin quan trọng về độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với BKV Công bố này có giá trị trong việc đánh giá tác động của các biến thể trình tự vùng VP2, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu phân tử BKV cho các nghiên cứu dịch tễ học.
Nghiên cứu tại Mỹ năm 2016 đã so sánh nồng độ BKV-DNA khi thiết kế mồi và probe dựa trên trình tự gen VP1 và LTA Kết quả phân tích hồi quy probit cho thấy giới hạn phát hiện của kỹ thuật real-time PCR dựa trên VP1 là 1,8 x 10² copy/ml và LTA là 3,5 x 10² copy/ml với độ tin cậy 95% Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này trên 116 mẫu bệnh phẩm lâm sàng lần lượt là 90%, 96% cho VP1 và 97%, 98% cho LTA.
1.5.2 Tình hình nghiên c ứu hiện trạng nhiễm BKV Ở nước ta cho đến nay mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm BKV ở bệnh nhân sau ghép thận Năm 2015, Hà Phan Hải An và cộng sự đã báo cáo một ca lâm sàng BKVN tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức ở một bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối được ghép thận từngười cho sống Sau ghép 8 tháng bệnh nhân cú biểu hiện tăng creatinine mỏu (156 àmol/l) trong khi đú tỡnh trạng lõm sàng vẫn ổn định và các xét nghiệm chức năng khác trong giới hạn bình thường Để xác định nguyên nhân gây suy chức năng thận ghép, bệnh nhân được chỉ định xác định tải lượng BKV và sinh thiết thận ghép chẩn đoán mô bệnh học Kết quả xét nghiệm xác định BKV bằng kỹ thuật real-time PCR cho thấy: BKV nước tiểu: 8,27x10 10 copy/ml; BKV máu: 1,7x10 4 copy/ml Kết quả sinh thiết thận ghép cho thấy có hình ảnh tổn thương ống thận và mô kẽ, thâm nhập tếbào đơn nhân mô kẽ Không thấy có dấu hiệu tập trung tế bào viêm ở mao mạch quanh ống thận và ở ống thận, nhuộm hóa mô miễn dịch với CD4 âm tính Từ các kết quả xét nghiệm, bệnh nhân được chẩn đoán BKVN và được điều trị bằng điều chỉnh thuốc ức chế miễn dịch, chức năng thận ghép được cải thiện và ổn định, tuy nhiên không thể hồi phục về
Luận văn thạc sĩ Khoa học tình trạng ban đầu ngay sau ghép nhấn mạnh rằng chẩn đoán BKVN sau ghép gặp nhiều thách thức nếu không có phương pháp tiếp cận đúng Việc chỉ định xét nghiệm xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và nước tiểu là rất quan trọng cho việc chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị BKVN.
Công bố của Trịnh Hùng và cộng sự đã phát hiện 2 trường hợp nhiễm BKV
Trong quá trình sàng lọc và theo dõi điều trị sau ghép thận tại Bệnh viện 19-8, đã ghi nhận một trường hợp đồng nhiễm BKV và CMV Bệnh nhân sau ghép thận cần được theo dõi chặt chẽ nguy cơ nhiễm BKV, đặc biệt trong năm đầu tiên Việc sử dụng các công cụ chẩn đoán như BKV-DNA trong nước tiểu và huyết tương, cùng với đánh giá mô bệnh học thận, rất quan trọng để chẩn đoán sớm Điều trị bằng cách giảm liều thuốc ức chế miễn dịch nhằm ngăn ngừa tiến triển suy thận ghép đã cho thấy hiệu quả nhất định.
Phương pháp xây dự ng cây ch ủ ng lo ạ i phát sinh
Cây phát sinh chủng loại (phylogenic tree) mô tả lịch sử tiến hóa của các loài có mối quan hệ họ hàng và tổ tiên chung Nghiên cứu cây chủng loại có thể được thực hiện qua nhiều phương pháp, bao gồm so sánh hóa thạch, di chỉ cổ sinh vật học, đặc điểm hành vi của sinh vật, và phân tích trình tự DNA trong sinh học phân tử và hệ gen học.
Các chỉ số đại diện cho độ tin cậy của cây chủng loại bao gồm chỉ số bootstrap, chỉ số CI và chỉ số RI Chỉ số bootstrap thể hiện tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trong số lần giản đồ được thiết lập, được tính bằng phần trăm (%) Theo Felsenstein (1985), bootstrap là công cụ hỗ trợ quan trọng trong việc xây dựng cây phát sinh loài, cho thấy độ tin cậy của sự gần gũi giữa các thành viên trong nhóm Bên cạnh đó, chỉ số CI (Consistency Index) đo lường mức độ tương thích giữa một cây cụ thể và tổng số cây được phân tích.
Luận văn thạc sĩ Khoa học nhánh ít nhất cho thấy rằng giá trị CI (Consistency Index) biến động từ 1.0 (tương thích tối đa) đến gần 0 (ít tương thích nhất), với giá trị CI càng lớn thì mức độ tin cậy của kết quả càng cao Bên cạnh đó, chỉ số RI (Retention Index) phản ánh số lượng tính trạng tương đồng giữa hai hoặc nhiều giống có cùng tổ tiên trên cây phân loại.
1.6.2 Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại
Hai tiêu chí chính để phân loại các phương pháp xây dựng cây phát sinh là loại dữ liệu đầu vào và thuật toán xác định cây Dữ liệu đầu vào có thể là dữ liệu phân tử hoặc dữ liệu khoảng cách.
Dữ liệu phân tử được đặc trưng bởi các chuỗi liên kết như nucleotide hoặc axit amin, trong khi dữ liệu khoảng cách là ma trận thể hiện thước đo khoảng cách tiến hóa giữa các cặp trình tự Ưu điểm nổi bật của dữ liệu khoảng cách là khả năng tính toán nhanh chóng các cây phát sinh, tuy nhiên, quá trình chuyển đổi từ dữ liệu phân tử sang dữ liệu khoảng cách có thể dẫn đến mất mát thông tin quan trọng.
Phương pháp khoảng cách chỉ áp dụng cho dữ liệu khoảng cách, dựa trên việc so sánh từng cặp trình tự để xác định khoảng cách di truyền Thuật toán sẽ dừng lại khi tất cả các chuỗi đã được phân nhóm, từ đó xác định cấu trúc liên kết cây Hai thuật toán chính trong phương pháp khoảng cách là UPGMA (Phương pháp nhóm cặp không trọng số sử dụng trung bình số học) và NJ (Nhóm lân cận).
UPGMA là thuật toán đơn giản nhất để xây dựng cây phylogenetic, dựa trên giả định rằng tốc độ tiến hóa của các chuỗi là không đổi trên tất cả các nhánh (giả định đồng hồ phân tử) Mặc dù giả định này khó có thể đạt được khi các trình tự có khoảng cách tiến hóa lớn, nhưng UPGMA vẫn có ưu điểm là tạo ra cây có gốc một cách nhanh chóng.
Phương pháp Neighbor-Joining (NJ) là một kỹ thuật phân cụm tiến hóa tối thiểu, khác với UPGMA ở chỗ không giả định tốc độ tiến hóa đồng nhất trên tất cả các nhánh của cây NJ điều chỉnh tỷ lệ biến thể giữa các nhánh, bắt đầu với một cây gốc hình sao, và tiến hành phân tích từng cặp để xây dựng cây phân loại chính xác hơn.
Luận văn thạc sĩ Khoa học đánh giá tất cả các chiều dài nhánh để hình thành cây Cặp nhánh có tổng chiều dài nhỏ nhất sẽ có mối quan hệ gần nhất và được kết nối để tạo thành nhánh mới Quá trình này tiếp tục cho đến khi chỉ còn một điểm đầu và một điểm cuối Phương pháp NJ nhanh chóng và thường mang lại kết quả tốt hơn so với phương pháp UPGMA.
Phương pháp dựa trên ký tự có thể áp dụng cho cả dữ liệu chuỗi và khoảng cách, với mục tiêu tạo ra các cấu trúc liên kết cây từ chuỗi đầu vào Cây có xác suất xuất hiện cao nhất được xem là cây phù hợp nhất với dữ liệu Tuy nhiên, nhược điểm của các thuật toán này là thời gian xử lý lâu do số lượng cấu trúc cây tăng nhanh khi số lượng trình tự tăng Mặc dù có các phương pháp tìm kiếm không cần đánh giá tất cả các cây, việc đánh giá nhiều cây khác nhau vẫn làm cho phương pháp dựa trên ký tự tốn thời gian hơn so với phương pháp phân cụm Trong khi phương pháp phân cụm cho kết quả chỉ trong vài giây, phương pháp ký tự có thể mất từ vài phút đến hàng giờ, tùy thuộc vào số lượng và độ dài của trình tự Ưu điểm chính của phương pháp dựa trên ký tự là khả năng tính toán các chuỗi tổ tiên mà không làm mất thông tin, nhờ vào việc xử lý trực tiếp trên dữ liệu căn chỉnh chuỗi Thuật toán này bao gồm hai phương pháp chính.
Phương pháp Tối đa Parsimony (MP) dựa trên triết lý của William of Ockham, cho rằng giả thuyết tốt nhất để giải thích một quá trình là giả thuyết có ít giả định nhất Phương pháp này được áp dụng để xây dựng cây phát sinh bằng cách tính toán số lượng thay thế tối thiểu trên tất cả các vị trí của cấu trúc liên kết, từ đó xác định chiều dài cây Cây MP là cây có chiều dài tối thiểu, mang lại lợi ích trong việc phù hợp với các chuỗi có liên quan xa, nhờ vào thông tin trong một số vị trí bảo tồn không bị mất khi sử dụng các phương pháp khoảng cách cho các chuỗi.
Phương pháp Maximum Likelihood (ML) là một trong những kỹ thuật phân tích dữ liệu tốn thời gian nhất, nhưng lại mang lại kết quả đáng tin cậy nhất Với khả năng tái cấu trúc cao, ML giúp tối ưu hóa quá trình ước lượng tham số trong mô hình thống kê, từ đó nâng cao độ chính xác của các dự đoán.
Luận văn thạc sĩ Khoa học yêu cầu xác định chính xác các mối quan hệ giữa các chuỗi đã được tách ra trong thời gian dài hoặc đang phát triển nhanh chóng, cần một phương pháp sửa chữa cho nhiều sự kiện đột biến tại cùng một vị trí Phương pháp này sẽ tính toán xác suất mà một cây tiến hóa có thể được hình thành từ chuỗi trình tự phân tích tương ứng với mỗi mô hình tiến hóa được chọn Cây tiến hóa có xác suất cao nhất sẽ được chọn làm cây cuối cùng.
1.6.3 Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV
Kiểu gen BKV có thể được xác định thông qua phương pháp huyết thanh học và sinh học phân tử Hiện nay, nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, việc xác định kiểu gen BKV có thể thực hiện bằng các phương pháp như PCR, real-time PCR đa mồi và RFLP Tuy nhiên, giải trình tự và xây dựng cây chủng loại phát sinh là phương pháp tối ưu nhất, đảm bảo độ tin cậy và chính xác cao, đồng thời cho phép phân tích các đột biến SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ảnh hưởng đến độc lực của virus.
Việc chọn gen đích và phương pháp xây dựng cây chủng loại phù hợp là yếu tố quan trọng để xác định kiểu gen với độ tin cậy cao Nghiên cứu của Zhang-Yang Wang và cộng sự (2015) cho thấy rằng trên 23 mẫu huyết tương và 95 mẫu nước tiểu dương tính với BKV, độ tin cậy của các phương pháp phân tích UPGMA và Neighbour Joining không cao, với giá trị bootstraps chỉ đạt từ 25%-61% và 0%-17% Phân tích phát sinh dựa trên trình tự gen VP2 cho thấy phương pháp NJ không tạo ra cây phát sinh gen phù hợp, trong khi UPGMA cho kết quả tốt hơn Ngoài ra, đa hình xuất hiện nhiều ở gen kháng nguyên T lớn, chiếm 11,39% trong tất cả các vị trí nucleotide, và các locus đa hình BKV cũng được phát hiện khi so sánh các vùng kiểm soát không mã hóa (NCCR) Nghiên cứu của Luo C và cộng sự cho thấy cây phát sinh gen dựa trên kháng nguyên T lớn (LTA) có thể phân nhóm kiểu gen I thành các phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c với giá trị bootstrap đạt 100%, vượt trội hơn so với các giá trị bootstraps trước đó.
V Ậ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Nguyên li ệ u
Mẫu huyết tương và nước tiểu của 131 bệnh nhân ghép thận (được thu thập tại cùng một thời điểm sau ghép) tại Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn từnăm
Mẫu nước tiểu được thu thập trong ống fancol 50 ml, ly tâm 3200 vòng/phút, thu cặn nước tiểu, bảo quản -80 o C cho đến khi tách chiết DNA
Mẫu máu được chống đông bằng K2/EDTA và sau đó được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu hồi huyết tương Huyết tương này được bảo quản ở nhiệt độ -80 oC cho đến khi tiến hành tách chiết DNA Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Vi sinh và các mầm bệnh Sinh học, thuộc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y.
+ Dòng tế bào khả biến Escherichia DH5α được cung cấp bởi hãng ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ
Vector pGEM T easy cho phép chèn các đoạn DNA có kích thước từ 6 bp đến 10 kp, với kích thước plasmid nhỏ giúp quá trình biến nạp diễn ra dễ dàng Hai đầu dính T của vector hỗ trợ việc gắn kết đoạn chèn một cách thuận tiện, trong khi sản phẩm PCR đầu bằng do DNA polymerase tạo ra có thể gắn trực tiếp vào vector sau khi thêm đầu A, đạt hiệu suất 99% trong vòng 5 phút DNA tái tổ hợp có khả năng biến nạp vào tất cả các chủng E coli trong phòng thí nghiệm Vector này chứa gen kháng kháng sinh ampicilin, cho phép các tế bào nhận vector phát triển trên môi trường chọn lọc ampicilin Đặc biệt, gen lac Z bị gián đoạn bởi đoạn chèn tại vị trí đa điểm, khiến chỉ những vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp mới tạo thành khuẩn lạc màu trắng.
Luận văn thạc sĩ Khoa học không có đoạn chèn sẽ hiển thị màu xanh nhờ hoạt động của gen lacZ, mã hóa enzyme β-galactosidase Enzyme này kết hợp với cơ chất X-gal và IPTG để tạo ra sản phẩm có màu xanh.
Bộ mẫu chuẩn RealStar® BKV PCR Kit được phát triển bởi hãng Altona, Đức, vào năm 2018, đã được hiệu chỉnh từ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới về BKV và được cấp chứng chỉ IVD của châu Âu Bộ mẫu này định lượng DNA đặc hiệu BKV với dải nồng độ từ 1.00E+01 đến 1.00E+4 [IU/µl] Kỹ thuật real-time PCR có độ nhạy trung bình cao, cho phép phát hiện chính xác sự hiện diện của BKV trong mẫu.
Mức độ copy polyomavirus được xác định là 0,712 copy/μl, dao động từ 0,404 đến 1,693 copy/μl với độ tin cậy 95% Độ đặc hiệu của phương pháp cũng đã được đánh giá trên các chủng polyomavirus khác và những mầm bệnh quan trọng đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bao gồm Cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, các loại virus viêm gan (A, B, C), Herpes simplex virus 1 và 2, Human herpesvirus 6A, 6B, 7, 8, Human immunodeficiency virus 1, JC virus, Simian virus 40 và Varicella-zoster virus.
+ Bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới ( 1st WHO International
Standard for BK Virus DNA (2016, NIBSC code: 14/212)
Vào năm 2006 và 2008, Tổ chức Y tế thế giới đã tổ chức cuộc họp quốc tế nhằm tiêu chuẩn hóa xét nghiệm BKV NAT, với sự tham gia của các chuyên gia từ trường đại học, ngành dược phẩm, và các tổ chức chính phủ Hai mẫu chuẩn BKV đông khô (subtype I/b-1 và subtype I/b-2) đã được gửi tới 33 phòng thí nghiệm từ 15 quốc gia để phân tích Kết quả cho thấy mẫu chuẩn thứ hai (code: 14/212) là phù hợp nhất để sử dụng làm mẫu trong xét nghiệm BKV.
Luận văn thạc sĩ Khoa học của WHO được công nhận theo tiêu chuẩn quốc tế, đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng bộ mẫu chuẩn Bộ mẫu này cũng là cơ sở để kiểm tra kỹ thuật real-time PCR tự phát triển trong nghiên cứu.
Các kit sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày cụ thể trong bảng 2.1
Trình tự các cặp mồi tham khảo từ các bài báo quốc tế và các cặp mồi tự thiết kế được cung cấp bởi IDT trong bảng 2.2
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Bảng 2 1 Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Tên kit, hóa chất Hãng sản xuất Cat No
Kit tách chiết DNA từmáu và nước tiểu
Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu
QIAamp DNA Blood Mini Kit
Kit tinh sạch DNA từ gel agarose:
Kit tinh sạch sản phẩm PCR:
Kit tách dòng: pGEM-T Easy Vector System
7 Dòng tế bào khả biến DH5α Invitrogen 18260517
Thermo Fisher QIAGEN Merck Merck iNtRON
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Bảng 2 2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu [82]
BKAS GCACTCCCTGCATTTCCAAGGG Mồi ngược, vòng ngoài
BKR TGCATGAAGGTTAAGCATGC Mồi ngược, vòng trong qBKF ATGGCCCCAACCAAAAGAA
Mồi xuôi realtime PCR qBKR TAGTTTTGGCACTTGCACGG Mồi ngược realtime PCR
Thi ế t b ị chính
• Máy PCR: Master cycler PCR (Eppendorf)
• Máy Real-time PCR: Rotor-Gene Q MDx (QIAGEN)
• Máy chụp ảnh gel (UVP Eppendorf)
• Máy lắc Gyromax 737R (Amerex instrument)
• Tủ cấy an toàn sinh học (Nuaire)
• Máy ly tâm lạnh (Heraeus)
Luận văn thạc sĩ Khoa học
• Máy đo quang phổ nanodrop (Quickdrop)
• Pippetman (Gilson, Haminlton, Bio-rad)
• Các thiết bị chuyên dụng khác
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phương pháp nghiên cứ u
- Thực nghiệm mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm với các kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử
Xử lý thống kê sinh học được thực hiện bằng SPSS phiên bản 20, bao gồm kiểm định khi bình phương cho biến định tính, kiểm định T student và Mann-Whitney cho biến định lượng Đường cong ROC được sử dụng với khoảng tin cậy 95%, trong đó ý nghĩa thống kê được công nhận khi ngưỡng p < 0,05.
- Phân tích trình tự gen: Bioedit, Mega 7.
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Đánh giá kỹ thuật real-time PCR
So sánh với kit thương mại Độ đặc hiệu, độ nhạy, ngưỡng phát hiện, độ ổn định
Thiết kế mồi, probe cho real-time PCR
Tách chiết BKV-DNA từ mẫu huyết tương hoặc nước tiểu
PCR với cặp mồi đặc hiệu BKV
Tinh sạch và giải trình
Xác định SNP, xây dựng cây chủng loại phát sinh, xác định kiểu gen BKV
Tối ưu kỹ thuật real-time PCR Phân tích ý nghĩa kiểu gen BKV với
BKVN và các yếu tố lâm sàng khác
Hiệu chỉnh nồng độ chuẩn theo WHO Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng
Luận văn thạc sĩ Khoa học
2.3.2 Xây d ựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR
2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm (máu hoặc nước tiểu) bằng bộ kit Exgene™ Blood SV (GeneAll, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Bước 1: Hỳt 20 àl protein K, 200 àl bệnh phẩm (huyết tương hoặc nước tiểu) và 200 àl Buffer AL vào ống eppendorf 1,5 ml Vortex hỗn hợp 4-6 giõy, ủ 56 o C trong 10 phút
Bước 2: Thờm 200 àl ethanol 96% vào hỗn hợp, chuyển dịch lờn Spin column Ly tâm 8.000 rpm, 1 phút Loại bỏ Collection tube chứa dịch.
Bước 3: Thờm 600 àl Buffer BW vào Spin column Ly tõm 8.000 rpm, 1 phút
Bước 4: Thờm 700 àl Buffer TW vào Spin column Ly tõm 8.000 rpm, 1 phút
Bước 5: Chuyển Spin column sang ống eppendorf 1,5 ml mới Thờm 54 àl Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2-5 phút Ly tâm 14.000 rpm, 1 phút
Bước6: DNA được bảo quản ở -20 o C
PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ để nhân đoạn gen mong muốn, với ba bước chính: biến tính, khuếch đại và kéo dài Nghiên cứu này sử dụng phương pháp PCR để thu sản phẩm khuếch đại gen VP1 với kích thước vòng ngoài 580 bp và vòng trong 327 bp Để giảm thiểu sự ức chế trong mẫu nước tiểu và tăng hiệu quả khuếch đại, mẫu bệnh phẩm được thực hiện Nested PCR với các cặp mồi đặc hiệu BKV Sau khi tinh sạch sản phẩm Nested PCR và giải trình tự, kết quả được phân tích.
Luận văn thạc sĩ Khoa học trình bày việc so sánh trình tự và xây dựng cây chủng loại phát sinh để xác định kiểu gen BKV ở bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam Thành phần của PCR và Nested PCR được nêu rõ trong bảng 2.3.
Bảng 2 3 Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1
Hóa chất Thể tích Hóa chất Thể tích
Master mix Gotaq Green 10 Master mix Gotaq Green 10
Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng giúp loại bỏ các thành phần dư thừa và sản phẩm không đặc hiệu, từ đó tạo điều kiện tốt nhất cho quá trình lai Việc sử dụng GeneJET PCR Purification Kit trong quy trình tinh sạch giúp đảm bảo rằng DNA tái tổ hợp không chứa các đoạn chèn không mong muốn, nâng cao độ chính xác và hiệu quả của phản ứng PCR.
- Bước 1: Thêm PB Buffer vào ống đựng sản phẩm PCR theo tỷ lệ 5:1
- Bước 2: Chuyển hỗn hợp lên Binding Column tube và ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.
- Bước 3: Chuyển Binding Column sang tube mới Thờm 500àl WB Buffer, ly tõm 13.000 rpm, 1 phút
- Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút
- Bước 6: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1.5 ml, thờm 30àl Elution Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
- Bước 7: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút, bỏ Binding Column, thu dịch và bảo quản ở -20 o C
Chất lượng của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di
2.3.2.4 Phương pháp điện di Điện di là phương pháp phổ biến để phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau Sau khi PCR, sản phẩm khuếch đại gen VP1 (580 bp) và sản phẩm Nested PCR (327bp) nhằm tăng hiệu quả khuếch đại gen VP1 được điện di trên gel agarose 1,2%; 110V, đệm TBE 0,5X Mặt khác, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp được thực hiện trên gel 1% Gel agarose được ngâm EtBr 30 phút, các sản phẩm được quan sát, phân tích bằng máy UV vis
• Phương pháp tạo tế bào khả biến
Tế bào khả biến có khảnăng nhận plasmid tái tổ hợp được chuẩn bịnhư sau:
+ Chủng vi khuẩn E coli DH5α được cấy ria trên đĩa LB đặc và nuôi cấy qua đêm ở 37 o C
+ Cấy một khuẩn lạc đơn trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở
Ở nhiệt độ 37 °C, chuyển 300 µl dịch nuôi cấy qua đờm vào 15 ml LB lỏng với tỷ lệ 1:50 Tiếp tục lắc ở 37 °C với tốc độ 200 vòng/phút cho đến khi giá trị A260 đạt từ 0,4 đến 0,6 Sau đó, chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm đã được giữ lạnh trên đá.
+ Ly tâm 5000 vòng/phút, 4 o C, 10 phút, thu cặn tế bào Hòa cặn trong 9 ml hỗn hợp dung dịch (MgCl 2 80 Mm và CaCl 2 20 Mm), ly tâm 5000 vòng/phút, 4 o C,
10 phỳt để thu cặn Hũa cặn trong 600 àl CaCl 2 100 Mm
Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 600 nm Pha loãng dịch với A 260 = 1 bằng glycerol 15% Chia dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (100 àl – 150 àl/ống) và giữ lạnh trên đá Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -80 o C.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phương pháp sốc nhiệt được sử dụng để biến nạp sản phẩm của phản ứng nối vào tế bào vi khuẩn Qua việc xử lý với CaCl2, màng tế bào vi khuẩn trở nên xốp, giúp DNA plasmid dễ dàng thâm nhập qua các lỗ trên màng khi nhiệt độ thay đổi đột ngột Các bước cơ bản trong quy trình biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt bao gồm:
+ Tế bào khả biến E coli được lấy ra từ tủ -80 o C, được làm tan từ từ trên đá trong 5 phút
Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 àl hỗn hợp phản ứng lai, sau đó lắc nhẹ để đảm bảo DNA phân bố đều trong dịch tế bào Cuối cùng, ủ mẫu trên đá trong 30 phút.
+ Mẫu được sốc nhiệt ở 42 o C trong 45 giây, sau đó được ủtrên đá 3 phút.
+ Bổ sung 1 ml môi trường dinh dưỡng SOC, nuôi cấy trong điều kiện lắc
+ Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút, trong 5 phút, loại bỏ
900 àl dịch phớa trờn, trải 100 àl dung dịch cũn lại trờn đĩa thạch LB cú bổ sung ampicilin (50 àl/ml), ủđĩa ở 37 o C, qua đờm.
• Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tếbào qua đêm
Khuẩn lạc được nuôi trên môi trường thạch rắn có bổ sung ampicilin, IPTG và Xgal, sau đó được chuyển vào 5 ml dung dịch LB lỏng có ampicilin (100 µl/ml) và lắc 200 vòng/phút qua đêm Sau đó, mẫu được ly tâm ở 4°C với tốc độ 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào Cuối cùng, cặn tế bào vi khuẩn được sử dụng để tách chiết plasmid.
Quy trình tách plasmid tái tổ hợp bằng GeneJET Plasmid Miniprep Kit:
Bước 1: Ly tâm dịch nuôi cấy trong 5 phút, 5.000 rpm, 4 o C
Bước 2: Thờm 250 àl Buffer 1 và mix đều
Bước 3: Thờm 250 àl Buffer 2, đảo ống 3-4 lần
Bước 4: Thờm 350 àl Buffer 3, đảo ống 3-4 lần
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 4 o C, 10 phút
Bước 6: Chuyển hỗn hợp vào ống Binding Column và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Bước 7: Loại bỏ ống chứa dịch, chuyển Binding Column sang ống mới, thêm 500 µl Buffer D và ủ trong 5 phút Sau đó, ly tâm ở 13.000 rpm trong 1 phút và loại bỏ ống chứa dịch.
Bước 8: Thờm 700 àl Buffer 4, ly tõm 13.000 rpm, 1 phỳt, loại bỏ tube chứa dịch Bước 9: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút
Bước 10: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1,5 ml Thờm 100 àl
Elution Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 11: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút Thu dịch, bảo quản ở -20 o C
Quy trình kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và AvaII:
Bước 1: Thiết lập phản ứng như bảng sau:
STT Thành phần phản ứng Thể tớch phản ứng (àl)
Bước 3: Điện di để kiểm tra kích thước sản phẩm
2.3.2.6 Thiết lập bộ mẫu chuẩn DNA
Nồng độ plasmid tái tổ hợp được xác định bằng hệ thống Nanodrop Từ nồng độ(ng/àl) quy đổi thành (copy/àl) theo cụng thức sau:
A: Nồng độ plasmid (ng/àl) N: Kích thước DNA tái tổ hợp (bp)
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Từ dung dịch plasmid ban đầu, 9 dải nồng độ pha loãng với cơ số 10 được tạo ra bằng cách pha loãng plasmid với nước khử ion [10]
2.3.2.7 Tối ưu hóa kỹ thuật real-time PCR Đểxác định điều kiện tốt nhất cho phản ứng real-time PCR, các thành phần của phản ứng real-time PCR được thay đổi với các nồng độ khác nhau Quá trình này bao gồm thử trên chu trình nhiệt, trong đó lần lượt thử ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước probe, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng real-time PCR Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay không Nếu nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả khuếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao Để tối ưu nồng độ mồi chúng tôi tiến hành các phản ứng real-time PCR giống nhau về thành phần và chu trình nhiệt, chỉ khác nhau về nồng độ mồi Chúng tôi tiến hành khảo sát thực hiện phản ứng real-time PCR với nồng độ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại từ 0,1 àM, 0,2 àM ; 0,3 àM ; 0,4 àM; 0,5 àM
Probe trong phản ứng PCR phải đặc hiệu với trình tự mục tiêu, và để phát tín hiệu huỳnh quang, mẫu dò cần nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược Trong phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò Taqman, việc khuếch đại không đặc hiệu có thể xảy ra do mồi sai vị trí hoặc hiện tượng nhị phân mồi, dẫn đến việc không tạo ra tín hiệu Do đó, nồng độ probe cũng ảnh hưởng đến mức độ phát huỳnh quang và khả năng đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng.
Nồng độ probe không phù hợp, quá cao hoặc quá thấp, sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả của phản ứng Để tối ưu hóa nồng độ probe cho phản ứng real-time RT-PCR, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng với thành phần và chu trình nhiệt giống nhau, chỉ khác nhau ở nồng độ probe.
Chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng real-time PCR với nồng độ probe ở các mức 0,05 àM, 0,1 àM, 0,15 àM và 0,2 àM trong luận văn thạc sĩ Khoa học.
K Ế T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
Xây d ựng quy trình định lượ ng BKV-DNA b ằ ng real-time PCR
3.1.1 Tách dòng vùng gen VP1
Để tạo đoạn chèn vùng gen VP1 vào vector tách dòng, DNA BKV được tách bằng bộ Exgen SV-mini blood kit (GeneAll) và sau đó khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu BKS/BKAS Kết quả PCR được hiển thị trong hình 3.1.
Hình 3 1 Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng
Chú thích: 1 Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 2 Đối chứng âm (nước thay cho DNA), 3-4 Mẫu dương tính với BKV.
Kết quả điện di cho thấy băng đặc hiệu có kích thước 580 bp, rõ nét và không có sản phẩm phụ, trong khi đối chứng âm không xuất hiện băng, chứng minh thao tác kỹ thuật đáng tin cậy Nghiên cứu này sử dụng Phusion High-Fidelity PCR master mix 2X, bao gồm Phusion DNA Polymerase, nucleotide, buffer và MgCl2 Phusion DNA polymerase có hai hoạt tính chính: 5’-3’ DNA polymerase và 3’-5’ exonuclease, với tỷ lệ lỗi thấp.
Phusion DNA polymerase có hiệu suất cao trong thời gian ngắn, ngay cả khi có mặt các chất ức chế phản ứng PCR, với nồng độ enzyme thấp hơn so với Taq DNA polymerase và Pfu DNA polymerase Cụ thể, nồng độ của Phusion DNA polymerase trong buffer HF là 4,4 x10^-7, thấp hơn 50 lần so với Taq và 6 lần so với Pfu Do đó, Phusion DNA polymerase được xem là lựa chọn tối ưu cho quá trình tách dòng.
Chu trình nhiệt phản ứng PCR với Phusion DNA polymerase có những khác biệt đáng chú ý so với các enzyme DNA polymerase khác Nhiệt độ biến tính được nâng lên 98 o C, cao hơn mức 95 o C của enzyme thông thường, giúp cải thiện khả năng phân tách DNA, đặc biệt là với các khuôn mẫu dài và giàu GC Thời gian cho các bước biến tính chỉ từ 5 đến 10 giây, trong khi thời gian kéo dài từ 15 đến 30 giây và gắn mồi là 10 giây.
30 giây)) giúp tiết kiệm thời gian nhưng hiệu quả PCR vẫn không thay đổi
Sau khi biến nạp, tế bào E coli DH5α được nuôi trong môi trường dinh dưỡng SOC trong 2 giờ 30 phút với tốc độ lắc 225 vòng/phút ở 37°C Sau đó, chúng được cấy trải trên môi trường LB-ampicilin (50 µg/ml)/IPTG/Xgal Sau 24 giờ, trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc trắng (chứa plasmid tái tổ hợp) và khuẩn lạc xanh (chỉ chứa plasmid).
Hình 3 2 Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Để xác định chính xác khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp, cần nuôi riêng rẽ các khuẩn trắng trong 5ml LB-ampicilin (100 µg/ml) trong 24 giờ với tốc độ lắc 225 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C Sau đó, tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI và AvaII Kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3 3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và AvaII
The recombinant plasmid was digested using the EcoRI enzyme, and the size of the resulting fragments was analyzed with a 1 kb marker and a 100 bp marker from Thermo Fisher, USA Additionally, the recombinant plasmid was also cut with the AvaII enzyme for further examination.
Plasmid tái tổ hợp có kích thước 3595 bp và chứa ba vị trí cắt của enzyme EcoRI, dẫn đến ba băng có kích thước 222 bp, 376 bp và 2997 bp khi được cắt Tiếp theo, plasmid được kiểm tra bằng enzyme AvaII, với bốn vị trí cắt, tạo ra bốn băng có kích thước 45 bp, 222 bp, 1529 bp và 1839 bp.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng hai enzyme cho thấy các sản phẩm thu được phù hợp với tính toán lý thuyết, xác nhận khả năng plasmid chứa đoạn chèn VP1 rất cao.
Sau đó, plasmid tái tổ hợp tiếp tục được giải trình tự theo nguyên lý Sanger
Máy ABI 3730XL sử dụng mồi của vector để thu thập trình tự gen Kết quả trình tự thu được đã được so sánh với các trình tự trong Ngân hàng gen quốc tế thông qua phần mềm Blast, xác nhận rằng plasmid chứa đoạn gen VP1-BKV với độ tin cậy 99% (Hình 3.4).
Hình 3 4 Kết quả so sánh trình tựđoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen
Quốc tế bằng phần mềm Blast
3.1.2 Thi ết lập bộ mẫu chuẩn
Sau khi tách chiết plasmid tái tổ hợp, nồng độ plasmid được xác định bằng máy Nanodrop (Quickdrop, USA) Kết quảnhư sau:
• A260/280 = 2,0 Đối với kết quả tách DNA tái tổ hợp cho thấy hàm lượng DNA khá cao Độ tinh sạch tốt (A260/A280 = 2,0), lượng mẫu tách được không lẫn nhiều RNA hoặc
Kết quả tách DNA plasmid trong luận văn thạc sĩ Khoa học protein đạt yêu cầu Từ nồng độ gốc, 9 dải nồng độ được pha loãng theo cơ số 10 trong dung dịch TE (pH=7,0) để tạo thành bộ mẫu chuẩn, phục vụ cho việc đánh giá kỹ thuật real-time PCR.
3.1.3 Thi ết kế mồi và probe cho real-time PCR
Mười mẫu PCR dương tính với cặp mồi BKS/BKAS đã được tách dòng và giải trình tự Kết quả giải trình tự cho phép so sánh trình tự BKV-DNA của các chủng khác nhau.
BK đã thực hiện việc phân lập tại Việt Nam và thiết kế mồi cùng probe cho phương pháp real-time PCR dựa trên phần mềm Primer 3 Các trình tự mồi và probe sau đó được xác minh bằng phần mềm Bioedit 7.0, như thể hiện trong hình 3.5.
Hình 3 5 Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR
Sau khi sử dụng phần mềm Bioedit 7.0 để so sánh, cặp mồi và probe được thiết kế cho real-time PCR không có vị trí mismatch nào và hoàn toàn phù hợp 100% với chủng BK đang lưu hành tại Việt Nam.
3.1.4 T ối ưu kỹ thuật real-time PCR Để xác định nồng độ các thành phần tham gia vào quá trình PCR nhằm đạt được hiệu quả khuếch đại tốt nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ mồi và nồng độ probe Kết quả tối ưu nồng đô mồi, probe được thể hiện ở hình 3.6 và 3.7
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Hình 3 6 Tối ưu nồng độ probe
Xác đị nh vai trò BKV-DNA v ớ i b ệ nh th ậ n do BKV
3.2.1 Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR
Mẫu bệnh phẩm gồm máu và nước tiểu thu thập tại cùng một thời điểm từ
131 bệnh nhân ghép thận được sàng lọc bằng kỹ thuật real-time PCR đểxác định tỷ lệlưu hành BKV Kết quảđược thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3 5 Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận
Thông số Dương tính Âm tính
Cả huyết tương và nước tiểu 53 (40,46%) 47 (35,88%)
Huyết tương hoặc nước tiểu 84 (64,12%) 47 (35,88%)
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Trong một nghiên cứu với 131 bệnh nhân, tỷ lệ BKV dương tính bằng phương pháp real-time PCR đạt 64,12% Trong số 84 bệnh nhân có BKV-DNA trong huyết tương hoặc nước tiểu, có 53 bệnh nhân (40,46%) dương tính trong huyết tương, 84 bệnh nhân (64,12%) dương tính trong nước tiểu, và 53 bệnh nhân (40,46%) dương tính cả hai Một nghiên cứu khác của Yoon.S.H và cộng sự (2015) trên 213 bệnh nhân ghép thận tại Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ nhiễm BKV trong máu lên đến 66,67% (142/213 trường hợp) Nghiên cứu gần đây tại Thái Lan vào năm 2018 cũng đã được thực hiện.
Nghiên cứu của Skulratanasak và cộng sự cho thấy tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận là 30,6%, với 53 trên 173 bệnh nhân dương tính Tương tự, nghiên cứu của Si-Mohamed A tại Pháp trên 855 bệnh nhân ghi nhận 460 bệnh nhân (53,80%) có sự hiện diện của BKV, trong đó 15% có BKV-DNA trong cả máu và nước tiểu, và 39% chỉ có trong nước tiểu Tỷ lệ BKV dương tính cao ở bệnh nhân ghép thận trong các nghiên cứu này cho thấy sự tương đồng với kết quả của Yoon.S.H và cộng sự.
(2015) [91] tại Hàn Quốc, Shenagari M (2017) [76] 69% tại Iran, Bicalho C S
Tỷ lệ nhiễm BKV ở Brazil đạt 62,4% vào năm 2018 Sự khác biệt này giữa các quốc gia có thể do nhiều yếu tố như vị trí địa lý, độ tuổi, giới tính của bệnh nhân và các phương pháp điều trị ức chế miễn dịch được áp dụng khác nhau.
3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN
Phân tích ROC bằng hồi quy logistic được sử dụng để dự đoán nguy cơ mắc BKVN dựa trên nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu của bệnh nhân ghép thận Kết quả phân tích được trình bày trong hình 3.13 và hình 3.14.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Hình 3 13 Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN
Hình 3 14 Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Từ kết quả của đường cong ROC cho thấy vùng diện tích dưới đường cong
Nghiên cứu cho thấy nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu lần lượt là 0,99 và 0,92 (p10^4 copy/ml và trong nước tiểu >10^7 copy/ml, cho độ đặc hiệu 93% Các nghiên cứu khác từ 2007-2008 cho thấy ngưỡng phát hiện trong máu dao động từ 4,2-4,5 log 10 (copy/ml).
Độ nhạy và độ đặc hiệu trong xét nghiệm máu đạt từ 96% đến 100% với ngưỡng 5,9-7,4 log 10 (copy/ml), trong khi độ đặc hiệu trong nước tiểu thấp hơn, chỉ từ 83% đến 96,4% Nghiên cứu của Kudose S và cộng sự (2014) chỉ ra rằng ngưỡng tốt nhất để dự đoán BKVN trong máu là 3,7 log 10 (copy/ml) và trong nước tiểu là 7,2 log 10 (copy/ml) Giá trị ngưỡng này phụ thuộc vào thiết kế primer, probe, lựa chọn gen đích và độ chính xác của nồng độ mẫu chuẩn Mặc dù có gợi ý cho ngưỡng trong máu là 10^4 copy/ml, nhưng để nâng cao độ đặc hiệu và chính xác trong chẩn đoán BKVN, cần thiết phải xác định giá trị ngưỡng riêng cho từng labo.
Dựa vào giá trị ngưỡng dự đoán BKVN trong máu và nước tiểu, 84 bệnh nhân ghép thận dương tính với BKV được phân chia thành ba nhóm: nhóm có nồng độ BKV-DNA trong huyết tương và nước tiểu vượt ngưỡng, nhóm có nồng độ BKV-DNA trong máu hoặc nước tiểu vượt ngưỡng, và nhóm có nồng độ BKV-DNA trong cả máu và nước tiểu đều dưới giá trị ngưỡng Kết quả quan sát được trình bày trong bảng 3.6.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Bảng 3 6 So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trịngưỡng dựđoán BKVN
Máu và nước tiểu trên giá trị ngưỡng log 10 IU/ml
Một trong hai trên giá trịngưỡng log 10 IU/ml
Máu và nước tiểu dưới giá trịngưỡng log 10 IU/ml
Nồng độ trung bình trong máu 5,59 ± 0,88 3,40 ± 0,95 2,17 ± 0,66
Nồng độ trung bình trong nước tiểu 9,54 ± 1,53 7,88 ± 1,69 3,55 ± 1,80
Sau khi thực hiện định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR ở bệnh nhân ghép thận, chúng tôi phát hiện 8 bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu vượt ngưỡng, với giá trị trung bình lần lượt là 5,59 ± 0,88 log 10 IU/ml và 9,54 ± 1,53 log 10 IU/ml Trong khi đó, 35 bệnh nhân khác có nồng độ BKV-DNA thấp hơn ngưỡng, trung bình là 2,17 ± 0,66 log 10 IU/ml trong máu và 3,55 ± 1,80 log 10 copy/ml trong nước tiểu Đặc biệt, 11 bệnh nhân (20,37%) có nồng độ BKV-DNA vượt ngưỡng, trong đó 2 bệnh nhân không bị BKVN mặc dù nồng độ BKV-DNA cao, và 1 bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA trong máu cao bị BKVN Kết quả cho thấy sự ổn định của BKV-DNA trong máu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với nước tiểu trong việc dự đoán BKVN Sự kết hợp giữa nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong việc chẩn đoán BKVN.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Để đánh giá vai trò của BKV-DNA, 84 bệnh nhân dương tính với BKV đã được phân chia thành hai nhóm: BKV dương tính và BKVN Nghiên cứu tiến hành đánh giá các yếu tố lâm sàng bao gồm giới tính, tuổi tác, liệu pháp miễn dịch và nồng độ creatinine Kết quả đánh giá chi tiết được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3 7 Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận
BKV-DNA trong máu (logIU/ml) 2,47 ± 0,91 5,50 ± 0,92 A) dẫn đến thay đổi axit amin từ Asp thành Asn với tần số 20% (5/25 mẫu) Đây là một SNP hiếm, không nằm trong phạm vi mà Jin và cộng sự mô tả năm 1993 để phân biệt các kiểu gen BKV, nhưng đã được Tremolada S và cộng sự ghi nhận vào năm 2010 là kiểu đột biến hiếm, thường xuất hiện trong nước tiểu của bệnh nhân BKVN.
Kết quả phân tích cho thấy 15 trình tự BKV-IV thuộc ba phân nhóm IV/a-1, IV/a-2 và IV/c-1 Để khảo sát sự đa dạng của trình tự nucleotide trong phân nhóm IV, các trình tự BKV-IV này đã được so sánh với các phân nhóm quốc tế IV/a-1 (AB269869), IV/a-2 (AB211389) và IV/c-1 (AB269867) Kết quả so sánh được trình bày trong bảng 3.11 và 3.12.
Bảng 3 11 Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV
SNP IV IV/a-1 IV/a-2 IV/c-1 Mẫu NC Tần số
1780/1781 GA GA GA GA GA/TC 14/15, 1/15
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Bảng 3 12 Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV
SNP Vị trí axit amin
Dunlop aa IV aa NC aa
Khác với phân nhóm I có trình tự nucleotide tương đồng cao, phân nhóm IV cho thấy sự đa dạng rõ rệt về các vị trí SNP so với chủng gốc.
Nghiên cứu của Jin L (1993) về chủng IV, Z19535, đã phát hiện 17 vị trí SNP khác biệt giữa chủng gốc và các chủng phân lập tại Việt Nam Nhiều SNP trong số này gây ra sự thay đổi trong axit amin Đáng chú ý, 8 trong 17 vị trí SNP xuất hiện đơn lẻ nhưng đều ảnh hưởng đến trình tự axit amin.
Các vị trí SNP 1737 và 1769 có tần suất cao trên các chủng Việt Nam, với 26,67% cho SNP 1737 (T=>C) dẫn đến sự thay đổi axit amin từ D thành N, và 20% cho SNP 1769 (G=>A) gây ra sự thay đổi từ R thành K Tuy nhiên, những SNP này không xuất hiện ở các phân nhóm IV khác.
Mặt khác, ở vị trí 1851, xuất hiện đa hình A (73,33%) và G (26,67%), trong đó đa