Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN T[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Hoàng Xuân Sử TS Mai Thị Đàm Linh Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn tơi xin trân trọng gửi tới TS Hồng Xuân Sử, người thầy truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học tận tình giúp đỡ, giảng giải hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn TS Đinh Thị Thu Hằng cán nhân viên phịng thí nghiệm “Vi sinh Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy, cô môn Vi sinh vật thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tơi q trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, 18 tháng năm 2020 Học viên Lê Thị Bảo Quyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa Axit amin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Bp Base pair BKV BK virus BKVN BK virus nephropathy CMV Cytomegalo virus Ct Cycle Threshold DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme - Linked - immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme) Etbr Ethidium Bromide EBV Epstein-Barr Virus HBV Hepatitis B virus HSV Herpes Simplex Herpes INF Intravenous Nutritional Fluid F/R Forward/ Reverase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IVD In vitro diagnostic JCV JC virus Kb Kilobase pairs LB Luria-Bertani NPV Negative predictive value PCR Polymerase Chain Reaction TNF Tumor Necrosis Factors PPV Positive predictive value RCF Relative centrifugal force RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic Rpm Revolutions per minute SOC Super Optimal broth Catabolite repression (Môi trường dinh dưỡng tối ưu) TBE Tris-boric-EDTA UV Ultra violet (Tử ngoại) DANH MỤC BẢNG Bảng Các kit tách chiết, hóa chất sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu .31 Bảng Thành phần điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1 35 Bảng Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm 42 Bảng Thành phần phản ứng real-time PCR 51 Bảng Đánh giá độ đặc hiệu .52 Bảng 3 Khảo sát độ nhạy kỹ thuật real-time PCR mẫu bệnh phẩm .56 Bảng Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl 58 Bảng Tỷ lệ nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận .61 Bảng So sánh ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng .65 Bảng Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng bệnh nhân ghép thận 66 Bảng Sự phân bố phân nhóm BKV 69 Bảng Vị trí SNP khác kiểu gen BKV-I BKV-IV 70 Bảng 10 Xác định vị trí SNP BKV-I vùng gen VP1 (1630-1956) .71 Bảng 11 Đa dạng SNP kiểu gen BKV-IV 72 Bảng 12 Trình tự axit amin vị trí SNP phân nhóm IV 73 Bảng 13 So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu .74 Bảng 14 Sự phân bố kiểu gen BKV theo số lâm sàng .77 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Cấu trúc virion BKV Hình Quá trình xâm nhiễm nhân lên BKV .9 Hình Các tế bào decoy nước tiểu 17 Hình Vector pGEM T easy .29 Hình Khuếch đại đoạn chèn cho tách dịng .45 Hình Kết sàng lọc plasmid tái tổ hợp mơi trường .46 Hình 3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme AvaII 47 Hình Kết so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự Ngân hàng gen Quốc tế phần mềm Blast 48 Hình Kiểm tra lại trình tự mồi probe cho real-time PCR .49 Hình Tối ưu nồng độ probe .50 Hình Tối ưu nồng độ mồi 50 Hình So sánh tương quan mẫu chuẩn WHO LDA .53 Hình Xác định khoảng định lượng mẫu chuẩn 56 Hình 10 Ngưỡng phát BKV-DNA mẫu bệnh phẩm .57 Hình 11 So sánh tương quan hai kit 58 Hình 12 Phân tích khác biệt hai kit 59 Hình 13 Đường cong ROC BKV-DNA máu nhằm phát BKVN 63 Hình 14 Đường cong ROC BKV-DNA nước tiểu nhằm phát BKVN63 Hình 15 Cây phát sinh lồi vùng gen VP1-BKV (1630-1956) .68 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học 1.2 Tổng quan BKV 1.2.1 Lịch sử phát BKV 1.2.2 Đặc điểm sinh học 1.3 Mối quan hệ BKV bệnh lý ghép thận 11 1.3.1 Mối tương quan nồng độ BKV-DNA bệnh lý ghép thận 11 1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV bệnh lý ghép thận 13 1.4 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV 16 1.4.1 Tế bào học 16 1.4.2 Sinh thiết thận 17 1.4.3 Chẩn đoán sinh học phân tử 17 1.5 Tình hình nghiên cứu BKV 19 1.5.1 Tình hình nghiên cứu phát triển kit 19 1.5.2 Tình hình nghiên cứu trạng nhiễm BKV 21 1.6 Phương pháp xây dựng chủng loại phát sinh 22 1.6.1 Định nghĩa 22 1.6.2 Đặc điểm phương pháp xây dựng chủng loại 23 1.6.3 Ứng dụng chủng loại phát sinh xác định genotype BKV 25 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên liệu 27 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 27 2.1.2 Các vật liệu 27 2.1.3 Hóa chất 29 2.2 Thiết bị 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR 34 2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV bệnh nhân ghép thận 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA real-time PCR 45 3.1.1 Tách dòng vùng gen VP1 45 3.1.2 Thiết lập mẫu chuẩn 48 3.1.3 Thiết kế mồi probe cho real-time PCR 49 3.1.4 Tối ưu kỹ thuật real-time PCR 49 3.1.5 Đánh giá kỹ thuật real-time PCR 52 3.1.6 Quy trình xác định tải lượng virus BK máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận 60 3.2 Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận BKV 61 3.2.1 Xác định tỷ lệ lưu hành BKV bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real-time PCR61 3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN 62 3.2.3 Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng 66 3.3 Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV 67 3.3.1 Xác định kiểu gen BKV lưu hành Việt Nam 67 3.3.2 Phân tích vị trí SNP-BKV vùng gen VP1 bệnh nhân ghép thận70 3.3.3 Đánh giá vai trò kiểu gen BKV với bệnh thận BKV 77 KẾT LUẬN 79 KIẾN NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 MỞ ĐẦU Ghép thận phương pháp điều trị thay hiệu cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong không điều trị khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận năm Cho đến nhiều sở y tế nước triển khai thành công kỹ thuật này, góp phần nâng cao chất lượng sống hiệu kinh tế cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Với đời loại thuốc ức chế miễn dịch hệ kèm theo tái hoạt động mạnh BK virus (BKV) khẳng định nguyên nhân quan trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức thận ghép, chí mơ ghép bệnh nhân sau ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi người nhận thận ghép cho thấy xuất sớm BKV máu nước tiểu, chí đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao xảy khoảng từ 1-3 tháng sau ghép Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận BKV) ước tính khoảng 110% năm đầu sau ghép thận, 50% trường hợp BKVN bị thải ghép hồn tồn [8] Hiện nay, vấn đề theo dõi giám sát nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận nước ta chưa nhận quan tâm mức sở y tế có khả thực ghép thận Chẩn đốn BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn biểu lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, dễ bỏ sót chẩn đốn nhầm với giai đoạn thải ghép cấp Sinh thiết thận coi tiêu chuẩn vàng xác định BKVN, lại phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng đào tạo chuyên sâu Trong đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR máu bệnh nhân ghép thận công nhận cơng cụ có giá trị tiên đốn BKVN [8] Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử BKV công bố Việt Nam Một số sở y tế sử dụng kit thương mại Realstar BKV PCR Kit (Altona Diagnostics, Germany), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Germany) … xác định tải lượng BKV-DNA, nhiên giá thành kit cao đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ, đồng thời chưa đề cập đến khía cạnh kit không phù hợp với số chủng BKV lưu hành Việt Nam Một số nghiên cứu đề nghị tải lượng BKV nước tiểu >107 copy/ml hay máu >104 copy/ml giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN [35] Tuy nhiên số xác giá trị ngưỡng cho phép phát BKVN phụ thuộc vào độ nhạy kỹ thuật real-time PCR tương tác virus người bệnh khu vực địa lý khác Mặt khác, BKV genotype I-IV biến thể khác virus tìm thấy bệnh nhân BKVN [7] Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép nhấn mạnh tồn “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian hầu hết trường hợp theo dõi [18] Các nghiên cứu in vitro gần phân nhóm biến thể cho thấy thay axit amin làm thay đổi khả tương tác virus với tế bào chủ, thay đổi độc lực virus với người bệnh [18] Như vậy, đa dạng đặc điểm di truyền BKV cần thiết để tìm kiếm mối quan hệ tiềm kiểu gen BK virus bệnh cảnh lâm sàng sau ghép thận Cho đến nay, nước ta có vài công bố ca lâm sàng nhiễm BKV bệnh nhân sau ghép thận Nhận thấy tính cấp thiết tình hình trên, chúng tơi thực đề tài với hai mục tiêu: Xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real-time PCR Xác định tỷ lệ lưu hành kiểu gen BKV, kết hợp phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV bệnh nhân ghép thận Việt Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học BK virus tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến người không gây triệu chứng lâm sàng, với tỷ lệ huyết dương tính người trưởng thành 80% Các nghiên cứu dịch tễ học thực nhiều quốc gia khác giới, Anh (tỷ lệ huyết dương tính trẻ em, 83%), Phần Lan (60%), Đức (71%), Ý (83%) [60] Nhiễm trùng tiên phát thường xảy thời thơ ấu, sau virus thiết lập trạng thái tiềm ẩn tế bào biểu mô thận biểu mô niệu đạo, với khoảng 60-90% người trưởng thành có kháng thể kháng BKV máu Ở người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả miễn dịch, tượng tái hoạt động BKV xuất BKV nước tiểu xảy [38] Sự tái hoạt động BKV kích hoạt phản ứng miễn dịch trung gian qua tế bào suy giảm, điển hình cá nhân bị suy giảm miễn dịch AIDS, phụ nữ có thai, bệnh nhân bị tiểu đường đặc biệt trường hợp ghép tạng Sau nhân lên, BKV vào mao mạch, xuất nước tiểu công phận ghép, dẫn đến tổn thương khác Khi nhân lên BKV bắt đầu xảy vùng vỏ thận có liên quan rõ rệt với hoại tử tế bào biểu mô ống thận nồng độ creatinine huyết tăng [42] Người ta cho chế dẫn đến rối loạn chức mô ghép thận đồng loại rò rỉ chảy ngược nước tiểu từ ống thận bị tổn thương vào khoang kẽ mao mạch quanh ống thận Do tổn thương hoại tử ống thận cấp đặc điểm quan trọng bệnh thận BKV yếu tố xác định BKVN [38] Sự tổn thương thận mạn tính BKV dẫn đến xơ hóa mơ kẽ thận khơng thể hồi phục teo ống thận Khoảng 1/3 số bệnh nhân xuất BKV nước tiểu phát triển BKV máu không can thiệp kịp thời phát triển thành BKVN (tỷ lệ dao động từ đến 10%) [71] Sự tái hoạt động BKV bệnh nhân ghép thận lần chứng minh qua phát tán virus nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến 60% bệnh nhân Dữ liệu từ Mạng lưới chia sẻ nội tạng Hoa Kỳ (The United Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương thận ghép liên quan đến BKV 7,5% (70/938) năm 2009 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68] Một số yếu tố nguy nhiễm BKV trước ghép bao gồm giới tính nữ, mơ ghép từ người cho chết não, chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể đặc hiệu BKV cao người cho thận, không phù hợp HLA người cho người Mỹ gốc Phi [8] Mức độ ức chế miễn dịch yếu tố nguy quan trọng bệnh nhân ghép thận dẫn tới nhiễm BKV phát triển BKVN, nhiên chưa có tiêu chuẩn liều lượng ức chế miễn dịch liên quan chắn đến xuất BK nước tiểu Bên cạnh đó, giả thuyết cho kháng thể huyết người cho ngun nhân làm tăng nguy nhiễm BKV BKVN bệnh nhân sau ghép thận gây nhiều tranh cãi Kết nghiên cứu Shah cộng (2000) [75], cho thấy trường hợp mà BKV âm tính huyết người nhận dương tính với huyết người cho có nguy phát triển BKVN cao (43%) Trong đó, Bohl cộng (2005) [25], lại ghi nhận nhóm có nguy cao phát triển BKVN (50%) nhóm huyết dương tính với BKV người cho người nhận Mặt khác, hai nghiên cứu, đồng kết nhiễm BKV thấp (10%) huyết đồng thời người cho người nhận âm tính với BKV Hơn nữa, Bohl cộng sự vắng mặt HLA-C7 người nhận có liên quan đến tăng nguy nhiễm trùng [25] Các yếu tố nguy sau ghép dẫn tới BKVN bao gồm tổn thương niệu quản, đái tháo đường, độ trễ chức thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, điều trị thải ghép cấp tính loại thuốc ức chế calcineurin steroid Ngồi ra, bệnh nhân có HLA ABO khơng tương thích với người cho tổn thương niệu quản đặt stent niệu quản dẫn tới nguy bị BKVN cao [8] Một số báo cáo cho thấy xuất BKV máu nước tiểu phát bệnh nhân ghép tạng khác [6], [49], ghép tim, phổi gan, nhìn chung có mặt BKV máu nước tiểu không liên quan đến chức thận suy giảm bệnh nhân [60], [71] Ở bệnh nhân ghép tế bào gốc, tái hoạt động BKV gắn liền với tình trạng viêm bàng quang xuất huyết với triệu chứng khó tiểu, tiểu máu Tỷ lệ nhiễm BKV nước tiểu dao động từ 50%-100% người nhận ghép tủy xương ghép tế bào gốc tạo máu vòng tháng sau cấy ghép [18] BKV báo cáo nguyên nhân gây hẹp niệu quản, hội chứng thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu bệnh đa hồng cầu liên quan đến polyomavirus BKV liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống cách tạo kháng thể chống lại DNA histones liên quan đến khối u ung thư [38] Hẹp niệu quản liên quan đến BKV báo cáo người nhận ghép thận người ghép tế bào gốc tạo máu Barasa.N cộng (2010) [63], ghi nhận trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu xuất loạt biến chứng sau ghép bao gồm hẹp niệu quản, viêm bàng quang xuất huyết hội chứng thận ứ nước Bệnh nhân định xét nghiệm máu với xuất herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép, BKV sau 28 ngày Mặt khác, lan rộng nhiễm trùng nội mô BKV ghi nhận có liên quan đến tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến tổn thương mao mạch, phù nề tăng sinh khối u hai bên thận Báo cáo Bratt G cộng (1999) [26], trường hợp bệnh nhân bị viêm võng mạc giai đoạn AIDS tiến triển, ghi nhận BKV liên quan chặt chẽ tới viêm phổi Hai trường hợp tử vong viêm phổi khác báo cáo, bệnh nhân sau ghép tế bào gốc tạo máu bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính giai đoạn hóa trị liệu [4], [89] 1.2 Tổng quan BKV 1.2.1 Lịch sử phát BKV BKV phát lần đầu vào năm 1971, phịng thí nghiệm nghiên cứu virus thuộc Lodon, Anh Trong nghiên cứu dịch tễ học nhiễm cytomegalovirus người nhận ghép thận, Sylvia Gardner quan sát thấy mụn cóc sinh dục chứa hạt virus tương tự papillomavirus bệnh nhân nam người Sudan Những báo cáo tương tự tình trạng mụn cóc xuất nhiều bệnh nhân ghép thận cơng bố trước đó, nhiên, yếu tố quan trọng lâm sàng bệnh nhân tượng hẹp niệu quản, dẫn tới phải can thiệp phẫu thuật Sau tiêm nước tiểu bệnh nhân vào tế bào thận khỉ rhesus tế bào thận phôi thai người, xuất bệnh học tế bào papillomavirus Do đó, virus xác định virus mới, đặt tên BK theo tên viết tắt bệnh nhân phân lập lần [70] 1.2.2 Đặc điểm sinh học 1.2.2.1 Phân loại BKV thuộc họ Polyomaviridae, chi Polyomavirus BKV họ với JC virus (JCV) virus Simian 40 (SV40) BKV, JCV SV40 ba virus thuộc họ polyomavirus, có tính tương đồng cao trình tự DNA promassimotein Sự tương đồng trình tự gen BKV – JCV BKV - SV40 72% 69% Cả ba virus mã hóa cho loại protein Sự tương đồng axit amin vùng sớm 88% BKV - JCV, 81% BKV - SV40 79% JCV SV40 Ở khu vực mã hóa muộn (các protein cấu trúc), tương đồng 86% BKV- JCV, 85% BKV - SV40 82% JCV - SV40 [9] 1.2.2.2 Cấu trúc virion BKV khơng có vỏ bao ngồi có vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, đường kính dao động từ 40-44 nm Capsid gồm protein cấu trúc VP1, VP2 VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng gắn kết với protein histone Protein capsid xếp cấu trúc đa diện mặt có chứa 360 phân tử VP1, xếp thành 72 patamers Mỗi patamer liên kết với bên phân tử protein capsid VP2 VP3 Do đó, VP1 protein bộc lộ bên virion, chịu trách nhiệm gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ thúc đẩy trình xâm nhập [3] Trong nghiên cứu gần đây, quan sát BKV kính hiển vi điện tử, nhà khoa học thấy điểm tương tác protein VP2, VP3 với protein histone hệ gen Nhiều giả thuyết đặt ra, VP2 VP3 cầu nối VP1 cấu trúc chromatin [43] Kích thước gen BKV khoảng 5,3 kb, chứa gen mã hóa cho protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3), protein giúp cho trình nhân lên virus (LTA: Large T antigen, STA: Small T antigen, agnoprotein) vùng khơng mã hóa (NCCR: Non coding control region) NCCR vùng biến thể cao, có chứa vị trí liên kết khác với nhân tố điều hịa tế bào chủ, xem vùng điều hòa biến thể (HVRR: Hypervariable Regulatory Region) [23] Khung đọc mở nằm trung tâm gen, thúc đẩy việc chép diễn theo hai chiều Trong trình nhân lên, LTA tạo thành phức hợp đa phân liên kết với vị trí khởi đầu chép (Ori) hoạt động helicase để tạo điều kiện cho việc chép vùng mã hóa muộn [86] LTA yếu tố điều hòa quan trọng, thúc đẩy tế bào chủ đến pha S chu trình tế bào cách liên kết với protein ức chế khối u Rb, p107, p130 p53 [39] Bên cạnh đó, STA liên quan đến khả nhân lên virus, vận hành chu trình tế bào biến nạp Các protein capsid VP1, VP2, VP3 tạo tế bào chất, vận chuyển vào nhân thơng qua tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins Một protein capsid xâm nhập vào nhân, lan truyền virus diễn [57] Hình 1 Cấu trúc virion BKV [3] 1.2.2.3 Con đường lây nhiễm Con đường lây nhiễm BKV chưa xác định rõ ràng [51] Nhiều chứng cho thấy đường hô hấp tiêu hóa hai đường lây truyền Các đường lây nhiễm khác truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng (đặc biệt ghép thận đồng loại) từ mẹ sang báo cáo [3] Nhiễm trùng tiên phát thường xuất triệu chứng bệnh xuất triệu chứng viêm đường hô hấp nhẹ Điều cho thấy BKV thâm nhập đường máu thông qua nhiễm trùng amidan Sau thâm nhập vào tế bào máu ngoại vi, virus lan truyền sang mô khác nhau, điển hình thận [70] Trong lần nhiễm trùng tiên phát, BKV tồn dai dẳng tế bào ống thận tái hoạt động không triệu chứng xảy virus tiết nước tiểu Trong đó, người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả miễn dịch, tượng tái hoạt động BKV xuất BKV nước tiểu xảy BKV tìm thấy tế bào bạch cầu, não, hạch bạch huyết với chứng xuất BKV-DNA Sự phát tán BKV nước tiểu phổ biến bệnh nhân ghép thận so với người khỏe mạnh Tuy nhiên, chế tồn dai dẳng BKV điều kiện dẫn tới tái hoạt động BKV bệnh nhân suy giảm miễn dịch chưa nghiên cứu rõ ràng [51] 1.2.2.4 Chu trình nhân lên Quá trình nhân lên BKV bắt đầu kiện kháng nguyên VP1 gắn với acid sialic GD1b/GT1b màng tế bào chủ [27] Sau phức hợp gắn kết, BKV thâm nhập tế bào đường nhập bào (endocytosis) vận chuyển tới lưới nội chất nhờ microtubule [29] Thông qua VP2, VP3 đường importin, BKV tiếp cận nhân giải phóng DNA vào tế bào vật chủ Tuy nhiên, genome BKV xâm nhập vào nhân tế bào vật chủ không tích hợp vào hệ gen người Mặt khác, nhiều nghiên cứu chứng minh khả tích hợp genome BKV vào hệ gen động vật gặm nhấm dẫn đến hình thành phát triển khối u [3] Hơn nữa, hiểu biết chế tương tác BKV-DNA với hệ gen động vật gặm nhấm để hình thành khối u nhiều hạn chế Sau giải phóng DNA vào nhân, nhờ phức hệ enzyme tế bào chủ, trình phiên mã sớm diễn nhằm tạo protein hỗ trợ trình chép virus (STA, LTA) Tiếp theo, protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) hình thành từ tế bào chất vận chuyển vào nhân thơng qua tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins Một proteins capsid xâm nhập vào nhân, lan truyền virus diễn Hình Quá trình xâm nhiễm nhân lên BKV [3] 1.2.2.5 Đáp ứng miễn dịch • Đáp ứng miễn dịch tự nhiên Phần lớn nghiên cứu mối tương tác BKV với hệ thống miễn dịch tự nhiên tập trung vào thiết lập tái hoạt động BKV BKVN bệnh nhân ghép thận (KTRs: Kidney transplant recipients) Womer cộng có giảm số lượng tế bào tua (DC: Dendritic cells) máu ngoại vi bệnh nhân BKVN Các nghiên cứu sâu xác định bệnh nhân có số lượng DC thấp trước ghép có nguy bị BKVN cao [88] DC thực vai trị quan trọng việc kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt biệt hóa thành tế bào T đặc hiệu BKV [31] Các tế bào giết tự nhiên (NKs: Natural Killer Cells) có vai trị việc kiểm sốt lây nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận Các thụ thể giống với kháng thể tế bào NK (KIR) có vai trò đề kháng miễn dịch BKV Các nghiên cứu chiến lược giám sát miễn dịch BKV thơng qua việc ức chế trình nhận diện tế bào NK Các yếu tố trung gian khác hệ miễn dịch tự nhiên đóng góp vào việc kiểm sốt BKV, defensins thể hoạt tính chống nhiễm trùng với đa số virus, nấm vi khuẩn Nghiên cứu Dugna cộng Defensins người (HD5) ức chế bám BKV vào tế bào chủ cách kết tụ virus [28] HD5 thường tìm thấy đường niệu sinh dục, vị trí khu trú BKV HD5 bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, thực vai trò quan trọng việc điều tiết tái hoạt động không triệu chứng nhiễm virus đường tiết niệu sinh dục Yếu tố trung gian hệ miễn dịch tự nhiên có khả tác động lên việc làm mơ ghép bệnh nhân ghép thận nhiễm BKV Hơn nữa, người ta nhiễm BKV thúc đẩy xơ hóa mơ ghép bệnh nhân BKVN với chứng tăng biểu collagens nền, yếu tố tăng trưởng khối u beta (TGF-β), MMP2 -9, tín hiệu q trình chuyển đổi biểu mô (EMT) mẫu sinh thiết thận [3] • Đáp ứng miễn dịch thích ứng Đáp ứng dịch thể Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống BKV thường diễn không lâu sau tiếp xúc với kháng nguyên virus BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu BKV Nghiên cứu Egli cộng (2009) [30] nhóm người khỏe mạnh kháng thể IgG đặc hiệu BKV xuất 87% người trẻ tuổi (20-29) 71% nhóm người tuổi trung niên (50-59) Tương tự, Randhawa cộng (2002) [70], phát 80% người cho 10 thận có kháng thể IgG 22% có kháng thể IgA đặc hiệu BKV Các báo cáo chứng minh có mặt kháng thể đặc hiệu BKV không đủ để bảo vệ thể trước tái hoạt động mạnh mẽ BKV bệnh liên quan Mặt khác, đột biến kháng nguyên virus giúp virus trốn khỏi trung hịa qua trung gian kháng thể Đáp ứng miễn dịch tế bào Các nghiên cứu gần chứng minh vai trò quan trọng tế bào T việc kiểm sốt lây nhiễm BKV Các phân tích tế bào T-CD4 T-CD8 đặc hiệu với BKV máu ngoại vi tập hợp tế bào từ mẫu sinh thiết thận bệnh nhân BKVN cho thấy đáp ứng tế bào T diễn mạnh liên quan chặt chẽ tới tải lượng cao BKV T-CD4 kiểm sốt tái kích hoạt BKV kể hệ miễn dịch thiếu hụt tế bào T-CD8 Các thuốc ức chế miễn dịch ngăn cản thải ghép bệnh nhân ghép thận gây giảm biểu cytokine, IFN-γ TNF Một trở ngại nghiên cứu tế bào T đặc hiệu BKV tỉ lệ thấp tế bào tiền thân máu ngoại vi người cho người ghép thận Các nghiên cứu tái lập tế bào T đặc hiệu (T-CD4 T-CD8 ) với BKV liên quan tới khả kiểm soát tải lượng BKV máu nước tiểu tốt Do việc theo dõi tỷ lệ tế bào T đặc hiệu với BKV sau ghép đưa gia chiến lược giúp tiên lượng nguy tái hoạt động BKV BKVN [3] 1.3 Mối quan hệ BKV bệnh lý ghép thận 1.3.1 Mối tương quan nồng độ BKV-DNA bệnh lý ghép thận Trước thời kỳ sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép cyclosporine, hẹp niệu quản biến chứng thường gặp BKVN sau ghép thận Nhiều nghiên cứu phát việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép làm gia tăng nhiễm BKV người ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu BKV dương tính huyết nước tiểu chí sau đầu tiên, tỷ lệ cao từ đến tháng sau ghép thận Điều cho thấy giả thuyết nguồn gốc BKV xuất từ người cho thận không đơn tái hoạt động BKV bệnh nhân ghép thận BKV công 11 ... HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUY? ?N XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV- DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL- TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN... 33 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV- DNA kỹ thuật real- time PCR 34 2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV bệnh nhân ghép thận 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... BK virus máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real- time PCR Xác định tỷ lệ lưu hành kiểu gen BKV, kết hợp phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV bệnh nhân ghép thận Việt Nam Chương TỔNG