(Luận văn) xây dựng quy trình định lượng nồng độ bkv dna bằng kỹ thuật real time pcr và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus bk ở bệnh nhân ghép thận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN lu an n va p ie gh tn to XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN d oa nl w nf va an lu lm ul z at nh oi LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC z m co l gm @ Hà Nội - 2020 an Lu n va ac th si ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN lu XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ an n va PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN p ie gh tn to w oa nl Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 d an lu nf va LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC z at nh oi lm ul Cán hướng dẫn: TS Hoàng Xuân Sử TS Mai Thị Đàm Linh z m co l gm @ Hà Nội - 2020 an Lu n va ac th si LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn xin trân trọng gửi tới TS Hoàng Xuân Sử, người thầy truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học tận tình giúp đỡ, giảng giải hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đinh Thị Thu Hằng cán nhân lu an viên phịng thí nghiệm “Vi sinh Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên n va cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y tận tình giúp đỡ tơi q trình tn to thực đề tài gh Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy, cô môn Vi sinh vật p ie thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học w Quốc gia Hà Nội hết lịng giảng dạy kiến thức khoa học cho tơi trình oa nl học tập nghiên cứu trường d Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp lu nf va an đỡ tạo điều kiện cho trình thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, 18 tháng năm 2020 lm ul Học viên z at nh oi Lê Thị Bảo Quyên z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Axit amin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Bp Base pair BKV BK virus BKVN BK virus nephropathy CMV Cytomegalo virus Ct Cycle Threshold DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme - Linked - immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme) lu aa an n va ie gh tn to Ethidium Bromide p Etbr Epstein-Barr Virus HBV oa nl w EBV Hepatitis B virus d Herpes Simplex Herpes INF nf va an lu HSV F/R Forward/ Reverase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IVD In vitro diagnostic JCV JC virus Kb Kilobase pairs LB Luria-Bertani NPV Negative predictive value Intravenous Nutritional Fluid z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si lu an Polymerase Chain Reaction TNF Tumor Necrosis Factors PPV Positive predictive value RCF Relative centrifugal force RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic Rpm Revolutions per minute SOC Super Optimal broth Catabolite repression (Môi trường dinh dưỡng tối ưu) TBE Tris-boric-EDTA UV Ultra violet (Tử ngoại) n va PCR p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC BẢNG Bảng Các kit tách chiết, hóa chất sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu .31 Bảng Thành phần điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1 35 Bảng Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm 42 Bảng Thành phần phản ứng real-time PCR 51 Bảng Đánh giá độ đặc hiệu .52 Bảng 3 Khảo sát độ nhạy kỹ thuật real-time PCR mẫu bệnh phẩm .56 lu an Bảng Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl 58 va n Bảng Tỷ lệ nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận .61 gh tn to Bảng So sánh ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng .65 p ie Bảng Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng bệnh nhân ghép thận 66 Bảng Sự phân bố phân nhóm BKV 69 nl w d oa Bảng Vị trí SNP khác kiểu gen BKV-I BKV-IV 70 an lu Bảng 10 Xác định vị trí SNP BKV-I vùng gen VP1 (1630-1956) .71 nf va Bảng 11 Đa dạng SNP kiểu gen BKV-IV 72 lm ul Bảng 12 Trình tự axit amin vị trí SNP phân nhóm IV 73 z at nh oi Bảng 13 So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu .74 Bảng 14 Sự phân bố kiểu gen BKV theo số lâm sàng .77 z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Cấu trúc virion BKV Hình Quá trình xâm nhiễm nhân lên BKV .9 Hình Các tế bào decoy nước tiểu 17 Hình Vector pGEM T easy .29 Hình Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng .45 Hình Kết sàng lọc plasmid tái tổ hợp môi trường .46 Hình 3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme AvaII 47 lu an Hình Kết so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự Ngân hàng gen Quốc va n tế phần mềm Blast 48 gh tn to Hình Kiểm tra lại trình tự mồi probe cho real-time PCR .49 p ie Hình Tối ưu nồng độ probe .50 w Hình Tối ưu nồng độ mồi 50 oa nl Hình So sánh tương quan mẫu chuẩn WHO LDA .53 d Hình Xác định khoảng định lượng mẫu chuẩn 56 an lu nf va Hình 10 Ngưỡng phát BKV-DNA mẫu bệnh phẩm .57 lm ul Hình 11 So sánh tương quan hai kit 58 z at nh oi Hình 12 Phân tích khác biệt hai kit 59 Hình 13 Đường cong ROC BKV-DNA máu nhằm phát BKVN 63 z Hình 14 Đường cong ROC BKV-DNA nước tiểu nhằm phát BKVN63 @ m co l gm Hình 15 Cây phát sinh lồi vùng gen VP1-BKV (1630-1956) .68 an Lu n va ac th si MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học 1.2 Tổng quan BKV 1.2.1 Lịch sử phát BKV 1.2.2 Đặc điểm sinh học 1.3 Mối quan hệ BKV bệnh lý ghép thận 11 lu 1.3.1 Mối tương quan nồng độ BKV-DNA bệnh lý ghép thận 11 an 1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV bệnh lý ghép thận 13 va 1.4 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV 16 n 1.4.2 Sinh thiết thận 17 gh tn to 1.4.1 Tế bào học 16 p ie 1.4.3 Chẩn đoán sinh học phân tử 17 Tình hình nghiên cứu BKV 19 w 1.5 oa nl 1.5.1 Tình hình nghiên cứu phát triển kit 19 d 1.5.2 Tình hình nghiên cứu trạng nhiễm BKV 21 Phương pháp xây dựng chủng loại phát sinh 22 an lu 1.6 nf va 1.6.1 Định nghĩa 22 lm ul 1.6.2 Đặc điểm phương pháp xây dựng chủng loại 23 1.6.3 Ứng dụng chủng loại phát sinh xác định genotype BKV 25 z at nh oi Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên liệu 27 z 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 27 @ gm 2.1.2 Các vật liệu 27 l 2.1.3 Hóa chất 29 Phương pháp nghiên cứu 33 an Lu 2.3 m co 2.2 Thiết bị 31 n va ac th si 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR 34 2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV bệnh nhân ghép thận 43 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA real-time PCR 45 3.1.1 Tách dòng vùng gen VP1 45 3.1.2 Thiết lập mẫu chuẩn 48 3.1.3 Thiết kế mồi probe cho real-time PCR 49 lu 3.1.4 Tối ưu kỹ thuật real-time PCR 49 an 3.1.5 Đánh giá kỹ thuật real-time PCR 52 n va 3.1.6 Quy trình xác định tải lượng virus BK máu nước tiểu bệnh 3.2 Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận BKV 61 gh tn to nhân ghép thận 60 p ie 3.2.1 Xác định tỷ lệ lưu hành BKV bệnh nhân ghép thận kỹ thuật real-time PCR61 w 3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN 62 oa nl 3.2.3 Đánh giá vai trò BKV-DNA với yếu tố lâm sàng 66 d 3.3 Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV 67 an lu 3.3.1 Xác định kiểu gen BKV lưu hành Việt Nam 67 nf va 3.3.2 Phân tích vị trí SNP-BKV vùng gen VP1 bệnh nhân ghép thận70 lm ul 3.3.3 Đánh giá vai trò kiểu gen BKV với bệnh thận BKV 77 KẾT LUẬN 79 z at nh oi KIẾN NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỞ ĐẦU Ghép thận phương pháp điều trị thay hiệu cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong không điều trị khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận năm Cho đến nhiều sở y tế nước triển khai thành công kỹ thuật này, góp phần nâng cao chất lượng sống hiệu kinh tế cho bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Với đời loại thuốc ức chế miễn dịch hệ kèm theo lu an tái hoạt động mạnh BK virus (BKV) khẳng định nguyên nhân quan n va trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức thận ghép, chí mơ ghép bệnh ghép cho thấy xuất sớm BKV máu nước tiểu, chí gh tn to nhân sau ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi người nhận thận p ie đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao xảy khoảng từ 1-3 tháng sau ghép Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận BKV) ước tính khoảng 1- oa nl w 10% năm đầu sau ghép thận, 50% trường hợp BKVN bị thải ghép hoàn toàn [8] d an lu Hiện nay, vấn đề theo dõi giám sát nhiễm BKV bệnh nhân ghép thận nf va nước ta chưa nhận quan tâm mức sở y tế có khả lm ul thực ghép thận Chẩn đoán BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn biểu lâm sàng khơng đặc hiệu, nghèo triệu chứng, dễ bỏ sót chẩn đoán z at nh oi nhầm với giai đoạn thải ghép cấp Sinh thiết thận coi tiêu chuẩn vàng xác định BKVN, lại phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng z đào tạo chuyên sâu Trong đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng @ gm BKV-DNA kỹ thuật real-time PCR máu bệnh nhân ghép thận l công nhận cơng cụ có giá trị tiên đốn BKVN [8] Cho đến nay, chưa có m co nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử BKV công bố Việt Nam Một số an Lu sở y tế sử dụng kit thương mại Realstar BKV PCR Kit (Altona n va ac th si phụ mẫu nước tiểu bệnh nhân ghép thận người khỏe mạnh [59] Sự bất đồng kiểu gen BKV máu nước tiểu nghiên cứu Ledesma J cộng (2013) [56] phân tích vùng gen VP1 bệnh nhân ghép thận với phối kết hợp ngẫu nhiên kiểu gen (I/III, II/III, IV/II, II/I), chí khác biệt phân nhóm kiểu gen (I/b-1, I/b-2) Nhiều giả thuyết cho khác biệt kiểu gen BKV máu nước tiểu bệnh nhân ghép thận công bố, nguyên nhân đến từ người cho có nguy cao dẫn tới tình trạng Nghiên cứu Schwarz A cộng lây truyền virus có nguồn gốc từ người cho yếu tố nguy chủ yếu lu phát triển BKV sau ghép tái kích hoạt virus tiềm ẩn từ người nhận Tình an trạng huyết học người cho khẳng định dương tính với BKV n va người nhận phát bị nhiễm BKV sau ghép, nhân lên virus tn to nước tiểu có liên quan đến tình trạng nhiễm virus máu người nhận sau gh ghép BKV tương ứng người cho người nhận thay đổi p ie trình lây nhiễm người nhận mô tả trước [74] w Hầu hết virus phân nhóm I/b-1 khơng khác so với chủng tham oa nl chiếu Dunlop biến thể virus tìm thấy số virus có d phân nhóm I/b-1 đặc trưng thay D75N Trong số bệnh nhân thuộc lu an phân nhóm I/b-1, thay D75N xuất máu (3/5 bệnh nhân), nf va máu nước tiểu (1/5 bệnh nhân), không xuất (1/5 bệnh nhân) Sự thay lm ul D75N chiếm ưu máu giải thích khác biệt áp lực z at nh oi chọn lọc máu so với tế bào biểu mô thận bệnh nhân dẫn đến đa dạng di truyền Trong số bệnh nhân có BKV-I xuất thay nucleotide 1786 (D75N, Bảng 3.10), 4/5 trường hợp mắc BKVN Hiện tượng thay D75N thường z xuất nhiều bệnh nhân BKVN nghiên cứu @ gm Tremolada S cộng (2010) [84] Khác với kiểu gen I, phân nhóm IV thể co l đa dạng SNP so sánh với chủng tham chiếu Dunlop đặc m trưng 10 thay (E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, N74T, D75A, S77D, an Lu E82D, Q117K) tất trường hợp Sự thay xuất đồng n va 76 ac th si máu nước tiểu trường hợp có kiểu gen BKV-IV Cũng giống D75N, thay vị trí K69R ghi nhận trường hợp mắc BKVN, nhiên biến thể K69R có tốc độ chép nhanh so với D75N [84] Phân tích theo cặp phát vị trí thay D60H xuất máu không xuất nước tiểu bệnh nhân số 3.3.3 Đánh giá vai trò kiểu gen BKV với bệnh thận BKV Từ kết chủng loại phát sinh cho thấy kiểu gen BKV lưu hành Việt Nam gồm BKV-I BKV-IV Kết phân tích phân bố khác biệt kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, số xét nghiệm tình trạng lu BKVN trình bày bảng 3.14 an n va Bảng 14 Sự phân bố kiểu gen BKV theo số lâm sàng gh tn to cận lâm sàng ie Kiểu gen BKV-IV (n=25) (n=15) 41,12 ± 10,94 38,94 ± 8,49 Nữ (14,63%) (9,76%) Nam 19 (46,34%) 12 (29,27%) 126,16 ± 33,86 134,06 ± 39,62 0,50 4,39 ± 1,65 4,57 ± 1,63 0,76 8,25 ± 2,87 0,26 3/15 (20%) p Thông số BKV-I d nf va an lu Giới tính oa nl w Độ tuổi Creatinin T1 (µmol/ml) Nồng độ BKV-DNA nước tiểu (log IU/ml) z at nh oi (log IU/ml) lm ul Nồng độ BKV-DNA máu 7,21 ± 2,66 p 0,50 z @ 5/25 (20%) gm BKVN l Từ bảng 3.14 cho thấy khơng có khác biệt kiểu gen BKV liên m co quan đến tuổi, giới, số xét nghiệm tình trạng BKVN (p>0,05) an Lu n va 77 ac th si Bệnh thận BKV vấn đề thách thức lâm sàng bệnh nhân sau ghép thận mà lựa chọn điều trị hạn chế, phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm bác sĩ Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trị quan trọng trì chức thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy mô ghép hay suy chức thận ghép Trong nghiên cứu này, phân tích kiểu gen BKV bệnh nhân BKVN khẳng định sinh thiết thận, 5/8 (62,5%) thuộc nhóm I/b-1; 3/8 (37,5%) thuộc nhóm IV/c-1, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Nghiên cứu của Boukoum H cộng (2016) 34 mẫu bệnh phẩm (máu nước tiểu) bệnh nhân ghép thận Tunisia cho lu thấy BKV-I có tỷ lệ lưu hành cao (79,5%), phân nhóm I/b-2 chiếm ưu an (76,5%) Boukoum H cộng đưa nhận định khơng có liên quan n va kiểu gen tình trạng BKVN (p>0,05), hai bệnh nhân bị BKVN tn to thuộc phân nhóm I/b-2 [16] Trong đó, nghiên cứu Pastrana cộng gh (2013) [67] BKV -IV chiếm tỷ lệ cao bệnh nhân bị BKVN sau p ie ghép thận so với bệnh nhân sau ghép có BKV dương tính máu nước w tiểu Một số nghiên cứu khác mối liên hệ kiểu gen BKV-II, III, IV oa nl với nguy bị BKVN cao bệnh nhân ghép thận [61], [83] Nghiên cứu gần d Johannes Korth cộng (2018) [52], cho thấy BKV-I chiếm tỷ lệ cao an lu với 82%, BKV-IV (14%) cuối BKV-II (4%) Điểm đáng nf va ý bệnh nhân BKVN BKV-II IV phát với tỷ lệ cao so với lm ul bệnh nhân bị BKVN BKV-I ((8/10 (80%) so với 17/46 (37%); p = 0,001) Trong nghiên cứu BKV-I xuất nhóm bệnh nhân BKVN cao z at nh oi (5/8 bệnh nhân) BKV-I chép hiệu BKV-IV tế bào biểu mô thận BKV-I chiếm ưu dân số Việt Nam [65] z m co l gm @ an Lu n va 78 ac th si KẾT LUẬN Xây dựng thành cơng quy trình định lượng BKV-DNA phương pháp realtime PCR ứng dụng kiểm nghiệm xét nghiệm acid nucleic BKV Việt Nam + Hiệu chỉnh thành công mẫu chuẩn nghiên cứu với mẫu chuẩn WHO: IU = 9,6 copy + Ngưỡng phát 135 IU/ml, độ đặc hiệu (100%) độ ổn định cao + Ngưỡng dự đoán phát triển BKVN bệnh nhân ghép thận: máu với lu giá trị 4,12 log10 (IU/ml), độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 95,56% Trong nước tiểu xác an định giá trị ngưỡng BKV-DNA 6,95 log10 (IU/ml), độ nhạy 87,5%, độ đặc hiệu va 84,21% n tn to Phân tích số đặc điểm di truyền phân tử BKV vùng gen VP1 (1630- + Tỷ lệ lưu hành BKV 64,12% p ie gh 1956) bệnh nhân ghép thận Việt Nam nl w + Phân tích kiểu gen BKV 40 mẫu dương tính: BKV-I chiếm 62,5%, d oa BKV-IV (37,5%), không phát BKV-II BKV-III quần thể bệnh an lu nhân ghép thận người Việt Nam Tỷ lệ lưu hành phân nhóm BKV-I BKV-IV lm ul (66,66%) nf va sau: BKV-I/b-1 (100%), BKV-IV/a-1 (26,67%), BKV-IV/a-2 (6,67%), BKV-IV/c-1 z at nh oi + Phân tích đa hình đoạn gen VP1 cho thấy chủng BKV-I có tương đồng cao phân nhóm, chủng thuộc phân nhóm IV cho thấy đa dạng trình tự z m co l gm @ an Lu n va 79 ac th si KIẾN NGHỊ Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV người cho thận để xác định nguồn gốc BKV sau ghép thận Phân tích trình tự tồn gen BKV xác định đặc điểm di truyền phân tử BKV bệnh nhân ghép thận nhiễm BKV lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va 80 ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Hà Phan Hải An (2015), "Ca lâm sàng nhiễm virus BK bệnh nhân sau ghép thận", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 93(1), tr 142-148 Trịnh Hùng (2016), http://benhvien198.vn/thong-bao-hai-truong-hop-nhiemvirus-bk-tren-benh-nhan-sau-ghep-than-tai-benh-vien-19-8  Tài liệu Tiếng Anh Ambalathingal G R et al (2017), "BK polyomavirus: clinical aspects, lu immune regulation, and emerging therapies", Clinical microbiology reviews, an 30(2), pp 503-528 pneumonia associated with immunosuppression", Human pathology, 36(9), to Anjela Galan C A R., Christopher N Otis (2005), "Fatal BK polyoma viral tn n va p ie gh Azevedo L S et al (2015), "Cytomegalovirus infection in transplant w pp 1031-1034 B Loeches M V., M Perez, et al (2009), "BK virus in liver transplant d oa nl recipients", Clinics, 70(7), pp 515-523 lu nf va an recipients: a prospective study", Transplant Proc, 41(3), pp 1033-7 Baksh F K et al (2001), "Molecular genotyping of BK and JC viruses in lm ul human polyomavirus [ndash] associated interstitial nephritis after renal z at nh oi transplantation", American journal of kidney diseases, 38(2), pp 354-365 Balba G P et al (2013), "BK polyomavirus infection in the renal transplant recipient", Infectious Disease Clinics, 27(2), pp 271-283 z @ Barbanti-Brodano G et al (2006), "BK virus, JC virus and Simian Virus 40 gm m Barker P (2006), Standarization of Diagnostic Markers, IOS Press an Lu 10 co and Human Diseases, Springer, pp 319-341 l infection in humans, and association with human tumors", Polyomaviruses n va 81 ac th si 11 Bateman A C et al (2017), "Quantification of BK virus standards by quantitative real-time PCR and droplet digital PCR is confounded by multiple virus populations in the WHO BKV international standard", Clinical chemistry, 63(3), pp 761-769 12 Baylis S et al (2008), "An international collaborative study to establish the 2nd World Health Organization International Standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification technology‐based assays", Vox sanguinis, 94(4), pp 358-362 Bicalho C S et al (2018), "Determination of viremia cut‐off for risk to 13 lu develop BKP an yV‐associated nephropathy among kidney transplant n va recipients", Transplant Infectious Disease, 20(5), p e12969 Blazquez-Navarro A et al (2018), "BKV, CMV, and EBV interactions and tn to 14 their effect on graft function one year post-renal transplantation: results from p ie gh a large multi-Centre study", EBioMedicine, 34, pp 113-121 Boukoum H et al (2011), "Distribution of BK polyomavirus genotypes in w 15 725-730 lu Boukoum H et al (2016), "BK polyomavirus genotypes and nephropathy: is nf va an 16 d oa nl Tunisian renal transplant recipients", Journal of medical virology, 83(4), pp there a relationship?", Transplant Infectious Disease, 18(2), pp 309-311 lm ul 17 Boukoum H et al (2015), "BK and JC polyomavirus infections in Tunisian 1795 Browne L and Karubian J (2018), "Rare genotype advantage promotes z 18 z at nh oi renal transplant recipients", Journal of medical virology, 87(10), pp 1788- @ gm survival and genetic diversity of a tropical palm", New Phytologist, 218(4), co 19 l pp 1658-1667 Burd E M (2010), "Validation of laboratory-developed molecular assays for m an Lu infectious diseases", Clinical microbiology reviews, 23(3), pp 550-576 n va 82 ac th si 20 C Almeras F V., V Garrigue, et al (2011), "Monthly screening for BK viremia is an effective strategy to prevent BK virus nephropathy in renal transplant recipients", Transpl Infect Dis, 13(2), pp 101-8 21 C J Bechert V J S., D A Payne, et al (2010), "Monitoring of BK viral load in renal allograft recipients by real-time PCR assays", Am J Clin Pathol, 133(2), pp 242-50 22 Chen Q et al (2006), "Subtype IV of the BK polyomavirus is prevalent in East Asia", Archives of virology, 151(12), pp 2419-2429 23 Cubitt C L (2006), "Molecular genetics of the BK virus", Polyomaviruses lu an and Human Diseases, Springer, pp 85-95 va 24 D Dadhania C S., R Ding, et al (2010), "Validation of noninvasive n tn to diagnosis of BK virus nephropathy and identification of prognostic 25 D L Bohl D C B (2007), "BK virus nephropathy and kidney p ie gh biomarkers", Transplantation, 90(2), pp 189-97 Daniel L Bohl G A S., Caroline Ryschkewitsch, et al (2005), "Donor origin d oa 26 nl w transplantation", Clin J Am Soc Nephrol, Suppl 1, pp S36-46 an lu of BK virus in renal transplantation and role of HLA C7 in susceptibility to sustained BK viremia", American Journal of Transplantation, 5(9), pp lm ul 27 nf va 2213-2221 Dugan A et al (2006), "Update on BK virus entry and intracellular z at nh oi trafficking", Transplant infectious disease, 8(2), pp 62-67 28 Dugan A S et al (2008), "Human α-defensins inhibit BK virus infection by z aggregating virions and blocking binding to host cells", Journal of Biological l gm 29 @ Chemistry, 283(45), pp 31125-31132 Eash S et al (2004), "Infection of vero cells by BK virus is dependent on co m caveolae", Journal of virology, 78(21), pp 11583-11590 an Lu n va 83 ac th si 30 Egli A et al (2009), "Prevalence of polyomavirus BK and JC infection and replication in 400 healthy blood donors", The Journal of infectious diseases, 199(6), pp 837-846 31 Gedvilaite A et al (2006), "Virus-like particles derived from major capsid protein VP1 of different polyomaviruses differ in their ability to induce maturation in human dendritic cells", Virology, 354(2), pp 252-260 32 Göran Bratt A L H., Monica Grandien, et al (1999), "BK virus as the cause of meningoencephalitis, retinitis and nephritis in a patient with AIDS", Aids, 13(9), pp 1071-1075 lu an 33 H B Viscount A J E., M J Espy, et al (2007), "Polyomavirus polymerase n va chain reaction as a surrogate marker of polyomavirus-associated tn to nephropathy", Transplantation, 84(3), pp 340-5 H H Hirsch C B D., J Steiger, et al (2006), "Polyomavirus-associated nephropathy in renal transplantation: critical issues of screening and p ie gh 34 H H Hirsch P R (2009), "BK virus in solid organ transplant recipients", oa 35 nl w management", Adv Exp Med Biol, 577, pp 160-73 d Am J Transplant, Suppl 4, pp S136-46 an lu 36 H H Hirsch W K., M Dickenmann, et al (2002), "Prospective study of nf va polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal-transplant lm ul recipients", N Engl J Med, 347(7), pp 488-96 z at nh oi 37 H K Singh K A A., V Madden, et al (2009), "Presence of urinary Haufen accurately predicts polyomavirus nephropathy", J Am Soc Nephrol, 20(2), @ Hariharan S (2006), "BK virus nephritis after renal transplantation", Kidney gm 38 z pp 416-27 m co l international, 69(4), pp 655-662 an Lu n va 84 ac th si 39 Harris K F et al (1998), "Novel mechanisms of E2F induction by BK virus large-T antigen: requirement of both the pRb-binding and the J domains", Molecular and cellular biology, 18(3), pp 1746-1756 40 Hasan M R et al (2016), "Comparative evaluation of laboratory developed real-time PCR assays and RealStar® BKV PCR Kit for quantitative detection of BK polyomavirus", Journal of virological methods, 234, pp 8086 41 Hirsch H H et al (2002), "Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal-transplant recipients", New England lu Journal of Medicine, 347(7), pp 488-496 an Hirsch H H and Snydman D R (2005), "BK virus: opportunity makes a n va 42 tn to pathogen", Clinical Infectious Diseases, 41(3), pp 354-360 Hurdiss D L et al (2016), "New structural insights into the genome and minor capsid proteins of BK polyomavirus using cryo-electron microscopy", p ie gh 43 Ikegaya H et al (2006), "Identification of a genomic subgroup of BK oa 44 nl w Structure, 24(4), pp 528-536 d polyomavirus spread in European populations", Journal of general virology, lu 45 nf va an 87(11), pp 3201-3208 Iwaki K K et al (2010), "Development of a real-time quantitative PCR lm ul assay for detection of a stable genomic region of BK virus", Virology 46 z at nh oi journal, 7(1), p 295 Jin L and Gibson P (1996), "Genomic function and variation of human z polyomavirus BK (BKV)", Reviews in medical virology, 6(4), pp 201-214 @ Jin L et al (1993), "Genomic typing of BK virus in clinical specimens by gm 47 co l direct sequencing of polymerase chain reaction products", Journal of medical virology, 41(1), pp 11-17 m an Lu n va 85 ac th si 48 Jin L et al (1995), "Prevalence and distribution of BK virus subtypes in healthy people and immunocompromised patients detected by PCRrestriction enzyme analysis", Clinical and diagnostic virology, 3(3), pp 285295 49 K F Remund M B., J J Egan (2009), "Infections relevant to lung transplantation", Proc Am Thorac Soc, 6(1), pp 94-100 50 Kessler H et al (2012), "Ninth International Symposium on Molecular Diagnostics", Clin Chem Lab Med, 50(4), pp A71-A88 51 Knowles W A (2006), "Discovery and epidemiology of the human lu an polyomaviruses BK virus (BKV) and JC virus (JCV)", Polyomaviruses and n va human diseases, Springer, pp 19-45 tn to Korth J et al (2018), "Impact of low‐level BK polyomavirus viremia on 52 20(1), p e12817 p ie gh intermediate‐term renal allograft function", Transplant Infectious Disease, Krautkrämer E et al (2009), "Mutations in the BC‐loop of the BKV VP1 nl w 53 oa region not influence viral load in renal transplant patients", Journal of d medical virology, 81(1), pp 75-81 an lu 54 Krumbholz A et al (2006), "Prevalence of BK virus subtype I in Germany", nf va Journal of medical virology, 78(12), pp 1588-1598 lm ul 55 Kudose S and Dong J (2014), "Clinical validation study of quantitative real- z at nh oi time PCR assay for detection and monitoring of BK virus nephropathy", Annals of Clinical & Laboratory Science, 44(4), pp 455-460 Ledesma J et al (2013), "BK polyomavirus genotyping at inter‐and intra‐ z 56 @ 57 l gm patient level in Spain", Journal of medical virology, 85(8), pp 1402-1408 Li T.-C et al (2003), "Characterization of self-assembled virus-like particles co m of human polyomavirus BK generated by recombinant baculoviruses", an Lu Virology, 311(1), pp 115-124 n va 86 ac th si 58 Luo C et al (2009), "Genotyping schemes for polyomavirus BK, using gene-specific phylogenetic trees and single nucleotide polymorphism analysis", Journal of virology, 83(5), pp 2285-2297 Luo C et al (2012), "VP‐1 quasispecies in human infection with 59 polyomavirus BK", Journal of medical virology, 84(1), pp 152-161 60 M D Reploeg G A S., D B Clifford (2001), "Bk virus: a clinical review", Clin Infect Dis, 33(2), pp 191-202 61 Matsuda Y et al (2011), "A rapid and efficient method BK polyomavirus genotyping by high‐resolution melting analysis", Journal of medical lu an virology, 83(12), pp 2128-2134 va 62 Morel V et al (2017), "A simple and reliable strategy for BK virus n tn to subtyping and subgrouping", Journal of clinical microbiology, 55(4), pp 63 N Basara F.-M R., T Schwalenberg, et al (2010), "Hydronephrosis resulting p ie gh 1177-1185 nl w from bilateral ureteral stenosis: a late complication of polyoma BK virus Nishimoto Y et al (2007), "An Asian origin for subtype IV BK virus based an lu 64 d oa cystitis?", Journal of transplantation, p 2010 on phylogenetic analysis", Journal of molecular evolution, 65(1), pp 103- nf va 111 lm ul 65 Nukuzuma S et al (2006), "Subtype I BK polyomavirus strains grow more z at nh oi efficiently in human renal epithelial cells than subtype IV strains", Journal of general virology, 87(7), pp 1893-1901 O Johnston D J., J S Gill, et al (2010), "Treatment of polyomavirus z 66 kidney transplant recipients: gm in @ infection systematic review", m co l Transplantation, 89(9), pp 1057-70 a an Lu n va 87 ac th si 67 Pastrana D V et al (2013), "BK polyomavirus genotypes represent distinct serotypes with distinct entry tropism", Journal of virology, 87(18), pp 10105-10113 68 R Sharma S T., S Patel, et al (2016), "BK Virus in Kidney Transplant: Current Concepts, Recent Advances, and Future Directions", Exp Clin Transplant, 14(4), pp 377-84 69 R Thakur S A., R Nada, et al (2011), "Prospective monitoring of BK virus reactivation in renal transplant recipients in North India", Transpl Infect Dis, 13(6), pp 575-83 lu an 70 Randhawa P et al (2002), "BK virus: discovery, epidemiology, and n va biology", Graft, 5(suppl 1), p S19 S Gonzalez D P E.-S., O Suarez, et al (2015), "BK Virus Nephropathy in tn to 71 Diagnosis, and Treatment", Transplant Proc, 47(6), pp 1777-85 p ie gh Kidney Transplantation: An Approach Proposal and Update on Risk Factors, S J Chadban K A B., S B Campbell, et al (2012), "KHA-CARI nl w 72 oa guideline: KHA-CARI adaptation of the KDIGO Clinical Practice Guideline d for the Care of Kidney Transplant Recipients", Nephrology (Carlton), 17(3), nf va an 73 lu pp 204-14 Schmitt C et al (2014), "Donor origin of BKV replication after kidney lm ul transplantation", Journal of Clinical Virology, 59(2), pp 120-125 z at nh oi 74 Schwarz A et al (2016), "Viral origin, clinical course, and renal outcomes in patients with BK virus infection after living-donor renal transplantation", @ Shah K V (2000), "Human polyomavirus BKV and renal disease", gm 75 z Transplantation, 100(4), pp 844-853 m co l Nephrology Dialysis Transplantation, 15(6), pp 754-755 an Lu n va 88 ac th si 76 Shenagari M et al (2017), "BK virus replication in renal transplant recipients: Analysis of potential risk factors may contribute in reactivation", Journal of Clinical Virology, 96, pp 7-11 77 Si-Mohamed A et al (2006), "Detection and quantitation of BK virus DNA by real-time polymerase chain reaction in the LT-ag gene in adult renal transplant recipients", Journal of virological methods, 131(1), pp 21-27 78 Skulratanasak P et al (2018), BK virus infection in Thai kidney transplant recipients: a single-center experience, Transplantation proceedings, Elsevier, pp 1077-1079 lu an 79 Stolt A et al (2003), "Seroepidemiology of the human polyomaviruses", n va Journal of General Virology, 84(6), pp 1499-1504 Takasaka T et al (2004), "Subtypes of BK virus prevalent in Japan and tn to 80 Virology, 85(10), pp 2821-2827 p ie gh variation in their transcriptional control region", Journal of General Tan S K et al (2017), "Calibration of BK virus nucleic acid amplification nl w 81 oa testing to the 1st WHO international standard for BK virus", Journal of d clinical microbiology, 55(3), pp 923-930 an lu 82 Toan P Q et al (2019), Identification of BK Virus Genotypes in Recipients nf va of Renal Transplant in Vietnam, Transplantation proceedings, Elsevier, pp z at nh oi 83 lm ul 2683-2688 Tremolada S et al (2010), "Rare subtypes of BK virus are viable and frequently detected in renal transplant recipients with BK virus-associated z nephropathy", Virology, 404(2), pp 312-318 @ Tremolada S et al (2010), "Mutations in the external loops of BK virus VP1 gm 84 co l and urine viral load in renal transplant recipients", Journal of cellular physiology, 222(1), pp 195-199 m an Lu n va 89 ac th si 85 V R Dharnidharka H A A., C E Araya (2011), "The BK virus in renal transplant recipients-review of pathogenesis, diagnosis, and treatment", Pediatr Nephrol, 26(10), pp 1763-74 86 Wang W and Simmons D T (2009), "Simian virus 40 large T antigen can specifically unwind the central palindrome at the origin of DNA replication", Journal of virology, 83(7), pp 3312-3322 87 Wang Z Y et al (2015), "Phylogenetic reconstruction and polymorphism analysis of BK virus VP2 gene isolated from renal transplant recipients in China", Experimental and therapeutic medicine, 10(5), pp 1759-1767 lu an 88 Womer K L et al (2010), "Dendritic cell deficiency associated with n va development of BK viremia and nephropathy in renal transplant recipients", tn to Transplantation, 89(1), pp 115-123 Y Akazawa Y T., T Yamane, et al (2012), "Fatal BK virus pneumonia following stem cell transplantation", Transplant Infectious Disease, 14(6), p ie gh 89 Yang Z and Rannala B (2012), "Molecular phylogenetics: principles and oa 90 nl w pp E142-E146 d practice", Nature reviews genetics, 13(5), p 303 an lu 91 Yoon S.-H et al (2015), Clinical impact of BK virus surveillance on nf va outcomes in kidney transplant recipients, Transplantation proceedings, z at nh oi 92 lm ul Elsevier, pp 660-665 Zheng H.-Y et al (2007), "Relationships between BK virus lineages and human populations", Microbes and infection, 9(2), pp 204-213 z m co l gm @ an Lu n va 90 ac th si