(Luận văn) xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật pcr và realtime pcr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - PHẠM QUỲNH TRANG lu an va n XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU VÀ REALTIME PCR p ie gh tn to BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR d oa nl w lu ll u nf va an LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2017 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU lu an BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR va n VÀ REALTIME PCR gh tn to Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học p ie oa nl w Mã số: 60.42.02.01 d LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG ll u nf va an lu oi m Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Long z at nh Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108 z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên - 2017 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cửa tơi hưỡng dẫn TS Nguyễn Văn long Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả lu an va n Phạm Quỳnh Trang p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Long trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Bs Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua lu an Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, n va Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện thuận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, gh tn to lợi cho học tập nghiên cứu p ie giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn w tháng 11 năm 2017 oa nl Thái Nguyên, d Học viên u nf va an lu ll Phạm Quỳnh Trang oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I lu TỔNG QUAN an Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc .3 va n 1.1 Giác mạc 1.1.2 Màng đáy màng Bowmann ie gh tn to 1.1.1 Biểu mô p 1.1.3 Nhu mô 1.1.4 Màng Descemet w oa nl 1.1.5 Nội mô .5 d 1.2 Yếu tố nguy gây viêm loét giác mạc lu an 1.3 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp viêm loét giác mạc u nf va 1.3.1 Triệu chứng 1.3.2 Triệu chứng thực thể ll oi m Microsporidia z at nh 2.1 Giới thiệu chung 2.2 Bệnh học nguy 11 z 2.3 Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia .12 @ gm 2.4 Chẩn đoán viêm loét giác mạc 12 l 2.5 Các phương pháp phát Microsporidia 13 m co 2.5.1 Chẩn đoán phân biệt 13 an Lu 2.5.2 Chẩn đoán xác định 14 n va ac th si iv Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 19 3.1 Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 19 3.2 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 20 Chương II .22 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 22 Đối tượng nghiên cứu 22 Hóa chất, thiết bị 22 lu an 2.1 Hóa chất 22 va 2.2 Thiết bị, máy móc 23 n 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 to 2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ đo độ tinh máy quang phổ 25 p ie gh tn 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số .24 nl w 2.3.3 Phương pháp điện di gel agarose 25 oa 2.3.4 Phương pháp xác định trình tự axit nucleic 26 d 2.3.5 Xây dựng quy trình phát Microsporidia phương pháp PCR Realtime PCR 28 va an lu u nf 2.3.5.1 Xác định độ nhạy phương pháp PCR Realtime PCR 30 ll CHƯƠNG III 36 m oi KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 z at nh 3.1 Kết xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR Realtime PCR 36 z 3.2 Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR 39 @ gm 3.2.1 Đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR Realtime PCR 39 m co l 3.2.2 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR .41 3.3 Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia 43 an Lu 3.4 Thử nghiệm kỹ thuật PCR Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt 46 n va ac th si v KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biểu đồ thể tác nhân gây tai nạn mắt lao động sản xuất (theo thống kê hàng năm BV Mắt TP HCM)(%) Hình Thiết đồ cắt dọc giác mạc Hình 1.3 Hình ảnh minh họa Microsporidia 10 Hình 1.4 Ngun lí phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dị Taqman 18 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia 36 lu Hình 3.2 Minh họa kết giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia an n va từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc bệnh nhân KHUYEN 37 to Hình 3.3 Kết so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu gh tn Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen giới 38 p ie Hình 3.4 Kết khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia phản ứng Realtime PCR 39 oa nl w Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR phát Vittaforma corneae 40 d an lu Hình 3.6 Kết Realtime PCR đánh giá độ nhạy kỹ thuật Realtime phát u nf va Vittaforma corneae 41 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật PCR ll oi m phát Microsporidia 42 z at nh Hình 3.8 Kết Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR phát Microsporidia 42 z Hình 3.9a Kết điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết phản ứng @ gm ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida cặp mồi vector M13 43 m co l Hình 3.9b Kết điện di sản phẩm plasmid PCR cặp mồi vector M13 plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia 44 an Lu Hình 3.10 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ 45 n va ac th si vii Hình 3.11 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ 45 Hình 3.12 A,B Kết điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 47 Hình 3.13 A Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 47 Hình 3.13 B Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 48 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA Microsporidia sử dụng cặp mồi MF1&MF2 28 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F Betaglobin R 29 Bảng 2.3 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA Microsporidia sử dụng lu an cặp mồi MSRT1&MSRT2 probe MSRT 30 n va Bảng 2.4 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy phương tn to pháp 30 gh Bảng 2.5 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy p ie phương pháp 31 w Bảng 2.6 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu oa nl phương pháp 32 d Bảng 2.7 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc lu va an hiệu phương pháp 32 u nf Bảng 2.8 Thành phần điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 33 ll chuẩn dương 33 m oi Bảng 2.9 Thành phần điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 34 z at nh chuẩn dương 34 Bảng 3.1 Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đốn dương z gm @ tính với Vittaforma corneae 40 l Bảng 3.2 Bảng tổng hợp số liệu kết phát Microsporidia 30 mẫu m co bệnh phẩm lâm sàng phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR 49 an Lu Bảng 3.3 Kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng 50 n va ac th si 42 aeruginosa, Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính với virus HSV CMV lu an Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật va n PCR phát Microsporidia to gh tn Đường chạy số 1–6, tương ứng chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, mẫu bệnh phẩm ie p chẩn đốn dương tính với virus HSV CMV (+),đối chứng dương Vittaforma d oa nl w corneae (-), đối chứng âm M, thang ADN chuẩn ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Hình 3.8 Kết Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime an Lu PCR phát Microsporidia n va ac th si 43 Kết hình 3.7 3.8 cho thấy quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi MF1&MF2 kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi MSRT1 MSRT2 với probe MSRT phát đặc hiệu trình tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA Microsporidia mà không bắt cặp không đặc hiệu với mầm bệnh vi sinh vật khác 3.3 Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia Theo trình bày phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu, thực cloning đoạn trình tự khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia vào vector pTZ57R/T để tạo vector tái tổ hợp pTZ57RR/T- lu Microsporidia phản ứng ligation xúc tác enzyme T4 ligage an Sản phẩm phản ứng ligation sau biến nạp vào tế bào khả biến n va E Coli DH5α Các khuẩn lạc chọn lọc đĩa thạch có trải kháng sinh tn to ampicillin IPTG/XGal Các khuẩn lạc cho kết dương tính khuẩn gh lạc mọc đĩa có màu trắng, khuẩn lạc không xảy phản ứng ligation p ie cho màu xanh xảy phản ứng cảm ứng với IPTG/XGal d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Hình 3.9A Kết điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết phản ứng z gm @ ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida cặp mồi vector M13 l Đường chạy số 1: plasmid pTZ57R/T làm đối chứng âm Đường chạy số đến m co 10 đến 12 khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid pTZ57R/T- chuẩn ADN an Lu Microsporidia Đường chạy số 8,9 khuẩn lạc nghi ngờ âm tính M: thang n va ac th si 44 Cặp mồi vector M13 có vị trí gắn đặc hiệu vector pTZ57R/T cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thước 152bp 406bp tương ứng với dòng mang không mang plasmid tái tổ hợp pTZ57R/T-Microsporidia Chúng tiến hành chọn khuẩn lạc nghi ngờ dương tính có chứa plasmid pTZ57R/T-Microsporidia để tiến hành tách plasmid chạy kiểm chứng lại phản ứng Colning DNA lu an n va p ie gh tn to oa nl w d Hình 3.9B Kết điện di sản phẩm plasmid PCR cặp mồi vector M13 lu va an plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia u nf Đường chạy số 1: plasmid tách từ khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid pTZ57R/T- ll Microsporidia M: thang chuẩn ADN m oi Kết từ hình 3.9b cho thấy, khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid z at nh plasmid pTZ57R/T-Microsporidia sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13 nhân lên đoạn gen có kích thước 400bp (bao gồm đoạn gen vector z gm @ + đoạn chèn ADN Microsporidia) Từ khẳng định, chúng tơi cloning m co vector pTZ57R/T l đoạn gen khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia vào an Lu Để sử dụng plasmid chuẩn dương tạo làm chuẩn dương sử dụng nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành đo OD, tính số copies tương ứng n va ac th si 45 plasmid sau tiến hành pha lỗng xuống nồng độ thấp Sau đó, chúng tơi tiến hành chạy PCR Realtime PCR để chọn nồng độ plasmid lấy làm chuẩn dương thích hợp lu an n va ie gh tn to p Hình 3.10 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương nl w Microsporidia pha lỗng nồng độ Đường tín hiệu từ đến 7: plasmid chuẩn d oa dương pha loãng nồng độ 108, 107, 106,105,104,103,102 ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ l Hình 3.11 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương m co Microsporidia pha loãng nồng độ an Lu Đường chạy từ đến 7: plasmid chuẩn dương pha loãng nồng độ 108, 107, 106,105,104,103,102 Đường chạy số 8: chuẩn âm M: thang nồng độ ADN n va ac th si 46 Từ kết Hình 3.10 3.11, chúng tơi lựa chọn nồng độ 103 làm nồng độ plasmid chứng dương sử dụng nghiên cứu sau Ở nồng độ này, đảm bảo q trình PCR Realtime PCR khơng xảy tượng dương tính giả nhiễm chéo, đảm bảo tính ổn định phản ứng 3.4 Thử nghiệm kỹ thuật PCR Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt Sau xây dựng quy trình chẩn đốn Microsporidia phương pháp PCR Realtime PCR, tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt nghi ngờ nhiễm Microsporidia bệnh viện Mắt Trung lu an Ương Có 30 mẫu bệnh phẩm thu thập có kết nhuộm soi n va Kết nhuộm soi: tn to Các mẫu dương tính từ đến : mẫu số 1,2, 3,4,5,6, 7, 9, 11,12, 13,15, 16, gh 19, 21, 22, 27,28,29,30 p ie Các mẫu nghi ngờ: mẫu số 14, 15, 17, 24 25 w Chúng tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp mô oa nl tả chương II, sau áp dụng quy trình kỹ thuật PCR Realtime PCR để tiến d hành đánh giá so sánh hiệu hai kỹ thuật với kỹ thuật nhuộm soi lu va an sử dụng bệnh viện Mắt Trung Ương ll u nf A oi m z at nh z m co l gm @ an Lu B n va ac th si 47 Hình 3.12 A,B Kết điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh lu an viện Mắt Trung Ương n va Đường chạy từ đến 30: sản phẩm điện di tương ứng với 30 mẫu bệnh tn to phẩm thu thập Pos: chuẩn dương Ne: chuẩn âm M; thang ADN chuẩn p ie gh A d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z @ m co l Mắt Trung Ương gm Hình 3.13 A Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Các đường tín hiệu: mẫu bệnh phẩm dương tính có mã số 3, 7, 9, an Lu 11, 13 14 n va ac th si 48 B lu an n va p ie gh tn to nl w Hình 3.13 B Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện oa Mắt Trung Ương Các đường tín hiệu: mẫu bệnh phẩm dương tính có mã d số 16, 17, 19, 21, 22, 24, 25, 27 28 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 49 Bảng 3.2 Bảng tổng hợp số liệu kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR lu an n va p ie gh tn to d oa nl w lu Kết vi sinh Nhuộm soi Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Nghi ngờ Nghi ngờ Dương tính Nghi ngờ Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Nghi ngờ Nghi ngờ Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính ll u nf va an oi m Kết sinh học phân tử PCR Realtime PCR Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính z at nh z m co l gm @ Mẫu bệnh phẩm (kí hiệu) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 an Lu n va ac th si 50 Bảng 3.3 Kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng Kết chẩn Microsporidia đốn Dương tính Âm tính Nghi ngờ Tổng số PCR 14 16 30 Realtime 15 15 30 11 14 30 PCR Nhuộm soi lu an Kết Bảng 3.3 cho thấy n va - Kỹ thuật PCR phát 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia so tn to với 11/30 phương pháp nhuộm soi 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi gh dương tính với PCR Trong mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ phương p ie pháp PCR phát mẫu dương tính mẫu âm tính w - Kỹ thuật Realtime PCR phát 15/30 mẫu dương tính với oa nl Microsporidia so với 11/30 phương pháp nhuộm soi 11/11 mẫu dương tính d nhuộm soi dương tính với Realtime PCR Trong mẫu phương pháp nhuộm lu u nf mẫu âm tính va an soi nghi ngờ phương pháp Realtime PCR phát mẫu dương tính ll - Kỹ thuật Realtime PCR phát mẫu số 25 dương tính (Ct 39) so oi m với kỹ thuật PCR trả lời âm tính nhuộm soi trả lời kết nghi ngờ cho thấy z at nh độ nhạy phương pháp realtime PCR tốt z Bàn luận @ gm Trong chẩn đoán thường quy, xét nghiệm cần thiết kế tối ưu dễ dàng cho l việc thực với mục đích hạn chế lỗi xẩy q trình thao tác, m co điều quan trọng cần có độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đoán cao Các phương pháp an Lu sử dụng để phát Microsporidia soi trực tiếp bào tử Microsporidia mẫu bệnh phẩm chất nạo giác mạc, sử dụng kỹ thuật nhuộm, nuôi cấy n va ac th si 51 PCR Trong kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp bào tử Microsporidia cho kết với độ nhạy cao Tuy nhiên, kỹ thuật địi hỏi tính chun nghiệp cao mẫu bệnh phẩm sau thu thập phải dàn lam, lí trì hoãn kỹ thuật nhuộm, đặc biệt nhuộm với postassium hydroxide trắng calcofluor (là phương pháp nhuộm có độ nhạy cao phát bảo từ Microsporidia), làm mẫu dàn tiêu bị khô ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang từ mẫu tiêu nhuộm Kỹ thuật ni cấy Microsporidia địi hỏi phịng thí nghiệm trang bị đầy đủ trang thiết bị nuôi cấy phí cao, bên cạnh kỹ thuật nuôi cấy nhiều thời gian điểm hạn chế lu an phương pháp Bệnh viện n va Nghiên cứu mô tả kỹ thuật PCR để phát vùng trình tự khác tn to tiểu phần lớn tiểu phần nhỏ ribosome vùng nối gen để chẩn gh đoán phân biệt chủng Microsporidia gây bệnh người Trong nghiên cứu p ie này, bước đầu xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ w thuật PCR mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc sử dụng cặp mồi khuếch đại đặc oa nl hiệu cho trình tự tiểu phần nhỏ ribosome, small-subunit (SSU) rRNA Cặp mồi d thẩm định phương pháp để phát vùng gen bốn chủng E lu va an hellem, E cuniculi, E intestinalis T hominis and V corneae, mô tả gây u nf bệnh mắt người Joseph cộng đánh giá hiệu chẩn đoán kỹ ll thuật PCR phát trình tự 16S rRNA Microsporidia gây bệnh mắt với độ m oi nhạy đặc hiệu tương ứng phát 83% 98% Trong nghiên cứu này, z at nh với số lượng mẫu bệnh phẩm cịn kỹ thuật PCR cho phép phát z 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia, 17 mẫu cho kết âm tính; kỹ thuật gm @ Realtime PCR phát 15/30 mẫu dương tính 11/11 mẫu dương tính với l PCR Realtime PCR cho kết dương tính nhuộm soi So sánh với kết m co nhuộm soi Bảng 3.3 cho thấy, kết qủa PCR Realtime PCR kết an Lu nhuộm soi có khác biệt giá trị chẩn đốn Có 04 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ khẳng định dương tính sử dụng kỹ thuật PCR Realtime n va ac th si 52 PCR, 01 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ khẳng định âm tính Tuy nhiên, số liệu khơng có ý nghĩa mặt thống kê cỡ mẫu nghiên cứu cịn Độ nhạy kỹ thuật PCR Realtime PCR nghiên cứu đánh giá cách pha loãng tới hạn nồng độ ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm soi dương tính với Microsporidia Kết cho thấy, kỹ thuật PCR cho phép phát 22,4 fg/L nồng độ ADN Microsporidia mẫu bệnh phẩm, độ nhạy kỹ thuật Realtime PCR 2,24 fg/L Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR đánh giá chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, lu an Staphylococcus aureus, mẫu bệnh phẩm dương tính với virus HSV CMV n va Kết khẳng định cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự gen tiểu phần nhỏ tn to ribosome Microsporidia không bắt cặp không đặc hiệu với chủng nấm, gh vi khuẩn mẫu bệnh phẩm dương tính với virus kể p ie Kỹ thuật nhuộm soi không định danh loài Microsporidia, kỹ w thuật PCR, giải trình tự định danh lồi dễ dàng thực thời oa nl gian ngắn từ 2-3 ngày Kỹ thuật phân lập nuôi cấy phát đặc hiệu lồi, d nhiên giá thành cao thời gian trả lời kết sau 2-3 tuần, kỹ lu va an thuật PCR Realtime PCR cho kết chẩn đoán vịng 24 Các kết u nf cơng bố giới cho thấy, phần lớn Microsporidia gây bệnh mắt ll người loài V corneae, T hominis E hellem, E cuniculi oi m intestinalis E z at nh Tuy nhiên kết nghiên cứu bước đầu số lượng mẫu bệnh z phẩm giới hạn, cần đánh giá hai kỹ thuật số lượng mẫu bệnh phẩm @ gm lâm sàng nhiều có so sánh đánh giá với kết nhuộm soi để áp dụng l thường quy thực hành lâm sàng, nhằm giảm thời gian xét nghiệm, đưa m co phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, giảm thiểu chi phí điều trị an Lu n va ac th si 53 KẾT LUẬN - Kỹ thuật PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc xây dựng thành công:  Độ nhạy 2.24x10-2pg/µL  Độ đặc hiệu 100%  Thời gian xét nghiệm vòng 6h - Kỹ thuật Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc xây dựng thành công: lu an  Độ nhạy 0.224x10-2pg/µL n va  Độ đặc hiệu 100% Tuy nhiên kết nghiên cứu bước đầu số lượng mẫu bệnh ie gh tn to  Thời gian xét nghiệm vòng 3h p phẩm giới hạn, cần đánh giá kỹ thuật số lượng mẫu bệnh phẩm lâm w sàng nhiều có so sánh độc lập với kỹ thuật nhuộm soi để áp dụng d oa nl chẩn đoán thường quy ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 54 KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu chúng tôi: - Tiếp tục nghiên cứu cỡ mẫu bệnh phẩm lâm sàng lớn lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Phan Dẫn, Phạm Trọng Văn, Vũ Quốc Lương (2001), Giác mạc, giải phẫu-sinh lý- miễn dịch- phẫu thuật, Nhà xuất Y học, tr.3-48 Phạm Ngọc Đông (2015), “MICROSPORIDIA: TÁC NHÂN VIÊM GIÁC MẠC NHU MÔ LẦN ĐẦU TIÊN ĐƯỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM”, Bệnh viện Mắt TW Hoàng Thị Minh Châu (2007), “Giác mạc”, Nhãn khoa giản yếu, tập 1, Nhà xuất Y học, tr.146-203 lu an Lê Anh Tâm (2008), Nghiên cứu tình hình viêm loét giác mạc bệnh n va viện Mắt trung ương 10 năm (1998 - 2007), Luận văn Thạc sĩ y học, 5.Nguyễn Xuân Trường (2005), “Viêm loét giác mạc”, Giáo trình nhãn gh tn to Trường Đại học Y Hà Nội p ie khoa, Nhà xuất Giáo dục, tr.143-179 w Lê Minh Thông (2005), “Giải phẫu sinh lý mắt”, Giáo trình nhãn oa nl khoa, Nhà xuất giáo dục, tr.9-92 d Hội nhãn khoa Mỹ (1997), “Giác mạc”, Bệnh học mi mắt, kết mạc lu u nf Tài liệu tiếng anh va an giác mạc, Nhà xuất Y học, tr.74-91 ll Baum,J., and M.Barza., 1998 Infections of the eye , Infectious oi m diseases.p 1355–1373 z at nh Butrus, S.I., and S.A.Klotz 1986 Blocking Candida adherence to z contact lenses.Curr.EyeRes 5:745–750 @ 10 Chamberlain, J S., R A Gibbs, et al (1988) "Deletion screening of gm m co Nucleic Acids Res 16(23): 11141-56 l the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification." challenging disease" Cornea 32 Suppl 1: p S33-8 an Lu 11 Garg P (2013), "Microsporidia infection of the cornea a unique and n va ac th si 56 12 Joveeta Joseph, Somasheila Murthy, Prashant Garg and Savitri Sharma1 (2006), Use of Different Stains for Microscopic Evaluation of Corneal Scrapings for Diagnosis of Microsporidial Keratitis 13 Keratoconjunctivitis in immunocompetent patient in Southern India 14 Liesegang TJ, Foster RF (1980), “Spetrum of microbial keratitis in South Florida”, Am J Ophthalmol, 90, pp.38-47 15 Loffler, J., H Hebart, et al (1997) "Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood." J Clin Microbiol 35(12): 3311-2 lu an 16 Lee et al Microsporidia Evolved from Ancestral Sexual Fungi Current n va Biology, 2008 tn to 17 Maurice Giardini (1961), Vegetative Physiology and Biochemistry: gh The Eye p ie 18 Sharma S, Srinivasan M, George C (1993), “Current status of Fusarium Schell WA, Foulk GN, Perfect JR (2008), “Chapter 15: Fungal oa nl 19 w species in mycotic keratitis in South India”, J Med Microbiol, 11, pp.140 – 147 d infection of the eye”, Principles and practice of ophthalmology, vol 1, W.B lu va an Saunder company, pp.159-168 u nf 20 Sanjay Kai, M Vanathi, Anita Panda (2009), Corneal Microsporidiosis ll 21 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular cloning I-III m oi A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, London, UK z at nh 22 Upadhyay MP, Karmacharya PC, Koirala S, Smolin G, et al (1991), z “Epidemiologic Character istics, predisposing factors, and etiologic diagnosis of m co l gm @ corneal ulceration in Nepal”, Am J Opthalmol, 111, pp.92-99 an Lu n va ac th si