(Tiểu luận) báo cáo seminar định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối của realtime pcr

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI VÀ ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI CỦA REALTIME-PCR Người hướng dẫn: Ph D Phạm Đình Chương Nhóm thực hiện: Nhóm THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 ii TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BÁO CÁO SEMINAR ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI VÀ ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI CỦA REALTIME-PCR Người hướng dẫn: Ph D Phạm Đình Chương Nhóm thực hiện: Nhóm THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 iii DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM Nguyễn Thành Tài 62101173 Cao Nhã Thùy Trang 62101199 Trần Thị Tú Trang 62100912 Nguyễn Ngọc Thiện 62101179 Vũ Hoài Phương 62101168 Lưu Thảo Linh 62101132 Lê Thị Trang 62101200 Nguyễn Huỳnh Lan Hân 62101112 Trần Thảo Xuân 62101210 iv LỜI CẢM ƠN Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô giáo khoa trường Đại học hỗ trợ q trình hồn thành seminar Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến giảng viên hướng dẫn chúng em, người dành nhiều thời gian tâm huyết để hướng dẫn chúng em từ khâu nghiên cứu, biên soạn đến việc chỉnh sửa hồn thiện seminar Chúng tơi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè chia sẻ kiến thức kinh nghiệm giúp chúng tơi hồn thiện seminar Cuối cùng, chúng em xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên ủng hộ chúng tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Sự hỗ trợ đóng góp thầy cô giáo, giảng viên bạn bè giúp chúng em hồn thành seminar thành công Chúng em tiếp tục học hỏi phát triển kiến thức để trở thành người học viên nghiên cứu viên có ích cho xã hội Một lần nữa, chân thành cảm ơn! v MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG xi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CHƯƠNG 2: SƠ LƯỢT VỀ REALTIME – qPCR 2.1 Sơ lượt Realtime – qPCR 2.1.1 Sơ lượt PCR truyền thống 2.1.2 Sơ lược Realtime- PCR 2.2 Realtime – qPCR 2.2.1 Sơ lược Realtime – PCR định lượng 2.2.2 Cách thức hoạt động 2.2.3 Thao tác kỹ thuật Realtime PCR 2.2.4 Đo lượng DNA 10 2.2.5 Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng Realtime – qPCR 13 CHƯƠNG 3: ĐỊNH LƯỢNG TUYỆT ĐỐI TRONG REALTIME -QP CR 15 3.1 Khái quát 15 vi 3.2 Phương pháp đường chuẩn 15 3.2.1 Ví dụ phương pháp đường chuẩn 16 3.2.2 Cách sử dụng phương pháp đường chuẩn 17 3.2.3 Phân tích kết 18 3.3 Ứng dụng 18 3.3.1 Phát triển xét nghiệm PCR định lượng thời gian thực để phát cụ thể Bacillus velezensis 18 CHƯƠNG 4: ĐỊNH LƯỢNG TƯƠNG ĐỐI TRONG REALTIMEqPCR 29 4.1 Khái quát 29 4.2 Hiệu suất khuếch đại mồi 29 4.3 Tham chiếu giá trị ΔCT 30 4.4 Giải pháp tăng độ tin cậy 31 4.4.1 Chọn gene tham chiếu ổn định 32 4.4.2 Chuẩn hóa cho nhiều gene tham chiếu 32 4.5 Phương pháp định lượng 32 4.5.1 Phương pháp “Double Δ CT” 32 4.5.2 Phương pháp Pfaffl 35 4.5.3 Ứng dụng 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 4.6 Phụ lục 1: Một số loại tín hiệu khác 45 Document continues below Discover more from: nghệ sinh Công học CNSH01 Đại học Tôn Đức… 249 documents Go to course Atsh - Đề cương 19 Công nghệ sinh học 100% (5) THÍ NGHIỆM SINH 31 HỌC TẾ BÀO Cơng nghệ sinh học 100% (5) Dược động - dược 25 26 động học Cơng nghệ sinh học 100% (4) Seminar-SHTBNhóm5 đại học tôn… Công nghệ sinh học 100% (4) Sinh đai cương tới 27 C13 Công nghệ sinh học 100% (3) Công nghệ sinh học 100% (3) Hoa - thực vật dược vii 39 4.6.1 Các tác nhân tín hiệu phản ứng 45 4.6.2 Primer (mồi) Probe (đầu dò) Realtime -qPCR 45 4.6.3 Đèn hiệu phân tử (Molecular beacoms) 46 4.6.4 Eclipse probe 47 4.6.5 Amplifluor 47 4.6.6 LUX gene probes 48 4.6.7 BD Qzyme Primers 49 4.7 Phụ lục 2: PCR Kỹ thuật số 50 4.8 Phụ lục 3: Chuẩn hóa 52 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA deoxyribonucleic acid dPCR digital PCR PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi Polymerase Realtime – qPCR Realtime – quantitative PCR: Định lượng PCR thời gian thực: deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid RT Realtime-qPCR reverse transcription Realtime quantitative PCR ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Các bước phản ứng khuếch đại chuỗi Polymerase Hình 2.2 Sơ đồ mẫu biểu diễn định lượng Realtime qPCR Hình 2.3 Sơ đồ mơ tả giá trị khuếch đại mẫu Hình 2.4 Sơ đồ thực Realtime- qPCR thực tế Hình 2.5 Phản ứng (RT Realtime-qPCR) SARS-CoV-2 Hình 2.6 Cách hoạt động tín hiệu huỳnh quang 10 Hình 2.7 Sơ đồ nguyên lý hoạt động mẫu dò TaqMan 12 Hình 2.8 Điện di gel Agarose phát Primer dimer 14 Hình 2.9 Cơ chế hình thành Primer Dimer 14 Hình 3.1: Đường chuẩn mẫu A B 16 Hình 3.2 Đoạn mồi tồn nhiều chủng B velezensis 19 Hình 3.3 Trình tự gene B velezensis 20 Hình 3.4 Chạy điện di, Realtime PCR B velezensis 21 Hình 3.5 Dựng đường chuẩn cho B velezensis 23 Hình 4.1 Tối ưu hóa điều kiện Realtime-qPCR 37 Hình 4.2 Số lượng plasmid 38 Hình 4.3 Đường chuẩn Realtime- qPCR bước hai bước 39 Hình 5.1 Cơ chế hoạt động chung Probe 46 Hình 5.2 Cơ chế phát quang đầu dò 46 Hình 5.3 Đầu dị Elipse hoạt động 47 Hình 5.4Cấu trúc đầu dò dùng marker Ampliflour 48 Hình 5.5 Cách hoạt động LUX gene probes 49 Hình 5.6 Cách hoạt động Qzyme probe 50 Hình 5.7 Các bước thực dPCR 51 Hình 5.8 Biểu diễn gene tín hiệu dPCR 52 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH [1] NCBI, "Polymerase Chain Reaction (PCR)," 2017 [2] K K R R O G R K I H M Y A G Deepak S, "Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes Curr Genomics.," 2007 [3] Bio-Rad, Real-Time PCR Applications Guide, 2006 [4] J Pfeifer, "ThermoFisher," 2022 [Online] [Accessed 14 2023] [6] A H.-F I R M P C Becker *, "mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis," 2010 [7] X X S C L * a L L Shuai Xu, "Development of a Real-Time Quantitative PCR Assay for the Specific Detection of Bacillus velezensis and Its Application in the Study of Colonization Ability," 2022 [8] R A M S H M M A & M S I Md Sabbir Hossain, "Identification and validation of reference genes for real-time quantitative RT-PCR analysis in jute," 2019 [9] B G v W R N H H G H D D B G L P M S M Höfler D, "HPV16 RNA patterns defined by novel high-throughput RT-qPCR as triage marker in HPV-based cervical cancer precursor screening Gynecol Oncol.," 2015 [10] J a S L a W Y a B P a K D a C C a V B a S J G a N H T Wan, "Application of Digital PCR in the Analysis of Transgenic Soybean Plants," 2016 43 [11] Y C Y L H L H L X S Z F J W Q W J T & Z Z Zhiyuan Lin, "Potential miRNA biomarkers for the diagnosis and prognosis of esophageal cancer detected by a novel absolute quantitative RT-qPCR method," 2020 [12] S Pharm, "Plasmid Copy Number Determination by Quantitative Polymerase Chain Reaction," 2016 [13] S K S F G T M B & F H Asra Malekshahi, "Diagnostic power of one-step and two-step RT-qPCR methods to SARS-CoV-2 detection," 2022 [14] B.-M C A E B.-M F B F C D Y M L.-C E Ho-Pun-Cheung A, "Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction: description of a RIN-based algorithm for accurate data normalization" [15] J M R S H S T M.-S M S A N Johanna Maukonen, "PCR DGGE and RT-PCR DGGE show diversity and short-term temporal stability in the Clostridium coccoides-Eubacterium rectale group in the human intestinal microbiota," 2006 [16] F R J M J A H A Wong W, "Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.," 2015 [17] P D S Bhattacharyya, "Molecular Beacon," 2011 [18] Y W R S S e a Belousov, "Single nucleotide polymorphism genotyping by two colour melting curve analysis using the MGB Eclipse™ Probe System in challenging sequence environment," 2004 [19] S K A Z L e a Jatayev, "Advantages of Amplifluor-like SNP markers over KASP in plant genotyping.," 2017 [21] Y L G H F e a Chang, "ntegrated polymerase chain reaction chips utilizing digital microfluidics," 2006 44 [22] L C T H C Y L K Mao X, "Principles of digital PCR and its applications in current obstetrical and gynecological diseases," 2019 [23] J H Stephen Bustin, "qPCR primer design revisited," 2017 TÀI LIỆU TRÊN WEB [5] T F Scientific, "Multiplex vs Singleplex qPCR: What Do I Need To Know?," 2022 [Online] Available: https://www.thermofisher.com/blog/behindthebench/multiplexvs-singleplex-qpcr-what-do-i-need-to-know/ [Accessed 14 2023] [20] "Overview: Types of PCR Probes," 2022 [Online] Available: https://goldbio.com/articles/article/Overview-Types-PCR-Probes [Accessed 12 2023] 45 PHỤ LỤC 4.6 Phụ lục 1: Một số loại tín hiệu khác 4.6.1 Các tác nhân tín hiệu phản ứng Chọn chất hóa học để thực việc quan sát, tiếp nhân số liệu điều quan trọng Hiện có nhiều loại chất huỳnh quang nhiên chia làm loại chính: DNA-binding dyes (SYBR Green 1), dye-labeled Ngồi cịn phải có trình tự oligonucleotide dạng primers probes (Đầu dò phân tử (molecular beacons) TaqMan, hybridization, Eclipse probes, Amplifluor, Scorpions, LUX, BD Qzyme primers) 4.6.2 Primer (mồi) Probe (đầu dò) Realtime -qPCR Primer đoạn DNA mạch đơn ngắn đóng vai trị chất khởi đầu cho trình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase bổ sung nucleotide vào nhóm 3' OH trình tự mồi tổng hợp chuỗi bổ sung cho DNA mẫu Mồi đoạn ngắn có chiều dài từ 18 đến 20 nucleotide Mẫu dị đoạn DNA RNA nhỏ nhận biết trình tự bổ sung DNA RNA cho phép xác định trình tự đích Độ dài mẫu dị khác (100 đến 1000 base) nucleotide mẫu dò bổ sung cho phần trình tự đích Để dễ phát nhờ đầu dị thiết bị, mẫu dò dán nhãn đồng vị phóng xạ thuốc nhuộm huỳnh quang kháng thể [16] 46 Hình 0.1 Cơ chế hoạt động chung Probe Phương pháp dùng mồi huỳnh quang có ưu điểm độ đặc hiệu cao, thích hợp phản ứng Multiplex Realtime -qPCR Tuy nhiên chi phí đầu dò cao, dùng cho phản ứng yêu cầu độ xác cao 4.6.3 Đèn hiệu phân tử (Molecular beacoms) Đèn hiệu phân tử phân tử thăm dò thể cấu trúc vòng gốc đặc trưng mà qua đầu 5′ 3′ trì gần nhau, đầu 5’ 3’ tách ra, phát quang xuất Theo cách tương tự đầu dị TaqMan mơ tả trên, huỳnh quang từ chất huỳnh quang đầu đầu dò bị triệt tiêu tác nhân mã gần [17] Hình 0.2 Cơ chế phát quang đầu dò 47 4.6.4 Eclipse probe Các mẫu dò Eclipse phát huỳnh quang oligonucleotide biến đổi có chứa tripeptide dihydrocyclopyrroloidole ổn định, liên kết cộng hóa trị, mang khả phân loại mẫu tốt Eclipse ngăn chặn xuống cấp đầu dò trình phản ứng PCR Hình 0.3 Đầu dị Elipse hoạt động [18] 4.6.5 Amplifluor Có giá thành rẻ, độ xác cao nhiên sử dụng cho số loại mẫu định 48 Hình 0.4Cấu trúc đầu dò dùng marker Ampliflour Hai đầu dò gắn nhãn FAM (a) HEX/VIC (b) hiển thị Năm yếu tố đầu dò biểu thị số: (1) Fluorophores đầu 5′; (2, 3) Kẹp tóc có thân vòng tương ứng; (4) Thymine oligonucleotide sửa đổi (T) biểu thị dấu hoa thị, với chất khử, in đậm; (5) Một đuôi cụ thể cho đầu 3′, in nghiên [19] 4.6.6 LUX gene probes Các đầu dò LUX đầu dò dán nhãn sử dụng Realtime -qPCR để lai với trình tự mục tiêu tạo huỳnh quang để biểu thị xếp Nó chứa lớp lót cấu trúc vịng gọi lớp lót LUX™ Nó có trình tự bổ sung cho mục tiêu phóng viên huỳnh quang Tại đây, đoạn mồi LUX™ mở trình tự bên gắn vào trình tự đích Nó làm cho cấu trúc kẹp tóc mở ra, làm thay đổi cấu trúc thứ cấp đầu dị [20] 49 Hình 0.5 Cách hoạt động LUX gene probes 4.6.7 BD Qzyme Primers Trình tự mồi cấu trúc DNA xúc tác mở rộng chu kỳ khuếch đại sản phẩm đóng vai trị khn mẫu chu kỳ khuếch đại thứ hai Đoạn mồi đảo ngược dành riêng cho mục tiêu sử dụng trình tự cho sản phẩm cấu trúc DNA xúc tác làm mẫu để kéo dài tạo sản phẩm chứa vùng DNA xúc tác hoạt động Cơ chất oligonucleotide phổ biến lai với sản phẩm mồi ngược dành riêng cho mục tiêu tách bước ủ với trợ giúp DNAzyme Sự phân tách tách chất dập tắt khỏi phóng xạ phóng viên tự phát huỳnh quang 50 Hình 0.6 Cách hoạt động Qzyme probe Đầu dò QZyme liên kết với trình tự đích Trình tự antisense mở rộng để kích hoạt chất oligonucleotide phổ quát Sau đầu dị bị cắt, phóng viên tự phát huỳnh quang [20] 4.7 Phụ lục 2: PCR Kỹ thuật số igital PCR (dPCR) thành tựu quan tâm phát triển, phát triển từ năm 1990 1991 gọi “limiting dilution PCR2” Vào khoảng 1999, Kinzler Vogelstein đề xuất nên phương pháp định lượng dựa tảng Realtime -qPCR báo cáo "Digital PCR: A Novel Method for Absolute Quantification of Target RNA" Digital PCR Tuy nhiên, thuật ngữ Digital PCR Là m ột phương pháp phân tích số lượng gene ho ặc DNA có mẫu b ằng cách sử dụng chuỗi phản ứng PCR với liều lượng khác so với mẫu ban đầu với nồng độ giảm dần, dùng để xác định số lượng tế bào vi khuẩn có mẫu, định lượng DNA từ nguồn khác 51 khứ có số thuật ngữ mô tả tương tự “Single molecule PCR” 3(PCR đơn phân tử) “Limiting dilution PCR” (PCR pha loãng giới hạn) Điểm bật dPCR so với phương pháp khác phát triển từ Realtime -qPCR nhờ công nghệ microfluidics phát triển Microfluidic chip công nghệ thực gồm việc chuyển mẫu, trộn khuếch đại DNA thực chip môi trường điện trường [21] Cụ thể hơn, dPCR thực sau: Hình 0.7 Các bước thực dPCR Mẫu chuẩn hóa đưa thành nhiều vùng độc lập cho phân vùng chứa DNA Ở phân vùng có chuỗi Positive (đánh dấu phát quang đỏ), phản ứng với Microfluidics, có chuỗi Negative (khơng phát quang) mà có phân vùng có chứa chuỗi khơng liên quan khơng phản ứng Tuy nhiên, phản ứng thêm loại probe để phát đâu negative, đâu positive thông qua việc dùng màu phát quan khác Là kỹ thuật phát nhân DNA cách đơn lẻ thay nhân theo cách truy ền thống, khuếch đại phân tử đơn lẻ cho mục đích giải trình tự, tạo kiểu gen dịch mã xi dịng Gần đây, tích hợp cách có hệ thống vào q trình đọc DNA thơng lượng cao [24] 52 Hình 0.8 Biểu diễn gene tín hiệu dPCR Do tính đặc hiệu nó, phương pháp cho kết xác, độ nhiễu thấp, độ nhạy cao, đáng tin dễ đọc Tuy nhiên giá thành cao dải nhận biết hẹp điểm bất lợi phương pháp [22] 4.8 Phụ lục 3: Chuẩn hóa Trong mẫu cần thực phân tích định lượng, gene chia làm loại chính: gene đích (target gene), hai gene kiểm soát (Control gene) Gene kiểm soát gene chuẩn hóa, housekeeping gene 53 Ở mẫu chưa xử lý qua việc chuẩn hóa, có chứa cDNA với nồng độ khác nhau, giá trị CT xuất khác Hình 0.9 So sánh mẫu chuẩn hóa chưa chuẩn hóa thực Realtime-PCR So sánh mẫu chưa chuẩn hóa (Untreated) mẫu chuẩn hóa (Treated) thực Realtime-qPCR Do cần phải có q trình kiểm sốt nội sinh cho mẫu, housekeeping gene thêm vào để ổn định nhiều loại mẫu Nhờ vào việc kiểm soát nội sinh housekeeping gene, theo dõi lượng cDNA thay đổi từ mẫu sang mẫu khác 54 Hình 0.10 Biểu thị Realtime-qPCR sau thêm vào housekeeping gene (Đường xanh dương) Sau đó, dựa giá trị lệch nhau, ta tính tốn lượng cDNA xuất mẫu đầu vào 55 Bảng 0.1 Số liệu ví dụ việc tìm lượng cDNA chuẩn hóa Đối với phương pháp AQ RQ, số lượng mẫu mang thí nghiệm phải chuẩn hóa cho liệu trở nên có nghĩa.[8] Trong RQ, chuẩn hóa dùng để đảm bảo mẫu tương đương so sánh Kết Realtime-qPCR cho biết mức độ biểu gene quan tâm so với mức độ biểu internal control gene, đánh giá mức độ biến động gen quan tâm điều kiện thí nghiệm hay mẫu khác Housekeeping gene có tác động lớn đến độ tin cậy gene tham chiếu, có Housekeeping gene phổ biến thị trường gồm ACTB, B2M, EF1α, GAPDH, GUSB, HPRT, PPIA, RNA18S, RPL13A TBP, UBC YWHAZ nhiên cần phải lựa chọn Housekeeping gene có trình tự ổn định để sử dụng, để tránh lỗi xảy liên quan đến Housekeeping gene, người ta cần phải tra cứu, tìm hiểu housekeeping gene, thử nghiệm độ xác giá trị CT phản ứng 56 Hình 0.11 Độ hiệu loại Housekeeping gene Sau lựa chọn xong đoạn Housekeeping gene, cần tinh RNA phương pháp giống cho tất mẫu: mẫu bị ảnh hưởng nhiều yếu tố trình thực Cuối cùng, định lượng lượng nhỏ mẫu để kiểm chứng Khi kiểm chứng, cần xem xét độ lệch mẫu gốc để xét nghiệm, mẫu cDNA thực phản ứng mơi trường có housekeeping gene, xem xét độ lệch, thấp tốt [4]