LUẬN văn THẠC sĩ HAY xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và realtime PCR​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - PHẠM QUỲNH TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Long Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108 Thái Nguyên - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cửa tơi hưỡng dẫn TS Nguyễn Văn long Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái nguyên, tháng 11 năm 2017 Tác giả Phạm Quỳnh Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Long trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Bs Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017 Học viên Phạm Quỳnh Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc .3 1.1 Giác mạc 1.1.1 Biểu mô 1.1.2 Màng đáy màng Bowmann 1.1.3 Nhu mô 1.1.4 Màng Descemet 1.1.5 Nội mô .5 1.2 Yếu tố nguy gây viêm loét giác mạc 1.3 Các triệu chứng lâm sàng thường gặp viêm loét giác mạc 1.3.1 Triệu chứng 1.3.2 Triệu chứng thực thể Microsporidia 2.1 Giới thiệu chung 2.2 Bệnh học nguy 11 2.3 Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia .12 2.4 Chẩn đoán viêm loét giác mạc 12 2.5 Các phương pháp phát Microsporidia 13 2.5.1 Chẩn đoán phân biệt 13 2.5.2 Chẩn đoán xác định 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 19 3.1 Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 19 3.2 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc Việt Nam 20 Chương II .22 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 22 Đối tượng nghiên cứu 22 Hóa chất, thiết bị 22 2.1 Hóa chất 22 2.2 Thiết bị, máy móc 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số .24 2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ đo độ tinh máy quang phổ 25 2.3.3 Phương pháp điện di gel agarose 25 2.3.4 Phương pháp xác định trình tự axit nucleic 26 2.3.5 Xây dựng quy trình phát Microsporidia phương pháp PCR Realtime PCR 28 2.3.5.1 Xác định độ nhạy phương pháp PCR Realtime PCR 30 CHƯƠNG III 36 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Kết xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR Realtime PCR 36 3.2 Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR 39 3.2.1 Đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR Realtime PCR 39 3.2.2 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR .41 3.3 Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia 43 3.4 Thử nghiệm kỹ thuật PCR Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biểu đồ thể tác nhân gây tai nạn mắt lao động sản xuất (theo thống kê hàng năm BV Mắt TP HCM)(%) Hình Thiết đồ cắt dọc giác mạc Hình 1.3 Hình ảnh minh họa Microsporidia 10 Hình 1.4 Ngun lí phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman 18 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia 36 Hình 3.2 Minh họa kết giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc bệnh nhân KHUYEN 37 Hình 3.3 Kết so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen giới 38 Hình 3.4 Kết khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia phản ứng Realtime PCR 39 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR phát Vittaforma corneae 40 Hình 3.6 Kết Realtime PCR đánh giá độ nhạy kỹ thuật Realtime phát Vittaforma corneae 41 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật PCR phát Microsporidia 42 Hình 3.8 Kết Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR phát Microsporidia 42 Hình 3.9a Kết điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết phản ứng ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida cặp mồi vector M13 43 Hình 3.9b Kết điện di sản phẩm plasmid PCR cặp mồi vector M13 plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia 44 Hình 3.10 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii Hình 3.11 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ 45 Hình 3.12 A,B Kết điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 47 Hình 3.13 A Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 47 Hình 3.13 B Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA Microsporidia sử dụng cặp mồi MF1&MF2 28 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F Betaglobin R 29 Bảng 2.3 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA Microsporidia sử dụng cặp mồi MSRT1&MSRT2 probe MSRT 30 Bảng 2.4 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy phương pháp 30 Bảng 2.5 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy phương pháp 31 Bảng 2.6 Thành phần điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu phương pháp 32 Bảng 2.7 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu phương pháp 32 Bảng 2.8 Thành phần điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 33 chuẩn dương 33 Bảng 2.9 Thành phần điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid 34 chuẩn dương 34 Bảng 3.1 Bảng pha lỗng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đốn dương tính với Vittaforma corneae 40 Bảng 3.2 Bảng tổng hợp số liệu kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR 49 Bảng 3.3 Kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 aeruginosa, Staphylococcus aureus mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính với virus HSV CMV Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật PCR phát Microsporidia Đường chạy số 1–6, tương ứng chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, mẫu bệnh phẩm chẩn đốn dương tính với virus HSV CMV (+),đối chứng dương Vittaforma corneae (-), đối chứng âm M, thang ADN chuẩn Hình 3.8 Kết Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR phát Microsporidia LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Kết hình 3.7 3.8 cho thấy quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi MF1&MF2 kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi MSRT1 MSRT2 với probe MSRT phát đặc hiệu trình tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA Microsporidia mà không bắt cặp không đặc hiệu với mầm bệnh vi sinh vật khác 3.3 Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia Theo trình bày phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu, thực cloning đoạn trình tự khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia vào vector pTZ57R/T để tạo vector tái tổ hợp pTZ57RR/TMicrosporidia phản ứng ligation xúc tác enzyme T4 ligage Sản phẩm phản ứng ligation sau biến nạp vào tế bào khả biến E Coli DH5α Các khuẩn lạc chọn lọc đĩa thạch có trải kháng sinh ampicillin IPTG/XGal Các khuẩn lạc cho kết dương tính khuẩn lạc mọc đĩa có màu trắng, khuẩn lạc không xảy phản ứng ligation cho màu xanh xảy phản ứng cảm ứng với IPTG/XGal Hình 3.9A Kết điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết phản ứng ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida cặp mồi vector M13 Đường chạy số 1: plasmid pTZ57R/T làm đối chứng âm Đường chạy số đến 10 đến 12 khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid pTZ57R/TMicrosporidia Đường chạy số 8,9 khuẩn lạc nghi ngờ âm tính M: thang chuẩn ADN LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Cặp mồi vector M13 có vị trí gắn đặc hiệu vector pTZ57R/T cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thước 152bp 406bp tương ứng với dịng mang khơng mang plasmid tái tổ hợp pTZ57R/T-Microsporidia Chúng tiến hành chọn khuẩn lạc nghi ngờ dương tính có chứa plasmid pTZ57R/T-Microsporidia để tiến hành tách plasmid chạy kiểm chứng lại phản ứng Colning DNA Hình 3.9B Kết điện di sản phẩm plasmid PCR cặp mồi vector M13 plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia Đường chạy số 1: plasmid tách từ khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid pTZ57R/TMicrosporidia M: thang chuẩn ADN Kết từ hình 3.9b cho thấy, khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid plasmid pTZ57R/T-Microsporidia sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13 nhân lên đoạn gen có kích thước 400bp (bao gồm đoạn gen vector + đoạn chèn ADN Microsporidia) Từ khẳng định, chúng tơi cloning đoạn gen khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal Microsporidia vào vector pTZ57R/T Để sử dụng plasmid chuẩn dương tạo làm chuẩn dương sử dụng nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành đo OD, tính số copies tương ứng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 plasmid sau tiến hành pha lỗng xuống nồng độ thấp Sau đó, tiến hành chạy PCR Realtime PCR để chọn nồng độ plasmid lấy làm chuẩn dương thích hợp Hình 3.10 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha lỗng nồng độ Đường tín hiệu từ đến 7: plasmid chuẩn dương pha loãng nồng độ 108, 107, 106,105,104,103,102 Hình 3.11 Kết Realtime PCR mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ Đường chạy từ đến 7: plasmid chuẩn dương pha loãng nồng độ 108, 107, 106,105,104,103,102 Đường chạy số 8: chuẩn âm M: thang nồng độ ADN LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 Từ kết Hình 3.10 3.11, chúng tơi lựa chọn nồng độ 103 làm nồng độ plasmid chứng dương sử dụng nghiên cứu sau Ở nồng độ này, đảm bảo trình PCR Realtime PCR khơng xảy tượng dương tính giả nhiễm chéo, đảm bảo tính ổn định phản ứng 3.4 Thử nghiệm kỹ thuật PCR Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt Sau xây dựng quy trình chẩn đoán Microsporidia phương pháp PCR Realtime PCR, tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt nghi ngờ nhiễm Microsporidia bệnh viện Mắt Trung Ương Có 30 mẫu bệnh phẩm thu thập có kết nhuộm soi Kết nhuộm soi: Các mẫu dương tính từ đến : mẫu số 1,2, 3,4,5,6, 7, 9, 11,12, 13,15, 16, 19, 21, 22, 27,28,29,30 Các mẫu nghi ngờ: mẫu số 14, 15, 17, 24 25 Chúng tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp mơ tả chương II, sau áp dụng quy trình kỹ thuật PCR Realtime PCR để tiến hành đánh giá so sánh hiệu hai kỹ thuật với kỹ thuật nhuộm soi sử dụng bệnh viện Mắt Trung Ương A B LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 Hình 3.12 A,B Kết điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương Đường chạy từ đến 30: sản phẩm điện di tương ứng với 30 mẫu bệnh phẩm thu thập Pos: chuẩn dương Ne: chuẩn âm M; thang ADN chuẩn A Hình 3.13 A Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương Các đường tín hiệu: mẫu bệnh phẩm dương tính có mã số 3, 7, 9, 11, 13 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 48 B Hình 3.13 B Kết Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương Các đường tín hiệu: mẫu bệnh phẩm dương tính có mã số 16, 17, 19, 21, 22, 24, 25, 27 28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 49 Bảng 3.2 Bảng tổng hợp số liệu kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR Mẫu bệnh phẩm (kí hiệu) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kết vi sinh Nhuộm soi Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Nghi ngờ Nghi ngờ Dương tính Nghi ngờ Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Nghi ngờ Nghi ngờ Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Kết sinh học phân tử PCR Realtime PCR Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 50 Bảng 3.3 Kết phát Microsporidia 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng Kết chẩn Microsporidia đốn Dương tính Âm tính Nghi ngờ Tổng số PCR 14 16 30 Realtime 15 15 30 11 14 30 PCR Nhuộm soi Kết Bảng 3.3 cho thấy - Kỹ thuật PCR phát 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia so với 11/30 phương pháp nhuộm soi 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi dương tính với PCR Trong mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ phương pháp PCR phát mẫu dương tính mẫu âm tính - Kỹ thuật Realtime PCR phát 15/30 mẫu dương tính với Microsporidia so với 11/30 phương pháp nhuộm soi 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi dương tính với Realtime PCR Trong mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ phương pháp Realtime PCR phát mẫu dương tính mẫu âm tính - Kỹ thuật Realtime PCR phát mẫu số 25 dương tính (Ct 39) so với kỹ thuật PCR trả lời âm tính nhuộm soi trả lời kết nghi ngờ cho thấy độ nhạy phương pháp realtime PCR tốt Bàn luận Trong chẩn đoán thường quy, xét nghiệm cần thiết kế tối ưu dễ dàng cho việc thực với mục đích hạn chế lỗi xẩy q trình thao tác, điều quan trọng cần có độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đoán cao Các phương pháp sử dụng để phát Microsporidia soi trực tiếp bào tử Microsporidia mẫu bệnh phẩm chất nạo giác mạc, sử dụng kỹ thuật nhuộm, nuôi cấy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 51 PCR Trong kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp bào tử Microsporidia cho kết với độ nhạy cao Tuy nhiên, kỹ thuật địi hỏi tính chun nghiệp cao mẫu bệnh phẩm sau thu thập phải dàn lam, lí trì hỗn kỹ thuật nhuộm, đặc biệt nhuộm với postassium hydroxide trắng calcofluor (là phương pháp nhuộm có độ nhạy cao phát bảo từ Microsporidia), làm mẫu dàn tiêu bị khơ ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang từ mẫu tiêu nhuộm Kỹ thuật ni cấy Microsporidia địi hỏi phịng thí nghiệm trang bị đầy đủ trang thiết bị nuôi cấy phí cao, bên cạnh kỹ thuật ni cấy nhiều thời gian điểm hạn chế phương pháp Bệnh viện Nghiên cứu mô tả kỹ thuật PCR để phát vùng trình tự khác tiểu phần lớn tiểu phần nhỏ ribosome vùng nối gen để chẩn đoán phân biệt chủng Microsporidia gây bệnh người Trong nghiên cứu này, bước đầu xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc sử dụng cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho trình tự tiểu phần nhỏ ribosome, small-subunit (SSU) rRNA Cặp mồi thẩm định phương pháp để phát vùng gen bốn chủng E hellem, E cuniculi, E intestinalis T hominis and V corneae, mô tả gây bệnh mắt người Joseph cộng đánh giá hiệu chẩn đốn kỹ thuật PCR phát trình tự 16S rRNA Microsporidia gây bệnh mắt với độ nhạy đặc hiệu tương ứng phát 83% 98% Trong nghiên cứu này, với số lượng mẫu bệnh phẩm cịn kỹ thuật PCR cho phép phát 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia, 17 mẫu cho kết âm tính; kỹ thuật Realtime PCR phát 15/30 mẫu dương tính 11/11 mẫu dương tính với PCR Realtime PCR cho kết dương tính nhuộm soi So sánh với kết nhuộm soi Bảng 3.3 cho thấy, kết qủa PCR Realtime PCR kết nhuộm soi có khác biệt giá trị chẩn đốn Có 04 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ khẳng định dương tính sử dụng kỹ thuật PCR Realtime LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 52 PCR, 01 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ khẳng định âm tính Tuy nhiên, số liệu khơng có ý nghĩa mặt thống kê cỡ mẫu nghiên cứu cịn Độ nhạy kỹ thuật PCR Realtime PCR nghiên cứu đánh giá cách pha loãng tới hạn nồng độ ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm soi dương tính với Microsporidia Kết cho thấy, kỹ thuật PCR cho phép phát 22,4 fg/L nồng độ ADN Microsporidia mẫu bệnh phẩm, độ nhạy kỹ thuật Realtime PCR 2,24 fg/L Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Realtime PCR đánh giá chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, mẫu bệnh phẩm dương tính với virus HSV CMV Kết khẳng định cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự gen tiểu phần nhỏ ribosome Microsporidia không bắt cặp không đặc hiệu với chủng nấm, vi khuẩn mẫu bệnh phẩm dương tính với virus kể Kỹ thuật nhuộm soi không định danh lồi Microsporidia, kỹ thuật PCR, giải trình tự định danh lồi dễ dàng thực thời gian ngắn từ 2-3 ngày Kỹ thuật phân lập ni cấy phát đặc hiệu loài, nhiên giá thành cao thời gian trả lời kết sau 2-3 tuần, kỹ thuật PCR Realtime PCR cho kết chẩn đoán vịng 24 Các kết cơng bố giới cho thấy, phần lớn Microsporidia gây bệnh mắt người loài V corneae, T hominis E hellem, E cuniculi E intestinalis Tuy nhiên kết nghiên cứu bước đầu số lượng mẫu bệnh phẩm giới hạn, cần đánh giá hai kỹ thuật số lượng mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhiều có so sánh đánh giá với kết nhuộm soi để áp dụng thường quy thực hành lâm sàng, nhằm giảm thời gian xét nghiệm, đưa phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, giảm thiểu chi phí điều trị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 53 KẾT LUẬN - Kỹ thuật PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc xây dựng thành công:  Độ nhạy 2.24x10-2pg/µL  Độ đặc hiệu 100%  Thời gian xét nghiệm vòng 6h - Kỹ thuật Realtime PCR phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc xây dựng thành cơng:  Độ nhạy 0.224x10-2pg/µL  Độ đặc hiệu 100%  Thời gian xét nghiệm vòng 3h Tuy nhiên kết nghiên cứu bước đầu số lượng mẫu bệnh phẩm giới hạn, cần đánh giá kỹ thuật số lượng mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhiều có so sánh độc lập với kỹ thuật nhuộm soi để áp dụng chẩn đốn thường quy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 54 KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu chúng tôi: - Tiếp tục nghiên cứu cỡ mẫu bệnh phẩm lâm sàng lớn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Phan Dẫn, Phạm Trọng Văn, Vũ Quốc Lương (2001), Giác mạc, giải phẫu-sinh lý- miễn dịch- phẫu thuật, Nhà xuất Y học, tr.3-48 Phạm Ngọc Đông (2015), “MICROSPORIDIA: TÁC NHÂN VIÊM GIÁC MẠC NHU MÔ LẦN ĐẦU TIÊN ĐƯỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM”, Bệnh viện Mắt TW Hoàng Thị Minh Châu (2007), “Giác mạc”, Nhãn khoa giản yếu, tập 1, Nhà xuất Y học, tr.146-203 Lê Anh Tâm (2008), Nghiên cứu tình hình viêm loét giác mạc bệnh viện Mắt trung ương 10 năm (1998 - 2007), Luận văn Thạc sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội 5.Nguyễn Xuân Trường (2005), “Viêm loét giác mạc”, Giáo trình nhãn khoa, Nhà xuất Giáo dục, tr.143-179 Lê Minh Thông (2005), “Giải phẫu sinh lý mắt”, Giáo trình nhãn khoa, Nhà xuất giáo dục, tr.9-92 Hội nhãn khoa Mỹ (1997), “Giác mạc”, Bệnh học mi mắt, kết mạc giác mạc, Nhà xuất Y học, tr.74-91 Tài liệu tiếng anh Baum,J., and M.Barza., 1998 Infections of the eye , Infectious diseases.p 1355–1373 Butrus, S.I., and S.A.Klotz 1986 Blocking Candida adherence to contact lenses.Curr.EyeRes 5:745–750 10 Chamberlain, J S., R A Gibbs, et al (1988) "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification." Nucleic Acids Res 16(23): 11141-56 11 Garg P (2013), "Microsporidia infection of the cornea a unique and challenging disease" Cornea 32 Suppl 1: p S33-8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 56 12 Joveeta Joseph, Somasheila Murthy, Prashant Garg and Savitri Sharma1 (2006), Use of Different Stains for Microscopic Evaluation of Corneal Scrapings for Diagnosis of Microsporidial Keratitis 13 Keratoconjunctivitis in immunocompetent patient in Southern India 14 Liesegang TJ, Foster RF (1980), “Spetrum of microbial keratitis in South Florida”, Am J Ophthalmol, 90, pp.38-47 15 Loffler, J., H Hebart, et al (1997) "Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood." J Clin Microbiol 35(12): 3311-2 16 Lee et al Microsporidia Evolved from Ancestral Sexual Fungi Current Biology, 2008 17 Maurice Giardini (1961), Vegetative Physiology and Biochemistry: The Eye 18 Sharma S, Srinivasan M, George C (1993), “Current status of Fusarium species in mycotic keratitis in South India”, J Med Microbiol, 11, pp.140 – 147 19 Schell WA, Foulk GN, Perfect JR (2008), “Chapter 15: Fungal infection of the eye”, Principles and practice of ophthalmology, vol 1, W.B Saunder company, pp.159-168 20 Sanjay Kai, M Vanathi, Anita Panda (2009), Corneal Microsporidiosis 21 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular cloning I-III A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, London, UK 22 Upadhyay MP, Karmacharya PC, Koirala S, Smolin G, et al (1991), “Epidemiologic Character istics, predisposing factors, and etiologic diagnosis of corneal ulceration in Nepal”, Am J Opthalmol, 111, pp.92-99 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ thuật PCR mẫu bênh phẩm viêm giác mạc - Xây dựng quy trình phát Microsporidia kỹ thuật Realtime PCR mẫu bênh phẩm viêm giác mạc - Áp dụng kỹ thuật PCR Realtime. .. TRANG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ REALTIME PCR Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH... bệnh phẩm viêm loét giác mạc kỹ thuật PCR Realtime PCR. ” 1.Mục tiêu đề tài: Xây dựng tối ưu hóa phản ứng PCR Realtime PCR để phát Microsporidia mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc Nội dung nghiên cứu - Xây