Phân biệt thịt bò, trâu, heo bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR

Mục tiêu của nghiên cứu là tối ưu quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bò, trâu, heo, từ đó ứng dụng để phát hiện gian lận thương mại. Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM và đoạn dò 100 nM (bò và trâu), nồng độ mồi 300 nM và đoạn dò 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ gồm biến tính ở 950C/15 giây và bắt cặp – kéo dài ở 600C/40 giây. Mời các bạn cùng tham khảo!

PHÂN BIỆT THỊT BÒ, TRÂU, HEO BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME PCR A MULTIPLEX REALTIME PCR METHOD TO DISCRIMINATE MEAT OF BEEF, BUFFALO AND PORK Trần Minh Tấn1,*, Nguyễn Ngọc Tuân2,** Chi cục Thú y vùng VI TP HCM GV thỉnh giảng Bộ môn Thú y, Viện Khoa học Ứng dụng, trường ĐH Công nghệ TP HCM Email: *tranminhtan06@gmail.com, **nntttd@gmail.com TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu tối ưu quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bị, trâu, heo, từ ứng dụng để phát gian lận thương mại Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM đoạn dò 100 nM (bò trâu), nồng độ mồi 300 nM đoạn dị 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ gồm biến tính 950C/15 giây bắt cặp – kéo dài 600C/40 giây Quy trình có độ nhạy độ đặc hiệu cao, giới hạn phát phương pháp hỗn hợp mẫu thịt tươi thịt xử lý nhiệt (801200C/15 phút) 0,1% theo khối lượng 0,005 ng DNA/phản ứng Áp dụng quy trình để kiểm tra sản phẩm thịt chế biến thị trường phát gian lận Kết sơ cho thấy 66,67% (8/12) mẫu xúc xích bị chứa thịt trâu sản phẩm Tất 12 mẫu bò viên kiểm tra phát DNA bò 66,67% mẫu lẫn thịt trâu 16,67% mẫu lẫn thịt heo Từ khóa: DNA, multiplex realtime PCR, gian lận, thịt bò-trâu-heo ĐẶT VẤN ĐỀ Xác định loài sản phẩm thịt lĩnh vực phát triển nhanh chóng có liên quan đến tôn giáo, gian lận thương mại sức khỏe người tiêu dùng Trên thị trường, nhiều sản phẩm thịt tươi sản phẩm thịt chế biến không ghi nhãn hiệu, thành phần loại thịt nhằm gian lận, lừa dối người tiêu dùng để thu lợi bất Theo báo cáo trước đây, khoảng 22% thịt sản phẩm thịt chế biến Thổ Nhĩ Kỳ chứa loại thịt không ghi nhãn [1] Tại Thổ Nhĩ Kỳ, mẫu xúc xích với nhãn ghi 5% thịt bị lại khơng phát DNA bị sản phẩm thịt bò viên ghi nhãn thịt bò 100% lại phát thịt gà gà tây [10] Tháng 07/2016, Trung tâm giám định pháp y (Sở Y tế TP HCM) thơng báo kết giám định bị viên công ty TP HCM cho thấy mẫu bị viên nhãn hiệu GoGo có DNA cá, khơng tìm thấy DNA bị, mẫu bị viên nhãn hiệu Merlion có DNA trâu cá khơng có DNA bị [9] Như vậy, thịt bị sản phẩm từ thịt bị có giá trị kinh tế cao làm giả từ thịt trâu, thịt heo cá nhằm thu lợi bất Hiện nay, Việt Nam số nước không cho phép nhập bột thịt xương có nguồn gốc từ bị, cừu nước vùng lãnh thổ bị bệnh BSE để làm nguyên liệu sản xuất thức ăn gia súc 1020 Ngày nay, có nhiều phương pháp phân biệt loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt Phương pháp phát dựa vào protein điện di, miễn dịch, sắc ký Nhược điểm cho kết chậm áp dụng với sản phẩm thịt xử lý nhiệt độ cao Phương pháp dựa vào DNA sử dụng nhiều khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA-RAPD, PCR đặc trưng cho lồi Theo số cơng trình cơng bố Matsunaga ctv [5] sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát sáu loại thịt bò-heo-cừudê-ngựa-gà từ hỗn hợp thịt tươi thịt chế biến phân biệt thịt trâu bị Cho nên Đồn Thị Tuyết Lê Nguyễn Ngọc Tuân [2] thiết kế mồi xây dựng quy trình PCR để khẳng định hỗn hợp thịt bị có lẫn thịt trâu hay khơng Kỹ thuật multiplex PCR cho phép phát nhiều gene đích nhiều loài khác sản phẩm thịt Để tăng độ tin cậy phản ứng việc sử dụng đoạn dò (probe) đặc hiệu rút ngắn thời gian thu kết quả, kỹ thuật multiplex realtime PCR áp dụng Rentsch ctv [8] phát DNA bị, dê, cừu, trâu sữa phơ mai Mục tiêu báo tối ưu hóa quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bị, trâu, heo điều kiện phịng thí nghiệm, từ ứng dụng quy trình để phân biệt nhanh loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị mẫu Hai mươi bốn mẫu thịt tươi (bò, heo, trâu) thu thập từ số lò mổ mẫu thịt kiểm dịch nhập TP Hồ Chí Minh Mẫu bảo quản lạnh đơng -20oC đến tiến hành thử nghiệm Mỗi mẫu thịt tươi lấy khoảng 100 gam cho vào túi nylon sạch, dán nhãn riêng Ba mươi mẫu thịt từ 15 loài động vật thủy sản khác thu thập để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu (02 mẫu mồi loài) Bao gồm nhóm thú ăn cỏ (cừu, dê, ngựa), nhóm gia cầm (gà, cút, vịt, ngan), nhóm thú ăn thịt (chó, mèo), nhóm thú gậm nhấm (thỏ, chuột) nhóm hải sản (tơm, cá) Ngồi ra, đậu nành kiểm tra đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu thành phần thường thêm vào chế biến xúc xích thịt [6] Khảo sát cịn thu thập 12 mẫu xúc xích bị, mẫu 12 bị viên từ cửa hàng thực phẩm TP HCM để kiểm tra thành phần thịt ghi nhãn 2.2 Chiết tách DNA Cân 25 mg mẫu để tách chiết DNA kít DNeasy blood and tissue (Qiagen, Đức) Độ tinh DNA kiểm tra cách đo mật độ quang (OD) bước sóng 260 nm 280 nm máy quang phổ (Nanodrop 2000) Nồng độ DNA tổng số (ng/µl) ước lượng theo cơng thức: OD260 x 50 x độ pha lỗng 2.3 Đoạn mồi đoạn dị Bảng Trình tự đoạn mồi đoạn dị Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5'– 3') Nồng độ (nM) Mồi xi bị F AGTTAGAGATTGAGAGCCATATACTCTCC 200 Mồi ngược bị R TTGATAAGATCATTGTCAGTCATGTTG 200 Đoạn dò bò P FAM-TGGTGACATGCCGCAACTAGACACGBHQ1 100 1021 Tham khảo [4] Trình tự mồi (5'– 3') Ký hiệu mồi Nồng độ (nM) Mồi xuôi heo F CGAGAGGCTGCCGTAAAGG 300 Mồi ngược heo R TGCAAGGAACACGGCTAAGTG 300 Đoạn dò heo P HEX-TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG-BHQ2 150 Mồi xuôi trâu F TCTGGGGAGGATTCTCAGTAG 200 Mồi ngược trâu F AAGTGCTGCGATAATGAATGG 200 Đoạn dò trâu P ROX-AGCAACCCTCACCCGATTCTTCGC-BHQ1 100 Tham khảo [3] [8] 2.4 Quy trình multiplex realtime PCR Mỗi phản ứng gồm µl DNA, 20 µl PCR chứa mastermix, nồng độ mồi tối ưu hóa (Bảng 1) Sử dụng kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Cat.No 11730-017) Phản ứng realtime PCR thực máy Agilent Stratagene Mx 3005P Systems, 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ biến tính 950C/15 giây bắt cặp – kéo dài 600C/40 giây, quy trình nhiệt tối ưu hóa Tối ưu hóa phản ứng simplex để khẳng định nồng độ primer quy trình nhiệt thích hợp cho lồi điều kiện phịng thí nghiệm DNA lồi pha loãng bậc 10 từ mẫu gốc để chạy đường chuẩn Có hai thơng số thể tính ổn định đường chuẩn [7] Một hệ số tương quan R2, đánh giá độ xác thao tác lấy mẫu có thể tích mong muốn hay khơng Trị số R2 phải đạt (≥) 0,99 Điều có nghĩa đường biểu diễn chuẩn phải đạt mức tuyến tính cao Hai hiệu PCR gọi E% (PCR efficiency) PCR đạt hiệu lý tưởng sau chu kỳ cường độ huỳnh quang ống phản ứng phải tăng gấp đôi Hai ống phản ứng có số lượng DNA đích ban đầu cách hệ số pha lỗng A, hai đường biểu diễn khuếch đại cách n chu kỳ với cường độ huỳnh quang hai ống cách hệ số pha loãng A = 2n Hiệu PCR chấp nhận E% khoảng 90% đến 110% Với công thức E% = (E-1) x 100%; E = 10-1/slope, với slope độ dốc đường chuẩn, đường biểu diễn chuẩn lý tưởng độ dốc -3,32 Độ dốc phép dao động khoảng -3,58 đến -3,1 2.5 Độ đặc hiệu, độ nhạy Mẫu thịt bò đối chứng dương lấy từ bị ta vàng ni nước, bò Úc, Nhật,… Thịt trâu lấy từ trâu nước trâu Ấn Độ Thịt heo lấy từ giống heo ngoại lai thịt nhập Mẫu âm tính lấy từ lồi khác mẫu thịt cừu, dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan, chó, mèo, thỏ, chuột, tôm, cá tra, cá ngừ bột đậu nành Độ nhạy tỷ số số mẫu phát dương tính tổng số mẫu dương tính thật Độ đặc hiệu tỷ số số mẫu âm tổng số mẫu âm tính thật 2.6 Giới hạn phát (LOD) Để xác định giới hạn phát phương pháp, DNA tách chiết pha loãng bậc 10 với nồng độ giảm dần từ 10 ng/µl đến 0,0001 ng/µl Sau đó, chạy phản ứng multiplex realtime PCR để xác định nồng độ thấp phát DNA bò, trâu heo 2.7 Xử lý số liệu: Số liệu đƣợc xử lý Excel 1022 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA Tất 56 mẫu tách chiết DNA Nồng độ DNA thu từ 40,6 - 94,6 ng/µl tỷ số OD260/OD280 nằm khoảng 1,8 - 2,0 Như DNA tinh tốt, sẵn sàng sử dụng cho phản ứng realtime PCR 3.2 Quy trình multiplex realtime PCR Hệ số tương quan R2 DNA bò 0,992, heo 0,990, trâu 0,995 (Hình 1) Các hệ số tương quan hồn toàn phù hợp giới hạn (R2 ≥ 0,99) Như giá trị Ct điểm pha loãng bậc 10 có độ tuyến tính cao Thao tác pha lỗng mẫu, thao tác pipet hút lượng thể tích cần sử dụng Một tiêu chí khác để đánh giá phản ứng realtime PCR hiệu phản ứng PCR (E%) Giới hạn cho phép E% khoảng 90 - 110% Kết khảo sát cho thấy giá trị E% đạt phản ứng realtime PCR đa mồi từ 96,2 - 104,3% (Hình 1) nằm giới hạn cho phép Độ dốc (slope) từ -3,417 đến - 3,222 phù hợp với khoảng giới hạn cho phép (-3,58 đến -3,10) Hình Đường khuếch đại DNA bị (a), heo (b) trâu (c) Đường chuẩn bò, heo, trâu (d) 3.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu Độ đặc hiệu phản ứng đánh giá mẫu thịt loài mục tiêu loài khác Tổng số mẫu thực 56 mẫu Trong có mẫu bò, mẫu heo, mẫu trâu 30 mẫu 15 loài khác gồm cừu, dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan, chó, mèo, thỏ, chuột, tơm, cá tra, cá ngừ mẫu đậu nành Tín hiệu huỳnh quang màu FAM ghi nhận mẫu có nguồn gốc từ bị Những mẫu có nguồn gốc từ heo, trâu lồi khác khơng ghi nhận tín hiệu màu FAM bị Tương tự, màu HEX ghi nhận mẫu có nguồn gốc từ heo màu ROX ghi nhận mẫu có nguồn gốc từ trâu Các mẫu bò, heo, trâu phát phản ứng multiplex realtime khơng có phản ứng chéo loài khác Độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng đạt 100% bò, heo trâu 1023 3.4 Giới hạn phát DNA Giá trị Ct độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation: RSD) thể Bảng Giá trị RSD biến thiên thấp cho thấy phản ứng multiplex realtime PCR có tính ổn định cao nồng độ DNA khác lần chạy kiểm tra khác Tại nồng độ 0,005 ng/µl, giá trị Ct trung bình mẫu DNA bị 36,72 ± 0,240 Ct mẫu heo trâu nồng độ 37,75 ± 0,125 37,71 ± 0,100 Ở nồng độ pha lỗng sau cho kết âm tính với ba lồi khơng ghi nhận tín hiệu huỳnh quang, RSD tất nồng độ pha lỗng có giá trị nhỏ 1,0 (0,08 – 0,886) Như giới hạn phát DNA quy trình 0,005 ng/phản ứng Theo Koppel ctv [4], giới hạn phát DNA hỗn hợp sữa bò, trứng gà, hạt vừng, hạt hạnh nhân 0,0032 ng DNA/phản ứng (nền mẫu DNA tinh dịch cá trích), 0,32 ng DNA thịt heo [3], 0,32 ng DNA thịt trâu thịt bị (nền mẫu DNA tinh dịch cá trích) [8] Bảng Giá trị Ct pha loãng bậc 10 DNA thịt bò, heo, trâu DNA Bò Heo Trâu (ng) Trung bình SD RSD Trung bình SD RSD Trung bình SD RSD 50 22,30 0,155 0,695 23,58 0,204 0,858 23,65 0,045 0,191 26,23 0,197 0,750 27,59 0,243 0,871 27,21 0,241 0,886 0,5 29,85 0,046 0,155 31,21 0,102 0,326 30,93 0,052 0,168 0,05 33,32 0,205 0,615 33,96 0,029 0,085 34,12 0,095 0,279 0,005 36,72 0,240 0,654 37,84 0,125 0,331 37,71 0,100 0,265 0,0005 - - - 3.5 Ứng dụng giới hạn phát hỗn hợp thịt tƣơi thịt xử lý nhiệt Trong thí nghiệm này, thịt gà sử dụng làm mẫu để thêm loại thịt bị, heo, trâu tạo thành hỗn hợp có tỷ lệ khác nhau, giảm dần từ 32,0% đến 0,1% Sở dĩ chọn tỷ lệ phối trộn thấp 0,1% gian lận thương mại mức tỷ lệ không đem lại hiệu kinh tế, giá thành sản phẩm giảm không đáng kể Hỗn hợp thịt tươi chia thành phần thịt tươi, thịt xử lý 15 phút 800C 1200C Kết trình bày Bảng cho thấy khơng có chênh lệch nhiều giá trị Ct mẫu xử lý nhiệt mẫu thịt tươi Và tỷ lệ 0,1% khối lượng, giá trị Ct mẫu thịt tươi thịt xử lý nhiệt nằm khoảng 29,02 đến 34,61 Như bò, heo, trâu phát mức 0,1% khối lượng hỗn hợp thịt tươi thịt xử lý nhiệt Bảng Giá trị Ct hỗn hợp thịt tươi thịt xử lý nhiệt Bò Heo Trâu Tỷ lệ (%) Thịt tươi 800C /15' 1210C /15' Thịt tươi 800C /15' 1210C /15' Thịt tươi 800C /15' 1210C /15' 32 20,10 21,30 21,59 22,83 22,51 22,45 19,98 20,33 19,56 10 21,61 23,59 22,88 24,86 24,44 23,60 22,20 22,68 21,85 3,2 23,48 24,99 24,77 26,93 27,13 26,53 23,74 24,29 22,98 25,45 27,68 26,91 29,44 29,49 28,83 25,50 27,30 23,51 0,32 27,4 29,13 29,38 32,71 31,01 30,99 26,92 27,89 25,72 0,1 29,02 31,25 31,60 34,32 33,96 34,61 28,99 30,13 29,11 1024 3.6 Ứng dụng kiểm tra số mẫu thịt chế biến lƣu hành thị trƣờng 3.6.1 Mẫu xúc xích Trong 12 mẫu kiểm tra, tất phát thành phần heo cơng bố bao bì nhà sản xuất (Bảng 4) Tuy nhiên, thịt trâu phát tất mẫu cơng ty A B Đó thành phần thịt mà công ty không cơng bố nhãn sản phẩm Thịt trâu thêm để tăng giá trị dinh dưỡng hương vị sản phẩm Mặt khác, giá trị kinh tế trâu thấp bò Cho nên việc thêm thịt trâu vào xúc xích bị xúc xích bị heo để giảm giá thành sản xuất, tăng lợi nhuận 3.6.2 Mẫu bò viên Thịt viên sau xay nhỏ, chế biến, tẩm ướp gia vị khó nhận biết thành phần cảm quan Mười hai (12) mẫu bị viên từ 06 cơng ty chọn kiểm tra Kết Bảng cho thấy tất 12 mẫu phát thịt bò sản phẩm Tuy nhiên, hai mẫu bị viên cơng ty A phát thêm thịt trâu Đối với công ty B, heo trâu khơng có nhãn phát multiplex realtime PCR Tương tự, mẫu công ty D E phát thịt trâu sản phẩm Như vậy, có 04 12 mẫu thành phần bị, heo cơng bố nhãn sản phẩm Hai số 12 mẫu (16,67%) diện thêm thịt heo mà không ghi nhãn; có 08 12 mẫu (66,67%) thêm thịt trâu vào sản phẩm bò viên Bảng Kết kiểm tra mẫu xúc xích 1025 X TP nhãn Bò Heo Trâu A heo, gà - 21,35 19,63 A bị, heo 21,31 22,79 18,47 A heo, tơm - 17,71 16,56 A heo, tôm - 17,36 17,82 B gà, heo, ĐN - 23,32 20,46 B gà, heo, ĐN - 19,24 21,51 B bò, heo, gà 24,05 26,68 20,97 B bò, heo, gà 22,85 21,62 20,76 C heo, gà - 19,33 - C heo, gà, ĐN - 20,04 - C bò, heo, gà, cá 18,33 22,17 - C bò, heo, cá 19,01 23,08 - Bảng Kết kiểm tra mẫu bò viên X TP nhãn Bò Heo Trâu A bò, cá basa 20,33 - 18,48 A bò, cá basa 17,95 - 16,51 B bò, đậu nành 23,15 22,36 18,99 B bò, đậu nành 22,15 19,38 18,72 C bò, cá, gà 22,1 - - C bò, cá, gà 23,46 - - D bò, mỡ heo 20,06 24,36 17,75 D bò, mỡ heo 17,44 19,16 16,36 E bò, heo, gà 21,16 20,03 18,91 E bò, heo, gà 20,59 20,57 19,05 F bò, thịt heo 20,16 22,03 - F bò, thịt heo 21,08 22,78 - Ghi chú: X = Cty, ĐN = đậu nành KẾT LUẬN Đã tối ưu hóa quy trình multiplex realtime PCR phân biệt thịt bị, trâu, heo với độ đặc hiệu độ tin cậy cao, giới hạn phát thịt tươi (bò, trâu, heo) thịt xử lý nhiệt (80-1200C/15 phút) 0,1% theo khối lượng hỗn hợp 0,005 ng DNA/phản ứng Ứng dụng multiplex realtime PCR để phát số sản phẩm thịt chế biến thị trường cho thấy có vấn đề gian lận giả thịt bò từ thịt heo thịt trâu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ayaz Y, Ayaz N and Erol I (2006) Detection of species in meat and meat products using enzymelinked immunosorbent assay Journal of Muscle Foods 17: 214-220 [2] Đoàn Thị Tuyết Lê Nguyễn Ngọc Tuân (2011) Phân biệt thịt trâu bò kỹ thuật PCR Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số trang 71-77 [3] Koppel R, Ruf J, Zimmerli F, Breitenmoser A (2008) Multiplex realtime PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, chicken and turkey European Food Reseach and Technology 227: 1199-1203 [4] Koppel R, Ruf J, Rentsch J (2010) Multiplex realtime PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, horse and sheep European Food Research and Technology 232: 151-155 [5] Matsunaga T, Chikuni K, Tanae R, Muroya S, Shibata K, Yamad J, Shinmura Y (1999) A quick and simple method for the identification of meat species and meat product by PCR assay Meat Science 51:143-148 [6] Nguyễn Ngọc Tuân (1998) Thay đậu nành ly trích 82% protein bột đậu nành Việt Nam chế biến xúc xích cá Tập san KHKT Nơng Lâm Nghiệp, số 12, trang 89-90 1026 [7] Phạm Hùng Vân (2009) PCR realtime PCR, Các vấn đề ứng dụng thường gặp Nhà xuất Y học, TP Hồ Chí Minh, 34-70 [8] Rentsch J, Weibel S, Ruf J, Eugster A, Beck K & Koppel R (2013) Interlaboratory validation of two multiplex quantitative realtime PCR methods to determine species DNA of cow, sheep and goat as a measure of milk proportions in cheese European Food Research and Technology 236: 217227 [9] Trung tâm tin tức VTV24 (2016) http://vtv.vn/chuyen-dong-24h/khong-tim-thay-ADN-cua- botrong-2-mau-bo-vien-cua-viet-sin-20160712193338002.htm [10] Ulca P, Balta H, Cagin I and Senyuva H Z (2013) Meat species identification and Halal authentication using PCR analysis of raw and cooked traditional Turkish foods Meat Science 94: 280-284 1027 ... quy trình multiplex realtime PCR phân biệt thịt bò, trâu, heo với độ đặc hiệu độ tin cậy cao, giới hạn phát thịt tươi (bò, trâu, heo) thịt xử lý nhiệt (80-1200C/15 phút) 0,1% theo khối lượng hỗn... DNA-RAPD, PCR đặc trưng cho lồi Theo số cơng trình cơng bố Matsunaga ctv [5] sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát sáu loại thịt bò -heo- cừudê-ngựa-gà từ hỗn hợp thịt tươi thịt chế biến phân biệt thịt. .. 16,36 E bò, heo, gà 21,16 20,03 18,91 E bò, heo, gà 20,59 20,57 19,05 F bò, thịt heo 20,16 22,03 - F bò, thịt heo 21,08 22,78 - Ghi chú: X = Cty, ĐN = đậu nành KẾT LUẬN Đã tối ưu hóa quy trình multiplex