Virus cúm A và human Metapneumovirus (hMPV) là hai trong số các virus gây ra bệnh nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến nhất. Bệnh do 2 loại virus này có triệu chứng tương tự nhau như ho, hắt hơi, sốt cao kéo dài, mệt mỏi, thường không gây nguy hiểm nhưng trong một số trường hợp phát hiện và điều trị muộn vẫn có thể gây tử vong ở người, như virus cúm A/H5. Chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục đích xây dựng quy trình chẩn đoán đồng thời hai loại virus nói trên trong cùng một phản ứng PCR.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VIRUS CÚM A VÀ HUMAN METAPNEUMOVIRUS (hMPV) TRÊN MẪU PHẾT Ở HỌNG MŨI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX RT-PCR Nguyễn Đại Thức*, Dương Ngọc Anh Trang**, Nguyễn Ngọc Tấn**, Nguyễn Thu Ngọc*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Virus cúm A human Metapneumovirus (hMPV) hai số virus gây bệnh nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến Bệnh loại virus có triệu chứng tương tự ho, hắt hơi, sốt cao kéo dài, mệt mỏi, thường không gây nguy hiểm số trường hợp phát điều trị muộn gây tử vong người, virus cúm A/H5 Chúng thực đề tài nhằm mục đích xây dựng quy trình chẩn đốn đồng thời hai loại virus nói phản ứng PCR Phương pháp: Khảo sát hoạt động primer phản ứng RT – PCR làm tiền đề xây dựng tối ưu hóa quy trình multiplex RT - PCR phát đồng thời virus cúm A hMPV từ dịch phết họng mũi bệnh nhân Khảo sát mẫu dịch phết họng mũi lâm sàng bệnh nhân ghi ngờ nhiễm bệnh Kết quả: Chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu hệ primer 55oC; nồng độ tối ưu hệ primer cho virus cúm A hMPV 0,48 µM 0,56 µM Sự đặc hiệu hệ primer khẳng định kết phản ứng PCR cho kết dương tính với RNA khn mẫu hai virus nói âm tính với virus cúm B, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV) gây bệnh đường hô hấp có triệu chứng tương tự hai loại virus mục tiêu Quy trình multiplex RT - PCR có độ đặc hiệu cao độ nhạy đạt 0,002 pg/µl Kết kiểm tra thực nghiệm 14 mẫu thu từ bệnh nhân cho thấy có mẫu phết họng-mũi cho kết dương tính với virus cúm A, mẫu phết họng-mũi dương tính với virus hMPV, chưa phát thấy mẫu đồng nhiễm hai loại virus Kết luận: Đã xây dựng tối ưu hóa thành cơng quy trình multiplex RT-PCR phát đồng thời hai loại virus hơ hấp lưu hành Từ khóa: virus cúm A, human metapneumovirus (hMPV) ABSTRACT DETECTION INFLUENZA A VIRUS AND HUMAN PNEUMOVIRUS (hMPV) ON NASOPHARYNGEAL SPECIMEN BY USING MUTIPLEX RT-PCR Nguyen Dai Thuc,Duong Ngoc Anh Trang, Nguyen Ngoc Tan, Nguyen Thu Ngoc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 251 – 258 Background: Influenza A virus and human Metapneumovirus (hMPV) are two of the most common acute respiratory infections Diseases caused by these two viruses have similar symptoms such as coughing, sneezing, prolonged high fever, fatigue, in most case, they not cause serious illness but sometime ca cause death, such as influenza A/H5 virus We carried out this project with the aim of building a concurrent diagnostic procedure for the two viruses mentioned in the same PCR reaction Methods: Investigation of primers activity on RT-PCR reaction is a premise to build and optimize multiplex RT - PCR process to simultaneously detect influenza A virus and hMPV from patient's nasal throat swab Experimental results on 14 samples from patients showed that clinical specimens tested positive for influenza A virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected specimens were found *Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Đại Thức **Đại học Nông Lâm ***Viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh ĐT: 0916347616 Email: nguyendaithuctb@gmail.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 251 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Results: In order to determine the PCR conditions, the results showed that the optimal pairing temperature of the primer set was at 55°C; the optimal primers concentration of influenza A virus and hMPV were 0.48 µM and 0.56 µM, respectively Specificity of the primer system was confirmed when the PCR results were positive for the RNA template of the two viruses while negative for the other viruses, which also causes respiratory illnesses with similar symptoms to the two target viruses, such as influenza B virus, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV) The multiplex RT - PCR has high specificity and sensitivity at 0.002 pg/µl Experimental results on 14 samples from patients showed that clinical specimens tested positive for influenza A virus and only one clinical specimen tested positive for hMPV, no co - infected specimens were found Conclusion: Successfully developed and optimized multiplex RT-PCR process for simultaneous detection of two circulating respiratory viruses Keywords: influenza A virus, human metapneumovirus (hMPV) dịch phết họng - mũi nghi ngờ nhiễm virus cúm ĐẶT VẤN ĐỀ A hMPV bệnh viện Nhi Đồng Bệnh Virus cúm A human Metapneumovirus viện Bệnh Nhiệt Đới gửi đến (hMPV) hai số virus gây bệnh Sử dụng đối chứng dương virus cúm A nhiễm trùng cấp tính đường hô hấp phổ biến hMPV mẫu đối chứng âm mẫu người(2,3) Virus cúm A dễ lây lan thành dương tính Adeno virus, virus cúm B, RSV, dịch nên sau thu mẫu từ bệnh nhân bị nghi Rhino virus, PIV 1, 2, Trung tâm cúm Quốc ngờ nhiễm virus hô hấp, cúm A dương tính gia cung cấp Primer sử dụng có trình tự Tổ khơng kiểm tra tiếp virus hMPV Như chức Y tế Thế giới (WHO) cơng bố tổng hợp bỏ sót trường hợp mẫu đồng nhiễm hai công ty Intergrated DNA Technology loại virus Mặc dù phương pháp qRT - PCR (IDT)(5,7) có khả phát virus khoảng thời Phương pháp nghiên cứu gian ngắn sinh phẩm hóa chất đắt tiền khó khăn việc thiết kế phản ứng Tách chiết RNA phát đồng thời virus Sử dụng kít QIAamp Viral RNA Mini phản ứng, dẫn đến việc âm tính giả hãng QIAGEN - Mỹ Thực tách chiết mẫu hai loại virus có đồng nhiễm Từ dịch phết họng, mũi theo hướng dẫn đính hạn chế “Phát đồng thời virus cúm A kèm(5,6) human Metapneumovirus (hMPV) mẫu Kiểm tra primer phần mềm bệnh phẩm người kỹ thuật multiplex RTSử dụng phần mềm sinh tin học kiểm tra PCR” thực nhằm xây dựng kỹ thuật thơng số đặc tính vật lý cặp multiplex RT-PCR tảng kỹ thuật primer sử dụng (Bảng 1, 2) RT-PCR đơn để hỗ trợ cơng tác chẩn đốn Kiểm tra primer mặt thực nghiệm: phản ứng điều trị RT-PCR đơn Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu quy trình multiplex RT-PCR phát đồng thời virus cúm A hMPV từ dịch phết họng-mũi bệnh nhân ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang với phương pháp chọn mẫu thuận tiện thực 14 mẫu 252 Thành phần phản ứng RT - PCR với tổng thể tích 22,5 µl, đó: Nước khơng chứa RNase: 13,6 µl; RT - PCR Buffer 5X:5 µl; Primer F primer R: 2,4 µl; dNTPs: 0,5 µl ; Enzyme: µl RNA mẫu: 2,5 µl(4) Điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 2% 150V- 50 phút, quan sát kết tia UV máy chụp gel (UVP)(4,6) Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng Trình tự primer phát virus cúm A Tên primer A/M30F A/M264R2 Gen đích Trình tự 5’ - TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG - 3’ 5’ - ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG - 3’ M1, M2 Vị trí bắt cặp 18 - 37 230 - 249 Sản phẩm PCR (bp) Vị trí bắt cặp - 21 521 - 539 Sản phẩm PCR (bp) 232 bp A/M30F: primer xuôi A/M264R2: primer ngược (WHO - SOP 2008) Bảng Trình tự primer phát hMPV Tên primer MPV/M1a MPV/M2 Gen đích M Trình tự 5’ - GGA GTC CTA CCT AGT AGA C - 3’ 5’ - GCA GCT TCA ACA GTA GCT G - 3’ 537 bp MPV/M1a: primer xuôi MPV/M2: primer ngược (WHO - SOP 2008) Khảo sát hoạt động primer đơn Thực phản ứng RT - PCR đơn nhằm kiểm tra hoạt động primer với RNA hai mẫu đối chứng (+) đại diện cho hai cặp primer virus cúm A hMPV Điện di sản phẩm RT – PCR tích kết chọn nồng độ primer tối ưu cho trình Khảo sát độ đặc hiệu hệ primer Khảo sát nhiệt độ bắt cặp primer đơn Nhằm kiểm tra bắt cặp đặc hiệu hệ primer khảo sát với virus khác Sử dụng virus cúm B, Adeno virus, RSV, Rhino virus, PIV 1, 2, đối chứng âm Bảng Thí nghiệm nhiệt độ bắt cặp phản ứng RT – PCR Khảo sát giới hạn phát phản ứng multiplex RT - PCR phát virus cúm A hMPV Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Phản ứng phiên mã 50 ngược Hoạt hóa phản ứng 94 PCR Biến tính 94 Bắt cặp 50, 53, 55, 57, 60 Kéo dài 72 Hậu kéo dài 72 30 phút 15 phút 30 giây 30 giây phút 10 phút Trộn lẫn RNA tổng số virus cúm A hMPV theo tỷ lệ 1:1, pha loãng thành độ pha loãng cách 10 lần, nồng độ RNA tổng số ban đầu 10-1 Ghi nhận nồng độ RNA thấp mà hai loại virus cho kết dương tính 40 Khảo sát hoạt động hệ primer Tiến hành phản ứng multiplex RT - PCR với mẫu RNA đối chứng dương (theo tỷ lệ 1:1) Điện di sản phẩm RT - PCR nhằm kiểm tra kích thước vạch sẵn Khảo sát nồng độ hệ primer Khảo sát nồng độ từ 0,36 µM đến 0,56 µM Thu sản phẩm RT - PCR, tiến hành điện di, phân KẾT QUẢ Kiểm tra phù hợp primer phần mềm sinh tin học Kết khảo sát điều kiện phản ứng multiplex RT - PCR Kết khảo sát khả hoạt động primer đơn (Bảng 4) Sản phẩm RT - PCR đơn cho thấy hai giếng chứa RNA virus A hMPV xuất vạch kích thước dự đoán, là: 232 bp 537 bp, khơng xuất vạch sản phẩm phụ (Hình 1) Bảng Các đặc tính hệ primer Oligonucleotide % GC Tm (oC) ΔG Hairpin (kcal/mole) A/ M30F A/ M264R2 MPV/ M1a MPV/ M2 50 55 52,6 52,6 54,5 58,1 52,6 53,9 -1,3 -3,97 -1,04 -2,98 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ΔG Hetero - Dimer (kcal/ mole) ΔG Seft Dimer (kcal/mole) A/ M30F A/ M264R2 MPV/M1a MPV/ M2 -6,76 -4,95 -6,01 -3,52 -10,24 -4,95 -6,82 -9,83 -4,64 -6,01 -6,82 -3,9 -8,29 -3,52 -9,83 -3,9 - 253 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp primer đơn M Khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho cặp primer dãy nhiệt độ 50-60oC Chọn nhiệt độ 55oC cho vạch sản phẩm có cường độ sáng, rõ, khơng có vạch sản phẩm phụ hai loại virus (Hình 2) 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp Kết khảo sát khả hoạt động hệ primer Phản ứng multiplex RT - PCR sử dụng đồng thời hai cặp primer với mẫu RNA hai loại virus trộn theo tỷ lệ 1:1 Kết điện di cho kích thước sản phẩm giếng chứa mẫu trộn lẫn virus cúm A hMPV xuất hiên đồng thời vạch sản phẩm có kích thước tương tự mẫu RNA loại virus (Hình 3) Hình Kết điện di RT - PCR đơn (1)-(2) đối chứng âm virus cúm A, hMPV; (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A,hMPV; (M) thang chuẩn 100 bp hMPV Virus cúm A M 50 53 55 57 60 50 53 55 57 60 (oC) 500 bp 537 bp 232 bp Hình Kết điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp primer (M) thang chuẩn 100 bp;(-) đối chứng âm RT-PCR M 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp Hình Kết điện di multiplex RT – PCR (1)-(2) đối chứng âm; (3)-(4) RNA tách chiết từ virus cúm A, hMPV; (5) multiplex RT-PCR; (M) thang chuẩn 100 bp 254 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Kết khảo sát nồng độ hệ primer Bảng Các giá trị nồng độ hệ primer (µM) Primer Nồng độ primer (µM) Virus cúm A 0,36 0,36 0,36 0,48 0,48 0,48 0,56 0,56 0,56 hMPV 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56 0,36 0,48 0,56 M (-) 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp 11 Hình Kết điện di khảo sát nồng độ primer Từ (1) đến (9) multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA tách chiết từ hai virus cúm A hMVP có nồng độ hệ primer thay đổi; (-): đối chứng âm multiplex RT - PCR; (M): thang chuẩn 100 bp Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ primer M 537 bp 400 bp 232 bp Hình Kết điện di khảo sát độ đặc hiệu (1): multiplex RT - PCR với hai nguồn RNA virus cúm A hMPV; (2) đối chứng âm multiplex RT - PCR; (3)-(9) multiplex RT - PCR với RNA virus khác; (M): thang chuẩn 100 bp Kết khảo sát giới hạn phát phản ứng 10-1 10-2 10-3 10-4 (- ) 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 537 500 232 200 Hình Kết điện di khảo sát giới hạn phát phản ứng theo nồng độ RNA giảm dần Các giếng chứa RNA tách chiết từ hai nguồn RNA từ virus cúm A hMPV theo nồng độ mẫu giảm dần; (-) đối chứng; (M) thang chuẩn 100 bp Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 255 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học multiplex RT - PCR 14 mẫu phết họngmũi, tiến hành thực phản ứng qRT - PCR Kết trình bày Hình Bảng cho virus cúm A Pha loãng bậc 10 liên tiếp thành nhiều nồng độ khác Nồng độ đối chứng dương ban -1 đầu 10 pha loãng 10 lần nồng độ -10 cuối 10 (Hình 6) Kết phản ứng chẩn đốn phát virus cúm A hMPV 14 mẫu phết họng-mũi xác quy trình multiplex RT-PCR phát đồng thời virus cúm A hMPV thiết kế tối ưu thành công điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR kết xét nghiệm tin cậy Kết khảo sát mẫu phết họng - mũi Kiểm tra 14 mẫu dịch phết họng-mũi, thu kết quả: mẫu dương tính với virus cúm A (chiếm 21,4%), mẫu dương tính với hMPV (chiếm 7,14%) chưa phát mẫu đồng nhiễm (Hình 7) Kết phản ứng qRT - PCR mẫu phết họng-mũ Để khẳng định kết phản ứng 10 11 12 13 14 15 M 537 bp 500 bp 232 bp 200 bp Hình Kết điện di khảo sát mẫu phết họng-mũi (-) đối chứng âm; (1)-(14) mẫu phết họng-mũi; (15) đối chứng dương; (M) thang chuẩn 100 bp Bảng So sánh kết phản ứng multiplex RT - PCR qRT - PCR Mẫu Đối chứng âm Đối chứng dương 10 11 12 13 14 Virus cúm A Mutiplex RT – PCR (Ct) 30,82 29,67 36,84 33,57 qRT - PCR + + + + hMPV Mutiplex RT – PCR (Ct) 29,00 31,45 - qRT - PCR + + - (-): âm tính; (+): dương tính 256 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Chứng dương virus cúm A Chứng dương hMPV Hình Đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang chẩn đoán virus cúm A hMPV tương tự trộn lẫn RNA tách chiết từ nguồn BÀN LUẬN virus (Hình 1, 3) Đánh giá khả hoạt động hệ primer Cả hai cặp primer có biên độ nhiệt phần mềm sinh tin học hoạt động rộng Tuy nhiên, nhiệt độ Cả hai cặp primer đạt yêu cầu o 55 C cho vạch sản phẩm có cường độ sáng chiều dài Nhiệt độ biến tính hai cặp primer rõ nhất; nhiệt độ cao hơn, kết không chênh lệch giới hạn cho phép, đảm bảo có thay đổi nhiệt độ bắt cặp tối ưu hai cho nhân primer thành công điều kiện nhiệt độ Thành phần % GC, nằm khoảng giới hạn cho phép Sự hình thành cấu trúc thứ cấp, ∆G cấu trúc thứ cấp mức cho phép Vì vậy, phương diện lý thuyết, hai cặp primer sử dụng để phát hai lồi virus nhân trình tự đích có độ đặc hiệu cao, có tạo thành cấu trúc thứ cấp giá trị ∆G cấu trúc thứ cấp primer dao động khơng đáng kể Do đó, hai cặp primer trộn chung phản ứng multiplex RT – PCR (Bảng 4) Đánh giá mặt thực nghiệm Kết điện di khảo sát hoạt động primer tạo sản phẩm RT-PCR: 232 bp ứng với virus cúm A 537 bp ứng với hMPV, vạch sản phẩm nhất, không xuất vạch sản phẩm phụ tạo sản phẩm có kích thước Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học o cặp primer 55 C Chọn nồng độ primer virus cúm A hMPV, 0,48 µM - 0,56 µM cho vạch sản phẩm đậm, rõ nét khơng tạo sản phẩm phụ (Hình 4) Cặp primer nghiên cứu có độ đặc hiệu cao: khơng cho vạch sản phẩm chứng tỏ hệ primer bắt cặp đặc hiệu, khơng cho kết dương tính với loại virus khác (Hình 5) Pha lỗng nồng độ RNA để xác định độ nhạy: Phản ứng multiplex RT – PCR cho vạch sản phẩm nồng độ RNA mẫu 10-7 Đo hàm lượng mẫu RNA nồng độ 10-1 đạt ng/µl Như ngưỡng phát phản ứng multiplex RT - PCR nàylà 0,002 pg/µl (Hình 6) KẾTLUẬN Các thơng số đặc tính vật lý hệ primer 257 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 thỏa mãn yêu cầu phương diện phần mềm sinh tin học hoạt động tốt khảo sát mẫu đối chứng dương TÀI LIỆU THAM KHẢO Xây dựng quy trình multiplex RTPCR phát đồng thời hai loại virus lưu hành, ngưỡng phát phản ứng 0,002 pg/µl Trên 14 dịch phết họng mũi lâm sàng, phát 3/14 mẫu dương tính với virus cúm A (chiếm 21,4%), 1/14 mẫu dương tính với hMPV (chiếm 7,14%) chưa phát mẫu đồng nhiễm với hai loại virus nói Các mẫu dương tính phản ứng kiểm tra kỹ thuật qRT - PCR cho thấy 100% kết phù hợp 258 Bellau-Pujol S, Vabret A, Legrand L, et al (2005) Development of three multiplex RT-PCR assays for the detection of 12 respiratory RNA viruses J Virol Methods, 126(1-2):53-63 Bouvier NM and Palese P (2008) The Biology of Influenza Viruses Vaccine, 26(4):D49 - D53 Đặng Đức Anh, Phan Thị Ngà Vũ Thị Quế Hương (2010) Virus y học Nhà xuất Y Học Hà Nội, pp.28 - 45 Lê Duy Thành (2009) Cơ sở sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục TP Hồ Chí Minh, pp.134 - 153 QIAGEN (2010) QIAamp Viral RNA Mini Handbook, rd edition URL: HB-0354004_1112868_HB_QA_Viral_RNA_Mini_0318_WW.PDF QIAGEN (2010) QIAGEN Onestep RT-PCR Kit Handbook URL: HB-0660-002%201101184_LL_RTPCR_OneStep_RTPCR_0316_WW_WEB.pdf WHO (2017) Influenza URL: https://www.who.int/influenza/ Ngày nhận báo: 30/07/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/08/2019 Ngày báo đăng: 10/10/2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... target viruses, such as influenza B virus, Respiratory syncytial virus (RSV), Adeno virus, Rhino virus, Parainfluenza virus (PIV) The multiplex RT - PCR has high specificity and sensitivity at... developed and optimized multiplex RT-PCR process for simultaneous detection of two circulating respiratory viruses Keywords: influenza A virus, human metapneumovirus (hMPV) dịch phết họng - mũi nghi... ngờ nhiễm virus cúm ĐẶT VẤN ĐỀ A hMPV bệnh viện Nhi Đồng Bệnh Virus cúm A human Metapneumovirus viện Bệnh Nhiệt Đới gửi đến (hMPV) hai số virus gây bệnh Sử dụng đối chứng dương virus cúm A nhiễm