nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gene e6 và e7 của human papilomavirus type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật multiplex rt-pcr

55 Hình 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp... 58 Bảng 3.10: Kết quả k

TRẦN MINH ĐỊNH

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE

E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO

BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT

MULTIPLEX RT-PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

TRẦN MINH ĐỊNH

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE

E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO

BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT

MULTIPLEX RT-PCR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Phương Khanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Người cam ñoan

Trần Minh Định

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu

sắc tới:

Lãnh ñạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng

ñã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học

TS Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận

PGS TS Nguyễn Anh Dũng ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận

Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận

Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; ñã luôn quan tâm, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực hiện khoa luận Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhiệt tình và có những trao ñổi quý báu trong quá trình thực hiện ñề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á ñã cung cấp chủng vi sinh vật tham khảo Cô Giang (phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng), anh Nguyện (phòng khám ña khoa Hồng Đức), bạn Việt (Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh), Cô Oanh (BS sản khoa, phòng khám số 120

Hồ Tùng Mậu) và các anh chị tại phòng xét nghiệm Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh, phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu, phòng khám số 46 Phan Chu Trinh, phòng khám ña khoa Hồng Đức ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu dịch phết cổ tử cung

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn

Buôn Ma Thuột, ngày tháng năm 2011

Tác giả

Trần Minh Định

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học 2

4 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Định nghĩa ung thư cổ tử cung 3

1.2 Tác nhân gây ung thư cổ tử cung 4

1.21 Tác nhân 4

1.2.2 Các type của Human papillomavirus 4

1.2.3 Bộ gen của virus HPV type 16 5

1.2.4 Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV nguy cơ cao vào bộ gen người 6

1.2.5 Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen người hiện nay 9

1.3 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 11

1.3.1 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới 11

1.3.2 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam 12

1.4 Các phương pháp phổ biến chuẩn đốn ung thư cổ tử cung hiện nay 13

1.4.1 Chẩn đốn lâm sàng 13

1.4.2 Các phương pháp chẩn đốn dựa trên tế bào cổ tử cung 14

1.4.3 Các phương pháp chuẩn đốn tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung 15

1.5 Phương pháp RT – PCR trong chuẩn đốn gắn chèn gen gây ung thư cổ tử cung 19

1.6 Các phương pháp điều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung 20

1.6.1 Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 20

1.6.2 Điều trị ung thư cổ tử cung 21

1.7 Các loại vaccine phòng HPV hiện nay 21

Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nội dung nghiên cứu 23

2.2 Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23

2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu 23

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 23

2.3 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 23

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.3.2 Hoá chất nghiên cứu 25

2.3.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 27

2.3.3.1 Dụng cụ nghiên cứu 27

2.3.3.2 Thiết bị nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi 28

2.4.1.1 Thiết kế và kiểm tra mồi 28

2.4.1.2 Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 30

2.4.1.3 Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 30

2.4.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm 31

2.4.3 Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số 31

2.4.4 Phương pháp kiểm soát nội phản ứng 32

2.4.5 Phương pháp multiplex RT – PCR 33

2.4.5.1 Phản ứng RT 33

2.4.5.2 Phản ứng multiplex PCR 33

2.4.6 Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR 34

2.4.7 Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 35

2.4.7.1 Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu nhận hoàn toàn RNA tổng số 35

2.4.7.2 Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 36

2.4.7.3 Khảo sát nồng ñộ mồi 36

2.4.7.4 Khảo sát nồng ñộ Mg2+ 39

2.4.7.5 Khảo sát nồng ñộ dNTP 39

2.4.7.6 Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 39

2.4.7.7 Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 40

2.4.9 Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột 40

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16 41

3.1.1 Thiết kế và kiểm tra mồi 41

3.1.2 Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44

3.1.3 Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 45

3.2 Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 47

3.2.1 Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết 47

3.2.2 Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 49

3.2.3 Khảo sát nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR 50

3.2.4 Khảo sát nồng ñộ Mg2+ 54

3.2.5 Khảo sát nồng ñộ dNTP 55

3.2.6 Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 56

3.2.7 Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 57

3.2.8 Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 58

3.3 Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột 60

Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

4.1 Kết luận 65

4.2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

giảm miễn dịch mắc phải ở người

BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công cụ tìm kiếm

các trình tự tương ñồng

CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tổn thương trong tế

bào biểu mô cổ tử cung

EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hội các

phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu

HPV Human Papilomavirus

IARC International Agenecy For Research on Cancer

NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung

tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học

PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng kéo dài chuỗi

RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase chain reaction

Taq Thermus aquaticus

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1: Sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư cổ tử

cung 3

Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 4

Hình 1.3: Cấu trúc bộ gene của Human papillomavirus type 16 5

Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type nguy cơ cao trong tế bào chủ 7

Hình 1.5: Sơ ñồ biểu diễn phân bố tỉ lệ ung thư cổ tử cung trên thế giới 10

Hình 1.6: Tế bào cổ tử cung bình thường và nghịch sản 13

Hình 2.1: Thang DNA 100bp 26

Hình 2.2: Sơ ñồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gene E6 và trên amplicon 31

Hình 3.1: Kết quả ñánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44

Hình 3.2: Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I 45

Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết 47

Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 47

Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng 48

Hình 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ 52

Hình 3.7: Kết quả khảo sát nồng ñộ dNTP 53

Hình 3.8: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình 54

Hình 3.9: Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 55

Hình 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột 61

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Tỷ lệ tiến triển của các giai ñoạn CIN sang ung thư cổ tử cung 9

Bảng 1.2: Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ưng thư cổ tử cung 19

Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm tham khảo sử sụng trong ñề tài 23

Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài 24

Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội 24

Bảng 2.4: Nồng ñộ của 2 cặp mồi khảo sát trong ñề tài 36

Bảng 3.1: Kết quả thiết kế mồi 41

Bảng 3.2: Đặc tính của hệ mồi thiết kế 42

Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế 42

Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế 42

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 48

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng 49

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình 54

Bảng 3.8: Sơ ñồ quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 56

Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene người 58

Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột 62

Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16

2 Xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

- Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết

- Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi

- Khảo sát nồng ñộ mồi

- Khảo sát nồng ñộ dNTP

- Khảo sát ñộ nhạy của quy trình

- Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình

3 Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột

2.2 Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa ñiểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa KHTN&CN, trường Đại học Tây Nguyên

- Phòng thí nghiệm CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 09/2010 tới tháng 08/2011

2.3 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

+ Mẫu chứng dương: 3 mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) là mẫu bệnh phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung ñã ñược xác ñịnh do HPV type 16 gây ra, ñược cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện Đa khoa Cần Thơ

+ 8 chủng vi sinh vật và 1 mẫu bệnh phẩm sử sụng trong ñề tài

Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm sử sụng trong ñề tài

ung thư cổ tử cung

Khoa Ung bướu, Bệnh viện

Công ty cổ phần công nghệ Việt Á, Tp Hồ Chí Minh

+ Mẫu chứng âm: nước cất

+ 86 mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma Thuột – Đăk Lăk

Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài

3 Phòng khám số 46 Phan Chu Trinh 2

+ Chứng nội: là yếu tố kiểm soát nội phản ứng nhằm kiểm chứng phản ứng

có diễn ra bình thường hay không Một ñoạn amplicon có kích thước 400bp ñược tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội, trình tự amplicon ñược thiết kế với 2 vị trí lỗi (mismatch) thể hiện qua bảng 2.3

2.3.2 Hoá chất nghiên cứu

+ Hóa chất dùng cho tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số

glycerol 5%, chỉnh về pH 4.0

- Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt ñối có chứa chất trợ tủa

Hóa chất ñược cung cấp từ Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á – Tp Hồ Chí Minh

+ Hóa chất dùng cho phân hủy DNA thu nhận RNA tổng số

Dnase I(hãng Fermentas)

+ Hoá chất dùng cho phản ứng multiplex RT – PCR

Phản ứng RT

Đề tài sử dụng bộ Kit cDNA synthesis KIT (VA.A 92-003B) của Công ty cổ phần công nghệ Việt Á

Phản ứng multiplex PCR

- Mồi xuôi và mồi ngược (tổng hợp từ Công ty IDT, Hoa Kỳ)

- dNTPs (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) 2mM mỗi loại (hãng Fermentas)

- Taq DNA polymerase 500 U (hãng Fermentas)

- Dung dịch ñệm 10X (hãng Fermentas)

- Nước cất 2 lần ñã loại bỏ enzym Dnase, Rnase

+ Hoá chất dùng cho ñiện di trên gel agarose

- Thang DNA 100 bp (hãng Fermentas)

Hình 2.1 Thang DNA 100bp

2.3.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

2.3.3.1 Dụng cụ nghiên cứu

- Micropipettes loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Axygen – Hoa Kỳ)

- Đầu tip thường, loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)

- Filter tip loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)

- Eppendorf 1.5ml (loại thường và loại Biopure), eppendorf 0.2ml nắp phẳng (hãng Greiner)

2.3.3.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy tính và các phần mềm chuyên dụng ñể thiết kế và ñánh giá mồi

- Máy Vortex (hãng IKA)

- Máy ly tâm lạnh tốc ñộ 13000 vòng/phút (hãng Hettich)

- Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng

- Tủ ñặt phản ứng PCR vô trùng

- Máy PCR (C1000 Thermal Cycler – hãng Biorad)

- Máy ủ nhiệt khô

- Nồi hấp khử trùng (hãng Study)

- Lò vi sóng

- Hệ thống ñiện di hãng (Biorad)

- GelDoc XR với phần mềm chuyên dụng kết nối máy tính (Biorad)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi

2.4.1.1 Thiết kế và kiểm tra mồi

2.4.1.1.1 Các phần mềm hỗ trợ thiết kế và kiểm tra mồi

- Clustal X 1.81 (EMBL, Châu Âu)

- Annhyb 4.922, năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)

- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ)

(http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/)

- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

2.4.1.1.2 Kỹ thuật thiết kế và kiểm tra mồi

Quy trình thiết kế và kiểm tra hệ mồi gồm 5 bước cơ bản sau:

- Bước 1: Thu thập các trình tự gen của gen E6 và E7 HPV type 16 từ ngân

- Bước 2: Sắp gióng các trình tự gen thu ñược bằng phần mềm Clustal, so sánh và xác ñịnh vùng bảo tồn của gen E6 và E7 từ các vùng bảo tồn thiết kế mồi phù hợp

- Bước 3: Tham khảo các cặp mồi ñã công bố trên các bài báo uy tín quốc tế hoặc thiết kế mới

- Bước 4: Sắp gióng các trình tự gen E6 và E7 với từng mồi xuôi, mồi ngược, ñánh giá mức ñộ tương ñồng của các trình tự trên bằng phần mềm clustal

- Bước 5: Phân tích và ñánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self – dimer, hetero – dimer, ñộ tương ñồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Oligo Analyzer Từ ñó, chọn cặp mồi thích hợp nhất ñể thực hiện phản ứng multiplex RT

- PCR

Sau khi thiết kế và kiểm tra, các cặp mồi ñạt tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sẽ ñược gửi tổng hợp nhân tạo tại Công ty IDT (Hoa Kỳ)

2.4.1.1.3 Một số tiêu chuẩn thiết kế và ñánh giá mồi

Trong giai ñoạn thiết kế mồi, qua tham khảo một số tài liệu về thiết kế mồi của Andrew Wallace (1996), Alkami Biosystems (1999) , một số tiêu chuẩn của mồi ñược rút ra như sau:

- Chiều dài của mồi tốt nhất nằm trong khoảng 18 – 25 cặp base

- Thành phần các nucleotide của mồi phải cân bằng Các mồi có hiệu quả khuếch ñại tốt nhất là những mồi có các base loại G, C tập trung thành nhóm và chiếm tỉ lệ khoảng từ 40% - 60% Ngoài ra, các base cuối ở ñầu 3’hay gần ñầu 3’ của các mồi này nên là G, C, GC hoặc CG

- Nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng lớn ñến khả năng bắt cặp của mồi với DNA bản mẫu Để ñạt hiệu quả nhân bản tốt

ñộ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược không ñược cách biệt quá xa, tối ña khoảng

50C

- Trong cấu trúc của mồi không ñược có những vùng trình tự có thể tự bắt cặp bổ sung với nhau vì những vùng này có thể hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop) chặt chẽ làm giảm hiệu quả nhân bản của mồi Ngoài ra, cần tránh chọn

những mồi có khả năng bắt cặp bổ sung chặt chẽ với nhau ở ñầu 3’ do ñiều này có thể dẫn tới việc tạo các mồi dimer, self-dimer (mồi bắt cặp với nhau), hetero-dimer (mồi này bắt cặp với mồi khác),… làm giảm hiệu suất của phản ứng PCR

- Mức năng lượng (∆G) hình thành nên các cấu trúc thứ cấp của các mồi phải

> -9 kcal/mol

- Khi tìm kiếm và so sánh các trình tự tương ñồng bằng công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), giá trị E (xác suất của tương ñồng xuất hiện không ngẫu nhiên) càng nhỏ thì mức ñộ tương ñồng càng cao; giá trị Score, chỉ số query coverage càng cao thì mức ñộ tương ñồng càng cao [8; 9]

2.4.1.2 Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế

Tiến hành tách chiết RNA của các mẫu chứng dương ñã xác ñịnh ung thư cổ

tử cung do HPV type 16 gây ra Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với chứng nội luôn ñược bổ sung trong mỗi phản ứng ở giai ñoạn PCR

Mồi hoạt ñộng bình thường sẽ có vạch của gen E6 và E7 như mong muốn.Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.4.1.3 Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại

type 16 gắn chèn vào bộ gen người, chúng tôi gửi sản phẩm PCR ñến công ty Macrogen (Hàn Quốc) ñể giải trình tự Sau khi giải trình tự, kết quả ñược kiểm tra thông qua phần mềm ClustalX 1.81 và so sánh với các trình tự chuẩn ñược công bố trên GenBank thông qua chương trình BLAST trên NCBI nhằm tìm kiếm trình tự tương ñồng với ñoạn trình tự nhân bản ñược

Kết quả có ñược từ sự so sánh bằng công cụ BLAST sẽ cho phép kết luận về tính ñặc hiệu của sản phẩm PCR thu ñược

2.4.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm

86 mẫu dịch phết cổ tử cung ñược các nhân viên y tế thu nhận từ các bệnh nhân tới khám sản tại các Phòng khám và Bệnh viện trên ñịa bàn thành phố Buôn

Ma Thuột Mẫu lựa ñược chọn là các mẫu có kết quả Pap nghi ngờ hoặc viêm nhiễm nặng và bệnh nhân 26 tuổi trở lên

Mẫu ñược bảo quản trong dung dịch TE1X và vận chuyển về phòng thí

2.4.3 Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số

Để tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số, sử dụng phương pháp tủa trong phenol/chloroform theo phương pháp của Chomczynski & Sacchi (1987) Quy trình tách chiết ñã ñược thương mại hóa và cung cấp từ Công ty CP Công nghệ Việt Á –

Tp Hồ Chí Minh, quy trình bao gồm các bước sau:

- Đánh dấu các eppendorf 1.5ml Bio-pure

- Hút tất cả các dung dịch ñều sử dụng ñầu tip có phin lọc

- Các mẫu bệnh phẩm ñược vortex kỹ Sau ñó, hút 200µl vào các eppendorf

vô trùng có chứa sẵn 900µl dung dịch 1 Vortex 30 giây, ñể yên 10 phút Thêm 200µl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn ñều, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút

- Cẩn thận hút 600µl dịch trong nổi có chứa RNA (tránh làm xáo trộn hai lớp) và một eppendorf bio-pure khác có chứa sẵn 600µl dung dịch 3 (trộn ñều trước khi sử dụng) Trộn ñều hỗn hợp, ñể yên 10 phút ở nhiệt ñộ lạnh, sau ñó ly tâm

13000 vòng/phút, 10 phút

- Hỗn hợp sau khi ly tâm ñược loại bỏ dịch nổi, thu cặn Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút

phút Sau ñó, thêm vào 50µl dung dịch DEPC

Nếu chưa thực hiện phản ứng RT, bảo quản mẫu ñã tách chiết ở -200C

2.4.4 Phương pháp kiểm soát nội phản ứng

Nhằm khẳng ñịnh trong mỗi phản ứng PCR không có hiện tượng ức chế, ñề tài tiến hành thiết kế và tổng hợp 1 ñoạn amplicon có kích thước 400 bp tại công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội (internal control) và luôn bổ sung trong mỗi

Nhằm tiết kiệm chi phí, ñề tài sử dụng mồi khuếch ñại gen E6 ñể khuếch ñại amplicon của chứng nội nhưng trên mạch khuôn của amplicon ñã tạo ra các ñiểm lỗi (mismatch) tại vị trí nucleotid thứ 3 tính từ ñầu 3’OH của vị trí mồi bắt cặp với mạch khuôn amplicon Việc tạo ra các ñiểm lỗi trên mạch khuôn của amplicon nhằm mục ñích mồi sẽ khuếch ñại gen E6 với hiệu suất cao hơn khuếch ñại amplicon

Như vậy, trong mỗi phản ứng sẽ luôn xuất hiện vạch của chứng nội có kích thước 400 bp nhằm chứng minh phản ứng PCR diễn ra bình thường, không có hiện tượng ức chế phản ứng và âm tính là âm tính thật

Hình 2.2 Sơ ñồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gen E6 và trên amplicon

A: vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gen E6 tạo sản phẩm có kích thước 287bp B: vị trí mismatch và gắn mồi E6f-E6r trên amplicon tạo sản phẩm có kích thước 400bp

2.4.5 Phương pháp multiplex RT – PCR

2.4.5.1 Phản ứng RT

- Phản ứng RT ñể phiên mã ngược RNA thành cDNA Thành phần 1 phản ứng 20µl bao gồm: 12.5µl dịch tách chiết RNA, 1µl enzym RT, 6.5 µl RT buffer Đậy nắp eppendorf thật kỹ, ñặt vào máy PCR

- Thao tác thực hiện trong ñiều kiện ñá ñang tan

- Cài ñặt chương trình luân nhiệt cho phản ứng RT:

2.4.5.2 Phản ứng multiplex PCR

- Thành phần cho một phản ứng 25µl bao gồm:

2.5µl dung dịch ñệm (buffer) 10X; 0.625 unit Taq DNA polymerase; 3.0 mM

dịch cDNA Thêm nước cất hai lần cho ñủ 25µl

- Thao tác thực hiện trong ñiều kiện ñá ñang tan

- Cài ñặt chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR:

2.4.6 Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR

2.4.6.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp ñiện di dựa vào ñặc tính cấu trúc của các nucleic acid tích ñiện âm nên dưới tác ñộng của ñiện trường sẽ di chuyển về cực dương Sử dụng ethidium bromide ñể phát hiện sự hiện diện của DNA sau khi nhuộm là nhờ Ethidium bromide có khả năng gắn chèn vào phân tử DNA và phát màu dưới ñèn UV

2.4.6.2 Pha hóa chất và chuẩn bị gel agarose

Pha dịch nạp mẫu

Thành phần của dịch nạp mẫu như sau: 600 µl glycerol + 0.25% xylene cyanol ff, thêm dung dịch TAE 1X cho ñủ 1000 µl

Kỹ thuật ñổ gel agarose 2%

vào giá nằm ngang có lắp lược, chờ gel ñông, ñặt vào bồn ñiện di có chứa dung dịch TAE 1X, rút lược khỏi gel

2.4.6.3 Kỹ thuật ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT - PCR

Thành phần ñiện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR hoặc chứng dương, chứng

âm với 3 µl dịch nạp mẫu Cho hỗn hợp trên vào các giếng trên gel agarose 2% Điện di ở ñiện thế 50V, 5 phút Tăng lên 80V, 30 phút Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X có ethidium bromide 15 phút

Quan sát kết quả ñiện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc

XR có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad) Kích thước các sản phẩm PCR ñược ghi nhận sẽ ñối chiếu với chứng dương, chứng âm và thang chuẩn 100bp

2.4.7 Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

Quy trình multiplex PCR thực hiện trên chứng dương là mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung ñã ñược xác ñịnh do HPV type 16 gây ra Trong mỗi phản ứng luôn

bổ sung chứng nội ở giai ñoạn PCR nhằm kiểm soát nội phản ứng Phản PCR diễn

ra bình thường nếu chứng nội xuất hiện vạch 400 bp sau khi ñiện di

2.4.7.1 Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu nhận hoàn toàn RNA tổng số

RNA của chứng dương ñược tách chiết theo phương pháp tủa trong phenol/chloroform Về nguyên tắc, dung dịch Trizol ở pH 4 ñã loại bỏ hết DNA (vốn tồn tại ở pH 8) Tuy nhiên, trong thực nghiệm, có thể không loại hết DNA trong quá trình tách chiết, do vậy, bộ gen của HPV có thể còn sót lại sẽ ñược khuếch ñại sau phản ứng PCR làm kết quả dương tính Kết quả dương tính này có thể là dương tính giả do ñược khuếch ñại từ gen E6 và E7 trong DNA của HPV còn sót lại sau tách chiết Trong khi ñó, gen E6 và E7 tồn tại trong bộ gen HPV DNA sẽ không có khả năng gây ung thư do bị khóa bởi gen E2 của virut HPV

Vì vậy, ñể loại bỏ hoàn toàn DNA có thể còn sót lại sau tách chiết, tiếp tục

xử lý bằng DNase I nhằm thu nhận hoàn toàn RNA cho phản ứng và làm tăng ñộ chính xác của quy trình

Từ các mẫu chứng dương cho kết quả dương tính khi phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 với phản ứng multiplex RT-PCR và multiplex PCR

sẽ lựa chọn và tiến hành khảo sát nồng ñộ DNase I xử lý DNA còn sót lại

Theo khuyến cáo của nhà sản xuất [61], nồng ñộ DNase I thích hợp cho phân giải DNA còn sót lại sau tách chiết là 1U DNase I/phản ứng Do vậy, ñề tài tiến hành khảo sát nồng ñộ DNase I thích hợp cho phân giải DNA còn sót lại sau tách chiết theo dãy nồng ñộ sau: 1, 2, 3, 4 và 5 U DNase I /phản ứng

Như vật, nồng ñộ DNase I cho kết quả âm tính sau khi multiplex PCR sẽ là nồng ñộ DNase I thích hợp sử dụng ñể xử lý DNA còn sót lại

Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.4.7.2 Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi

Trong phản ứng PCR, nhiệt ñộ lai là một yếu tố quan trọng Nhiệt ñộ lai thấp

sẽ tạo các vạch ký sinh hoặc bắt cặp không chuyên biệt gây hiện tượng dương tính giả Nhiệt ñộ lai cao làm giảm hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn và kết quả

có thể gây nên hiện tượng âm tính giả

Do vậy, ñể lựa chọn nhiệt ñộ lai tối ưu, ñề tài tiến hành khảo sát nhiệt ñộ lai

sát cho tín hiệu vạch rõ nét nhất khi ñiện di sẽ là nhiệt ñộ lai tối ưu của quy trình

Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.4.7.3 Khảo sát nồng ñộ mồi

Nồng ñộ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải ñược tính toán tối ưu bằng thực

nghiệm Nếu nồng ñộ mồi quá cao sẽ dẫn ñến hiện tượng khuếch ñại ký sinh, ngược lại hiệu quả khuếch ñại của phản ứng không cao

Ngoài ra, trong phản ứng multiplex PCR thường xảy ra hiện tượng cặp mồi cạnh tranh nhau nên kết quả phản ứng PCR trên mỗi cặp mồi sẽ không tối ưu, do ñó việc tối ưu nồng ñộ mỗi mồi trong phản ứng multiplex PCR là cần thiết Nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR phổ biến nhất là từ 100 – 500nM [49] Nồng ñộ của 2 cặp mồi khảo sát ñược thể hiện trong bảng 2.4

Bảng 2.4 Nồng ñộ của 2 cặp mồi khảo sát trong phản ứng multiplex PCR

2.4.7.4 Khảo sát nồng ñộ Mg 2+

Nồng Mg2+

có thể ảnh hưởng ñến nhiệt ñộ biến tính DNA khuôn mẫu, quá

trình ủ của mồi, tính ñặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq DNA

sợi ñôi ổn ñịnh hơn làm cho kết quả PCR nghèo ñi Mặt khác, còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả ổn ñịnh hơn dẫn ñến xuất hiện sản phẩm PCR không ñặc hiệu với

khuếch ñại và tính ñặc hiệu cho sản phẩm PCR [49]

2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 và 5.0 mM

Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.4.7.5 Khảo sát nồng ñộ dNTP

Trong thí nghiệm, luôn sử dụng nồng ñộ 4 loại dNTP bằng nhau Nếu hỗn

hợp dNTP không cân bằng sẽ làm giảm ñộ chính xác của Taq DNA polymerase

Nồng ñộ tổng cộng của 4 loại dNTP trong phản ứng trong khoảng 200µM–1000µM nhưng nồng ñộ thường ñược sử dụng là 200 - 250µM [49]

Trong thí nghiệm, nồng ñộ 4 loại dNTP tổng cộng ñược khảo sát theo dãy nồng ñộ sau: 120; 160; 200; 240 và 280µM

Nồng ñộ dNTP cho tín hiệu rõ nét nhất trong phản ứng có chứng dương sẽ là nồng ñộ dNTPs tối ưu của quy trình Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.4.7.6 Khảo sát ñộ nhạy của quy trình

Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của phương pháp chẩn đốn Độ nhạy cho biết lượng bản sao nhỏ nhất mà một phương pháp cĩ thể cho kết quả dương tính Dịch RNA sử dụng cho thí nghiệm được tách chiết từ mẫu dương tính

Sau đĩ, thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR

Độ nhạy của quy trình là mật độ chứng dương thấp nhất cho kết quả dương tính trong phản ứng multiplex RT-PCR

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.4.7.7 Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình

Tiến hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các đối tượng khác

nhau cĩ thể cĩ mặt trong dịch phết cổ tử cung như: DNA của người khơng bị ung thư cổ tử cung (được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện đa khoa Cần Thơ);

HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli,

Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae (được cung cấp từ Cơng ty cổ phần

cơng nghệ Việt Á, Tp Hồ Chí Minh), kèm theo mẫu chứng dương

Quy trình sẽ đặc hiệu khi cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và

âm tính với các đối tượng cịn lại

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.4.8 Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung bệnh phẩm thu thập tại Tp Buơn Ma Thuột

Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR đã nghiên cứu trên 86 mẫu dịch phết

cổ tử cung thu thập tại Tp Buơn Ma Thuột – Đăk Lăk, qua đĩ xác định sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người

Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Qua nghiên cứu và thực hiện ñề tài, chúng tôi ñi tới một số kết luận sau:

1 Thiết kế thành công hệ mồi phát hiện ñặc hiệu sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người

2 Thiết kế thành công chứng nội nhằm kiểm soát nội phản ứng

3 Bước ñầu xây dựng thành công các ñiều kiện của quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

- Nồng ñộ enzym DNase I thích hợp cho xử lý DNA còn sót lại sau tách chiết: 2 U/phản ứng

- Nồng ñộ mồi tối ưu cho phản ứng tại 400nM với cặp mồi E6f-E6r và 500nM với cặp mồi E7f-E7r

- Nồng ñộ dNTP tối ưu cho phản ứng: 200µM

- Quy trình nghiên cứu ñặc hiệu cho phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người

4 Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch ñại của qui trình ñã khẳng ñịnh sản phẩm khuếch ñại thuộc gen E6 và E7 của HPV type 16 do gắn chèn vào bộ gen người

5 Kiểm chứng quy trình trên 86 mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp Buôn Ma

gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người

4.2 Kiến nghị

Nhằm hồn thiện và nâng cao hiệu quả phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đề tài cĩ một số kiến nghị sau:

1 Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện đánh giá hiệu lực sơ cấp và thứ cấp của quy trình nhằm tạo KIT để ứng dụng cho chẩn đốn tiền ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

2 Mở rộng nghiên cứu hồn thiện quy trình chẩn đốn tiền ung thư cổ tử cung trên các HPV type khác thuộc nhĩm type "nguy cơ cao" gây ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16

3.1.1 Thiết kế và kiểm tra mồi

Sau khi thiết kế và kiểm tra mồi bằng phần mền ClustalX 1.81 (EMBL, Châu Âu) và Annhyb 4.922 (Olivier Friard, Hoa Kỳ), trình tự mồi ñược thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả thiết kế mồi

E6 287 E6r Mồi ngược GACACAGTGGCTTTTGACAGT 402–382

E7f Mồi xuôi AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 91–110

E7 183 E7r Mồi ngược GCACACAATTCCTAGTGTGC 273-254

Qua bảng 3.1 cho thấy mồi xuôi E6f có vị trí từ nucleotide 116 tới nucleotide 139

và mồi ngược E6r có vị trí từ nucleotide 420 tới nucleotide 382 của gen E6 Cặp mồi E6f – E6r khuếch ñại một ñoạn DNA có kích thước 287 bp Mồi xuôi E76f có vị trí từ nucleotide 91 tới nucleotide 110 và mồi ngược E7r có vị trí từ nucleotide 273 tới nucleotide 254 của gen E76 Cặp mồi E76f – E76r khuếch ñại một ñoạn DNA có kích thước 183 bp

Thông tin về ñặc tính và cấu trúc thứ cấp của mồi thể hiện qua bảng 3.2; 3.3

và 3.4

Bảng 3.2 Đặc tính của hệ mồi thiết kế

Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế

Thông qua bảng 3.2; chiều dài, nhiệt ñộ biến tính và %GC của các mồi thiết

kế ñều ñạt theo tiêu chuẩn thiết kế mồi Đặc biệt, nhiệt ñộ biến tính của các mồi

Sự chênh lệch nhiệt ñộ biến tính của các mồi không cao là ñiều kiện thuận lợi cho mồi bắt cặp với mạch khuôn ñạt hiệu quả cao

Cấu trúc thứ cấp của mồi là các cấu trúc ñược hình thành ngay khi ở trạng thái bình thường như cấu trúc hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), Self-dimer (sự tự bắt cặp của mồi), hetero-dimer (sự bắt cặp của mồi này với mồi khác), Các cấu trúc này có thể bị phá hủy bởi nhiều tác nhân như nhiệt ñộ,… Sự hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi sẽ làm giảm hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn; do vậy, làm giảm hiệu quả khuếch ñại sản phẩm trong phản ứng PCR

Qua bảng 3.3, ñặc tính cấu trúc kẹp tóc của mồi (hairpin loop) phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế mồi Mức năng lượng tạo thành cấu trúc kẹp tóc của các mồi ñều

>-9 kcal/mole; do vậy, cấu trúc này dễ dàng bị phá vỡ bởi nhiệt Mặt khác, nhiệt ñộ biến tính của các cấu trúc kẹp tóc thấp hơn nhiệt ñộ biến tính của mồi Điều này khẳng ñịnh, tại nhiệt ñộ bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn thì cấu trúc kẹp tóc của mồi ñã bị phá hủy và hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn không bị ảnh hưởng bởi cấu trúc này Bên cạnh ñó, năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E6f, E6r và E7f ñều >-9 kcal/mole phù hợp với tiêu chuẩn lý thuyết nhưng năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole) Tuy nhiên, mức năng lượng tạo cấu trúc này không vượt quá cao so với tiêu chuẩn và có thể phá vỡ nhờ tăng nhiệt ñộ tại bước gắn mồi Do vậy, ñề tài vẫn lựa chọn và bằng thực nghiệm ñã cho thấy cặp mồi E7 vẫn hoạt ñộng bình thường

Tại bảng 3.4, cũng tương tự, mức năng lượng tạo cấu trúc thứ cấp dimer của mồi E6f, E6r và E7f ñạt tiêu chuẩn thiết kế Ngoại trừ năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole) Tuy vậy, sự chênh lệch này không quá cao và bằng thực nghiệm cũng cho thấy cặp mồi E7 hoạt ñộng bình thường

hetero-Kiểm tra tính ñặc hiệu của mồi về mặt lý thuyết bằng phần mền trực tuyến BLAST trên NCBI cho thấy: mồi xuôi E6f và mồi ngược E6r chỉ tương ñồng với các trình tự gen E6 của HPV type 16 ñược công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, mức

ñộ tương ñồng là 100%, chỉ số nhận diện mức ñộ tương ñồng là 100%; mồi xuôi E7f và mồi ngược E7r chỉ tương ñồng với các trình tự gen E7 của HPV type 16 ñược công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, với mức ñộ tương ñồng là 100%, chỉ số

nhận diện mức ñộ tương ñồng là 100% (phụ lục 1) Như vậy, hệ mồi thiết kế là ñặc

hiệu cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16

Từ các kết quả trên về mặt lý thuyết, ñề tài ñã thiết kế cặp mồi E6f-E6r và E7f-E7r ñạt tiêu chuẩn cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16 Cặp mồi ñạt tiêu chuẩn ñược lựa chọn và gửi tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ)

3.1.2 Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế

Sau khi tách chiết RNA của chứng dương ñã xác ñịnh ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra, tiến hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR và thu ñược kết quả thể hiện qua hình 3.1

Hình 3.1 Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế

Kết quả cho thấy, trong mỗi phản ứng, chứng nội luôn xuất hiện vạch có kích thước 400bp như thiết kế, các mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) xuất hiện 2

400

287

183

vạch, một có kích thước 287bp (của gen E6) và một có kích thước 183bp (của gen E7) ñúng như mong muốn Các vạch ñều rõ nét và không có băng ký sinh

Như vậy, chứng nội hoạt ñộng bình thường và sau ñiện di cho vạch có kích thước ñúng như thiết kế Cặp mồi thiết kế có khả năng khuếch ñại ñoạn DNA có kích thước 287bp của gen E6 và 183bp của gen E7 của HPV type 16 gắn chèn vào

bộ gen người, các vạch ñều rõ nét và không có băng ký sinh

3.1.3 Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại

Sau khi gửi 2 sản phẩm khuếch ñại ký hiệu E6_E6 (khuếch ñại từ gen E6) và E7_E7 (khuếch ñại từ gen E7) của mẫu chứng dương CD1 ñược gửi tới công ty Macrogen (Hàn Quốc) ñể giải trình tự, mỗi sản phẩm khuếch ñại giải trình tự cả 2

mạch Kết quả ñược trình bày qua bảng 3.5 và phụ lục 3

Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người

Kích thước thiết

237

E7_E7

Mạch

xuôi

NNGGNNNGANAGNNTGANAGCAGAACCGGAC AGAAGCCCATTTACAATTATTGTAACCTTTTGT TGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGA AGAC

134

Ghi chú: N: nucleotide không xác ñịnh

Qua bảng 3.5 cho thấy kích thước giải trình tự thu ñược của 2 sản phẩm ñều thấp hơn so với kích thước thiết kế Kích thước trong thiết kế ñối với khuếch ñại ñoạn gen E6 là 287bp nhưng kích thước giải trình tự thu ñược của mẫu E6_E6 với mạch xuôi là 234bp, mạch ngược là 237bp Tương tự, kích thước thiết kế khuếch ñại ñoạn gen E7 là 183bp nhưng kích thước giải trình tự thu ñược của mẫu E7_E7 với mạch xuôi và mạch ngược là 134bp Có sự chênh lệch và số nucleotic là do trong kỹ thuật giải trình tự, các nucleotide của các mồi sẽ không ñược giải lại Mặt khác, một số nucleotide ñầu tiên trong quá trình giải thường bị nhiễu tín hiệu, không xác ñịnh chính xác tên loại nucleotide và ñược ký hiệu là N Do vậy, sản phẩm giải trình tự thu ñược sẽ cho kích thước nhỏ hơn so với sản phẩm trong thiết kế và khuếch ñại

Kết quả giải trình tự ñược kiểm tra bằng phần mềm ClustalX 1.81 cho thấy: trình tự nucleotide giải ñược của mạch xuôi, mạch ngược mẫu E6_E6 và E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch ñại sản phẩm và thuộc gen E6 (vị trí từ nucleotide

116 tới 402) do HPV type 16 gắn chèn Tương tự như vậy, trình tự nucleotide giải ñược của mạch xuôi, mạch ngược mẫu E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch ñại sản phẩm thuộc gen E7 (vị trí từ nucleotide 273 tới 91) của HPV type 16 gắn chèn

vào bộ gen người (phụ lục 4)

Ngoài ra, nhằm ñánh giá mức ñộ tương ñồng của sản phẩm khuếch ñại với các trình tự gen ñược công bố, ñề tài sử dụng phần mềm BLAST ñể tìm kiếm các trình tự gen ñược công bố trên NCBI tương ñồng với sản phẩm giải trình tự Kết quả cho thấy sản phẩm giải trình tự chỉ tương ñồng với các trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 với mức ñộ tương ñồng 99% ñối với sản phẩm khuếch ñại từ gen

E6 và 98% ñối với sản phẩm khuếch ñại từ gen E7 (phụ lục 5)

Như vậy, bằng lý thuyết và thực nghiệm ñều cho thấy, sản khuếch ñại là của gen E6 và E7 của HPV type 16 do gắn chèn và quy trình nghiên cứu phát hiện ñặc hiệu sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người

3.2 Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào

bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR

3.2.1 Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết

RNA của chứng dương ñược tách chiết theo phương pháp tủa trong phenol/chloroform Để loại bỏ hoàn toàn DNA trong dung dịch mẫu sau tách chiết, enzym DNase I ñược sử dụng với các nồng ñộ khác nhau Đề tài tiến hành thực hiện phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I với dịch sau tách chiết, kèm theo chứng âm và thu ñược kết quả thể hiện tại hình 3.2

Hình 3.2: Phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym

DNase I

Ghi chú: N: chứng âm; T: thang 100 bp; CD1, CD2, CD3: chứng dương 1, 2, 3