4. Ý nghĩa thực tiễn
2.4.7.1.Nghiên cứu nồng độ enzym DNas eI xử lý dịch sau tách chiết thu
hồn tồn RNA tổng số
RNA của chứng dương được tách chiết theo phương pháp tủa trong phenol/chloroform. Về nguyên tắc, dung dịch Trizol ở pH 4 đã loại bỏ hết DNA (vốn tồn tại ở pH 8). Tuy nhiên, trong thực nghiệm, cĩ thể khơng loại hết DNA trong quá trình tách chiết, do vậy, bộ gen của HPV cĩ thể cịn sĩt lại sẽ được khuếch đại sau phản ứng PCR làm kết quả dương tính. Kết quả dương tính này cĩ thể là dương tính giả do được khuếch đại từ gen E6 và E7 trong DNA của HPV cịn sĩt lại sau tách chiết. Trong khi đĩ, gen E6 và E7 tồn tại trong bộ gen HPV DNA sẽ khơng cĩ khả năng gây ung thư do bị khĩa bởi gen E2 của virut HPV.
Vì vậy, để loại bỏ hồn tồn DNA cĩ thể cịn sĩt lại sau tách chiết, tiếp tục xử lý bằng DNase I nhằm thu nhận hồn tồn RNA cho phản ứng và làm tăng độ chính xác của quy trình.
Từ các mẫu chứng dương cho kết quả dương tính khi phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 với phản ứng multiplex RT-PCR và multiplex PCR sẽ lựa chọn và tiến hành khảo sát nồng độ DNase I xử lý DNA cịn sĩt lại.
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất [61], nồng độ DNase I thích hợp cho phân giải DNA cịn sĩt lại sau tách chiết là 1U DNase I/phản ứng. Do vậy, đề tài tiến hành khảo sát nồng độ DNase I thích hợp cho phân giải DNA cịn sĩt lại sau tách chiết theo dãy nồng độ sau: 1, 2, 3, 4 và 5 U DNase I /phản ứng.
Như vật, nồng độ DNase I cho kết quả âm tính sau khi multiplex PCR sẽ là nồng độ DNase I thích hợp sử dụng để xử lý DNA cịn sĩt lại.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.