Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nồng độ Mg2+ tại 1.0mM; 2: nồng độ Mg2+ tại 1.5mM;
3: nồng độ Mg2+ tại 2.0mM; 4: nồng độ Mg2+ tại 2.5mM; 5: nồng độ Mg2+ tại 3.0mM; 6: nồng độ Mg2+ tại 3.5mM; 7: nồng độ Mg2+ tại 4.0mM; 8: nồng độ Mg2+
tại 4.5mM; 9: nồng độ Mg2+ tại 5.0 mM
Kết qủa điện di tại hình 3.6 cho thấy ở tất cả các phản ứng PCR đều cho sản phẩm khuếch đại. Tuy nhiên, sản phẩm khuếch đại rõ và nét nhất khi thực hiện với nồng độ Mg2+ tại 3 mM (giếng 5).
Như vậy, 3 mM là nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng PCR.
3.2.5. Khảo sát nồng độ dNTP
Trong mỗi phản ứng luơn sử dụng nồng độ 4 loại dNTP bằng nhau, nếu hỗn hợp dNTP khơng cân bằng sẽ làm giảm độ chính xác của Taq DNA polymerase.
Trong thí nghiệm, nồng độ 4 loại dNTP tổng cộng trong mỗi phản ứng được khảo sát theo dãy sau: 120; 160; 200; 240 và 280µM và thu được kết quả:
Hình 3.7: Khảo sát nồng độ dNTP
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nồng độ 120µM; 2: nồng độ 160µM; 3: nồng độ
200µM; 4: nồng độ 240µM; 5: nồng độ 280µM
Kết quả khảo sát nồng độ dNTP tại hình 3.7 cho thấy tất cả các nồng độ dNTP trong khảo sát đều xuất hiện vạch như mong muốn, trong đĩ tín hiệu vạch đậm dần theo nồng độ dNTP từ 120 tới 280 µM. Tại nồng độ 120 µM của dNTP
đem khảo sát xuất hiện vạch rất mờ; tín hiệu vạch đậm và rõ nét nhất thể hiện tại nồng độ 280 µM (giếng số 5).
Tuy nhiên, nhằm tiết kiệm dNTP, đề tài lựa chọn nồng độ dNTP tối ưu của phản ứng PCR tại 200 µM.
3.2.6. Khảo sát độ nhạy của quy trình
Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của phương pháp chẩn đốn. Độ nhạy cho biết lượng bản sao nhỏ nhất mà một phương pháp cĩ thể cho kết quả dương tính.
Từ mẫu chứng dương đã biết trước mật độ là 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml. Mẫu được tách chiết và pha lỗng bậc 10 liên tiếp tạo thành các mật độ: 106; 105; 104; 103; 102; 101 bản sao mRNA E6 và E7/ml; sau đĩ, thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR. Hình 3.8 và Bảng 3.7 trình bày kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình.
Hình 3.8: Khảo sát độ nhạy của quy trình
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: 101; 2: 102; 3: 103; 4: 104; 5: 105 và 6: 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml
Bảng 3.8: Khảo sát độ nhạy của quy trình
Mật độ chứng dương (bản
sao mRNA E6 và E7/ml) 10
6
105 104 103 102 101
Qua hình 3.8 và bảng 3.8 cho thấy vạch mục tiêu của gen E6 và E7 xuất hiện từ mật độ 103 tới 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml và cường độ tín hiệu vạch đậm dần theo mật độ tăng dần của mẫu chứng. Tại mật độ 101 và 102 bản sao mRNA E6 và E7/ml khơng cho tín hiệu vạch.
Như vậy, giới hạn phát hiện hay độ nhạy của quy trình là 103 bản sao mRNA E6 và E7/ml.
3.2.7. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
Nhằm khảo sát độ đặc hiệu của quy trình, đề tài thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các đối tượng cĩ thể cĩ mặt trong dịch phết cổ tử cung như: DNA của người khơng bị ung thư cổ tử cung (được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện đa khoa Cần Thơ), HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae (được cung cấp từ Cơng ty cổ phần cơng nghệ Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh).
Hình 3.9: Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
Ghi chú: CD: chứng dương; T: thang DNA 100bp; N: chứng âm; A: DNA của người
khơng bị ung thư cổ tử cung; B: HPV type 18, C: HPV type 11; D: HPV type 6; E: HPV type 33; F: HPV type 45; G: E.coli; H: Chlamydia trachomatis; K: Neisseria
gonorrhoeae.
Kết quả thể hiện qua hình 3.9 cho thấy chứng nội luơn xuất hiện vạch 400 bp, chứng âm âm tính và quy trình chỉ cho tín hiệu vạch của gen E6, E7 của chứng
dương tức từ mẫu của người bị ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra và âm tính với các đối tượng cịn lại trong khảo sát.
Do vậy, bằng thực nghiệm, quy trình nghiên cứu là đặc hiệu cho phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR
Sau khi hồn thành khảo sát các yếu tố của quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR, quy trình được tĩm tắt qua sơ đồ tại bảng 3.8
Bảng 3.9: Sơ đồ quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR
Mẫu bệnh phẩm bảo quản trong dung dịch TE 1X tại -200C
Tách chiết mẫu theo phương pháp tủa trong phenol/chlorofom
Xử lý dịch tách chiết với 2U/phản ứng enzym Dnase I, Rnase free Giai đoạn tách
chiết mẫu (khoảng 2h 30’)
- Thành phần 1 phản ứng 20µl:
12.5µl dịch tách chiết RNA, 1µl enzym RT, 6.5 µl RT buffer - Chương trình luân nhiệt:
250C – 10 phút, 420C - 30 phút, 850C – 5 phút, giữ ở 40C
Thực hiện phản ứng Multiplex PCR - Trình tự mồi
Ký hiệu mồi Trình tự mồi 5’ – 3’
E6f CACAGAGCTGCAAACAACTATACA
E6r GACACAGTGGCTTTTGACAGT
E7f AGCTCAGAGGAGGAGGATGA
E7r GCACACAATTCCTAGTGTGC
- Thành phần 1 phản ứng 25µl:
2.5µl 10X buffer; 0.625 u Taq DNA polymerase; 3.0 mM MgCl2 ; 200µM dNTP; Mồi E6f-E6r: mỗi mồi 400nM; Mồi E7f-E7r: mỗi mồi 500nM; 1µl chứng nội ở mật độ 104 bản sao/ml; 2.5µl dịch cDNA và thêm nước cất hai lần
cho đủ 25µl
- Chương trình luân nhiệt:
950C 5 phút 1 chu kỳ 950C 30 giây 560C 30 giây 39 chu kỳ 720C 30 giây 720C 6 phút 1 chu kỳ Điện di
- Gồm 7µl sản phẩm PCR hoặc chứng dương hoặc chứng âm, với 3µl dịch nạp mẫu
- Điện di trên gel agarose 2%, ở điện thế 50V trong 5 phút. Sau đĩ 80V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch TAE 1X cĩ ethidium bromide trong 15
phút
Đọc kết quả
Chứng nội luơn xuất hiện vạch cĩ kích thước 400bp, chứng dương dương tính, chứng âm âm tính thì phản ứng diễn ra bình thường. Xuất hiện vạch 287bp và
183bp kết luận cĩ gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16 bộ gene người, ngược lại khơng cĩ gắn chèn gene.
Giai đoạn thực hiện phảm ứng multiplex RT-PCR (khoảng 2h 30’) Giai đoạn điện di và đọc kết quả (khoảng 1h)
Thời gian cho tồn bộ quy trình (từ tách chiết mẫu tới đọc kết quả): 6 – 7 giờ.
3.3. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buơn Ma Thuột
86 mẫu dịch phết cổ tử cung được thu thập tại Tp. Buơn Ma Thuột – Đăk Lăk từ tháng 4 tới tháng 6 năm 2011, mẫu được tách chiết và thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR. Trong mỗi phản ứng luơn kèm theo chứng dương, chứng âm, chứng nội và kết quả được trình bày qua hình 3.10 và bảng 3.9
T (-) (+) H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10
(+) T (-) H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22
Hình 3.10: Kết quả bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp.
Buơn Ma Thuột H34 H35 H36 H37 H38 T (-) (+) H39 H40 H41 H42 H43 T (+) (-) H44 H45 Đ46 Đ47 H48 H49 H50 H51 H52 H53 T M77 M78 M79 (+) (-) T M80 M81 M82 M83 M84 D85 D86 H54 H55 H56 (+) (-) T H57 D58 H59 H60 H61 H62 H63 H64 H65 T (-) (+) H66 H67 H68 C69 C70 D71 D72 D73 D74 M75 M76 T
Ghi chú: T: thang DNA 100bp; (-): chứng âm; (+): chứng dương; H: giếng ứng với mẫu thu tại Bệnh viện đa khoa Thiên Hạnh; Đ: giếng ứng với mẫu thu tại phịng khám đa khoa
Hồng Đức; C: giếng ứng với mẫu thu tại phịng khám đa khoa số 46 Phan Chu Trinh; D: giếng ứng với mẫu thu tại phịng khám đa khoa Nguyễn Dũng; M: giếng ứng với mẫu thu
tại phịng khám số 120 Hồ Tùng Mậu
Bảng 3.10: Kết quả bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập
tại Tp. Buơn Ma Thuột
STT Ký hiệu mẫu Kết quả STT Ký hiệu mẫu Kết quả STT Ký hiệu mẫu Kết quả 1 H01 - 30 H30 - 59 H59 - 2 H02 - 31 H31 - 60 H60 - 3 H03 - 32 H32 - 61 H61 - 4 H04 33 H33 62 H62 5 H05 - 34 H34 - 63 H63 - 6 H06 - 35 H35 - 64 H64 - 7 H07 - 36 H36 - 65 H65 - 8 H08 - 37 H37 - 66 H66 - 9 H09 - 38 H38 - 67 H67 - 10 H10 - 39 H39 - 68 C68 - 11 H11 - 40 H40 - 69 C69 - 12 H12 - 41 H41 - 70 D70 - 13 H13 - 42 H42 - 71 D71 - 14 H14 - 43 H43 - 72 D72 - 15 H15 - 44 H44 - 73 D73 - 16 H16 - 45 Đ45 - 74 M74 - 17 H17 - 46 Đ46 - 75 M75 - 18 H18 - 47 H47 - 76 M76 - 19 H19 - 48 H48 - 77 M77 - 20 H20 - 49 H49 - 78 M78 - 21 H21 - 50 H50 - 79 M79 - 22 H22 - 51 H51 - 80 M80 + 23 H23 - 52 H52 - 81 M81 -
24 H24 - 53 H53 - 82 M82 - 25 H25 - 54 H54 - 83 M83 - 26 H26 - 55 H55 - 84 M84 - 27 H27 - 56 H56 - 85 D85 - 28 H28 - 57 D57 - 86 D86 - 29 H29 - 58 H58 -
Ghi chú: (– ) khơng phát hiện cĩ gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen
người. (+) cĩ phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
Thơng qua kết quả được thể hiện tại hình 3.10 và bảng 3.10 cho thấy: chứng nội luơn xuất hiện vạch trong mỗi phản ứng sau điện di chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng ức chế phản ứng, chứng dương xuất hiện 2 vạch ứng với 2 gen khuếch đại E6 và E7 chứng tỏ mồi hoạt động bình thường, chứng âm khơng xuất hiện vạch chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng nhiễm chéo giữa các phản ứng. Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR diễn ra bình thường, khơng cĩ hiện tượng ức chế phản ứng.
Tại hình 3.10 và bảng 3.10 cũng cho thấy quy trình nghiên cứu đã phát hiện 1/86 mẫu dịch phết cổ tử cung (mẫu M80) thu thập tại Buơn Ma Thuột cĩ sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
Sản phẩm khuếch đại gen E6 và E7 của mẫu M80 dương tính được gửi giải trình tự tại Cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) với ký hiệu E6_E6F và E67_E7F. Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại E6_E6F và E67_E7F (phụ lục 8.1) và kiểm tra bằng
phần mềm ClustalX 1.81 (phụ lục 8.2) cho thấy: trình tự nucleotide giải được của sản phẩm khuếch đại E6_E6F (của mẫu M80) nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm và thuộc gen E6 (vị trí từ nucleotide 116 tới 402) và trình tự nucleotide giải được của sản phẩm khuếch đại E7_E7F (của mẫu M80) nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm thuộc gen E7 (vị trí từ nucleotide 91 tới 273) của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người.
Đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm khuếch đại từ mẫu M80 với các trình tự gen được cơng bố trên ngân hàng gen (Genebank) thơng qua phần mềm BLAST trên NCBI, sản phẩm khuếch đại từ mẫu M80 chỉ tương đồng với các trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 với mức độ tương đồng 97% đối với sản phẩm khuếch đại của gen E6 và 99% đối với sản phẩm khuếch đại của gen E7 (phụ lục 8.3).
Như vậy, sản phẩm khuếch đại là của gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người.
PHỤ LỤC Phụ lục 1
Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của hệ mồi về mặt lý thuyết 1. Tính đặc hiệu của mồi E6f
Phụ lục 2
Kết quả khảo sát nồng độ hệ mồi E6f-E6r : E7f-E7r trong phản ứng
Ghi chú: Hình A: giếng T: thang DNA 100bp; giếng 1-5: nồng độ cặp mồi E6f-
E6r tại 100nM: cặp E7f-E7r tăng từ 100 – 500nM; giếng 6-10: nồng độ cặp mồi
Hình B: T: thang DNA 100bp; 11-15: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tại 300nM: cặp
E7f-E7r tăng từ 100 – 500nM; 16-20: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tại 400nM: cặp
E7f-E7r tăng từ 100 – 500nM
Hình C: 21-25: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tại 500nM: cặp E7f-E7r tăng từ 100 – 500nM
Hình D: T: thang DNA 100bp; 26-30: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tăng từ 100 – 500nM: cặp E7f-E7r tại 100nM
Hình E: T: thang DNA 100bp; 31-35: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tăng từ 100 –
500nM: cặp E7f-E7r tại 200nM; 36-40: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tăng từ 100 –
500nM: cặp E7f-E7r tại 300nM
Hình F: T: thang DNA 100bp; 41-45: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tăng từ 100 –
500nM: cặp E7f-E7r tại 400nM; 46-50: nồng độ cặp mồi E6f-E6r tăng từ 100 –
Phụ lục 3
Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại từ chứng dương CD1 1. Kết quả giải trình tự mạch xuơi của mẫu E6_E6
3. Kết quả giải trình tự mạch xuơi của mẫu E7_E7
Phụ lục 4
Kiểm chứng kết quả giải trình tự với một số trình tự gen trong nghiên cứu bằng phần mềm ClustalX 1.81
1. Kiểm chứng kết quả giải trình tự mạch xuơi của mẫu E6_E6 với một số trình tự gen E6 của HPV type 16 trong nghiên cứu
2. Kiểm chứng kết quả giải trình tự mạch ngược của mẫu E6_E6 với một số trình tự gen E6 của HPV type 16 trong nghiên cứu
3. Kiểm chứng kết quả giải trình tự mạch xuơi của mẫu E7_E7 với một số trình tự gen E7 của HPV type 16 trong nghiên cứu
4. Kiểm chứng kết quả giải trình tự mạch ngược của mẫu E7_E7 với một số trình tự gen E7 của HPV type 16 trong nghiên cứu
Phụ lục 5
Kết quả BLAST tìm kiếm các trình tự gen tương đồng với sản phẩm giải trình tự 1. Kết quả BLAST tìm kiếm các trình tự gen cơng bố trên Genebank tương đồng với sản phẩm giải trình tự của mạch xuơi mẫu E6_E6
2. Kết quả BLAST tìm kiếm các trình tự gen cơng bố trên Genebank tương đồng với sản phẩm giải trình tự của mạch ngược mẫu E6_E6
3. Kết quả BLAST tìm kiếm các trình tự gen cơng bố trên Genebank tương đồng với sản phẩm giải trình tự của mạch xuơi mẫu E7_E7
4. Kết quả BLAST tìm kiếm các trình tự gen cơng bố trên Genebank tương đồng với sản phẩm giải trình tự của mạch ngược mẫu E7_E7