4. Ý nghĩa thực tiễn
1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung
1.2.1. Tác nhân [39, 52]
Hầu hết các trường hợp bị bệnh ung thư cổ
tử cung là do HPV gây ra. HPVtype 16 thuộc:
Họ: Papovaviridae Giống: Papillomavirus
Lồi: Human papillomavirus
HPV type 16 khơng cĩ vỏ bao, đường kính 50 - 55nm, capsid hình khối đa diện.
1.2.2. Các type của HPV
Hiện nay, người ta phát hiện cĩ hơn 100 type HPV, mà sự khác nhau về bộ gen giữa các type chỉ khoảng 10% [19]. Dựa vào khả năng gây ung thư, HPV được chia thành hai loại:
- Type nguy cơ cao (high – risk type): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82. Các type này cĩ khả năng gây ung thư cao, thường liên quan đến loạn sản và ung thư cổ tử cung [52].
- Type nguy cơ thấp (low – risk type): gồm các type 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70,
73,… chúng chỉ gây ra các mụn cĩc ở vùng sinh dục hoặc các bất thường tế bào cổ tử cung hoặc cĩ thể khơng biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lâm sàng [52].
Trong các type nguy cơ cao, hai type cĩ liên quan đến khoảng 70% trường hợp mắc bệnh là type 16 và 18 [17, 53]. Riêng type 16 được nhận thấy là phổ biến nhất, chúng hiện diện trong khoảng 50% trường hợp bị bệnh ung thư cổ tử cung [13, 19, 36].
So sánh về mức độ nguy hiểm giữa các type, theo Giáo sư Anthony Gunnel (Viện Karolisnka, Stockhom), với những phụ nữ nhiễm HPV type 16 nồng độ cao, nguy cơ bị ung thư cổ tử cung tăng gấp 6 lần so với phụ nữ nhiễm HPV các type khác [64].
1.2.3. Bộ gen của virut HPV type 16
HPV type 16 cĩ bộ gen là chuỗi DNA xoắn kép, tồn tại dưới dạng vịng (hoặc episome), chỉ mã hố cho sáu gen sớm (E) và hai gen muộn (L). Cũng như đa số virut, HPV cĩ hiện tượng các gen chồng lên nhau được hình thành trong quá trình tiến hĩa để sử dụng tối đa tiềm năng gen trong một bộ gen rất nhỏ bé [8].
Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen của HPVtype 16
Bộ gen của HPV type 16 cĩ chiều dài 7906bp và được chia làm 3 vùng chính [14, 55]:
Vùng sớm (early region): chiều dài khoảng 4kb; gồm 6 gen là: E1, E2,
E4, E5, E6, E7. Vùng này cĩ chức năng mã hĩa cho những protein khơng cấu trúc liên quan đến cơ chế sinh ung thư.
Trong đĩ, hai gen gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7 lần lượt cĩ chiều dài khoảng 500bp và 300bp [39, 52].
Gen E6 của HPV type 16 mã hĩa cho Protein E6 của virut. Protein này cĩ
thể tương tác với khoảng 12 protein khác nhau trong tế bào chủ nhưng quan trọng nhất là protein p53. Protein p53 là protein ức chế khối u và kiểm sốt chu trình tế bào, giúp cho tế bào chết theo chương trình đã định sẵn hay cịn gọi đây là quá trình apoptosis. Khi Protein E6 của HPV type 16 gắn kết với protein p53 của cơ thể làm
protein p53 bị bất hoạt và dẫn tới hiện tượng tế bào khơng bị chết đi theo chương trình của chúng hay cịn gọi là bất tử hĩa tế bào [4, 25].
Gen E7 của HPV type 16 mã hĩa cho protein E7 của virut. Protein này
khi kết hợp với protein retinoblastoma (pRb) của tế bào chủ sẽ làm bất hoạt pRb. Trong quá trình biệt hĩa tế bào biểu mơ, pRb là yếu tố chính điều hịa chu trình tế bào, giúp tế bào phát triển theo chương trình của chúng. Vì vậy, sự gắn kết của protein E7 của virut vào pRb của tế bào chủ sẽ làm bất hoạt pRb. Kết quả là tế bào tăng sinh liên tục và chuyển thành ung thư [47].
Vùng muộn (late region): chiều dài khoảng 3kb; gồm 2 gen muộn là: L1
và L2. Chức năng của vùng này là mã hĩa protein cấu trúc gồm 2 protein vỏ của virut. Người ta thường dựa vào vùng này để phân type của virut và nghiên cứu sản xuất vaccine HPV.
Vùng khơng mã hĩa (long control region - LCR): chiều dài khoảng
1kb. Vùng này cĩ vai trị điều hịa sự nhân đơi và biểu hiện gen của virut.
1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử, hiện tượng chèn gen của virut HPV type 16 vào bộ gen người
Hiện nay, người ta vẫn chưa xác định được cơ chế gắn chèn gen E6 và E7
của HPV type 16 vào bộ gen người. Nhưng với các nghiên cứu từ trước tới nay,
quá trình xâm nhiễm và gây ung thư cổ tử cung của HPV các type nguy cơ cao cũng như type 16 đã được mơ tả khá đầy đủ và rõ ràng [63].
Cổ tử cung bình thường cĩ một chỗ hẹp gọi là “vùng chuyển tiếp tế bào biểu mơ trụ gai” (transformation zone). Sự xâm nhiễm HPV type 16 thường xảy ra ở vùng này nhất do chúng thích hợp với đặc tính biến đổi từ tế bào đáy thành tế bào gai. Trước tiên, HPV type 16 sẽ xâm nhiễm vào lớp tế bào đáy, nhân bản tạo ra các bản sao và thể bổ sung, đồng thời biểu hiện các gen sớm E1, E2, E4, E5, …. Hoạt động này được tiến hành tách biệt với bộ gen chủ trong nhân tế bào. Các lớp tế bào
đáy bị nhiễm virut tiếp tục chu trình biệt hố biến đổi thành tế bào gai, lúc này hai gen muộn L1 và L2 mới được biểu hiện và tạo ra các phần cịn lại của virut. Nhờ hoạt động tăng sinh liên tục để thay thế các tế bào già, chết, các virut HPV type 16 mới tạo thành sẽ được phĩng thích ra ngồi [63].
Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type 16 trong tế bào chủ Việc nhiễm HPV type 16 là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây ung thư cổ tử cung. Sự kiện cho việc bắt đầu gây bệnh là hiện tượng chèn gen của HPV type 16 vào bộ gen người, dẫn đến rối loạn các chức năng tế bào. Hiện tượng chèn gen của HPV type 16 vào bộ gen người được phát hiện trong hơn 90% trường hợp ung thư cổ tử cung [47].
Ở trạng thái bình thường, bộ gen virut HPV type 16 tồn tại dưới dạng DNA plasmid, độc lập với nhân tế bào chủ, trong đĩ cĩ hai gen gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7. Hai gen này chỉ biểu hiện khả năng gây ung thư khi được phiên
mã thành mRNA, sau đĩ dịch mã thành protein. Nhưng ở trạng thái bình thường, chúng khơng phiên mã sang mRNA theo hoạt động nhân bản của virut vì do bị ức chế và kìm hãm bởi gen E2 của HPV type 16, do vậy, chúng tồn tại độc lập theo bộ gen virut mà khơng ảnh hưởng đến bộ gen tế bào chủ nếu khơng cĩ hiện tượng chèn gen xảy ra [24].
Việc tế bào bị nhiễm dai dẳng type 16 sẽ làm cấu trúc tế bào cổ tử cung rối loạn và chu trình tế bào bị xáo trộn. Đến một lúc nào đĩ, khi nhiễm sắc thể người bị mất ổn định, một số vị trí dễ gãy trên nhiễm sắc thể sẽ trở nên lỏng lẻo và yếu ớt. Dưới một điều kiện thuận lợi nào đĩ, bộ gen của virut HPV type 16 sẽ chèn vào các vị trí trên, gắn kết hai gen E6 và E7 vào bộ gen tế bào chủ. Khi đĩ chúng được phiên mã thành mRNA, dịch mã thành protein theo hoạt động của tế bào [24].
Khi gắn vào bộ gen tế bào chủ, hai gen sinh ung thư E6 và E7 sẽ mất đi sự kiểm sốt của gen E2 nên biểu hiện rõ khả năng gây ung thư. Một vài nghiên cứu cho thấy, E6 và E7 cĩ nhiệm vụ mã hố cho hai protein làm ức chế hai hệ thống tiêu diệt và đàn áp khối u p53 và pRb của tế bào chủ. Việc bất hoạt hệ thống p53 sẽ dẫn đến hiện tượng bất tử hố tế bào (do kích hoạt enzym telomerase – cĩ vai trị kéo dài đầu telomere của nhiễm sắc thể) và bất hoạt pRb sẽ làm cho tế bào tăng sinh liên tục, gây mất ổn định tế bào và chuyển thành ung thư cổ tử cung [24].
Khi các tế bào ung thư bắt đầu xâm lấn vào mơ liên kết, cĩ chiều hướng lan rộng dọc theo màng đáy được gọi là ung thư xâm lấn (invasive cancer). Ung thư cổ tử cung nếu tiến triển nặng cĩ thể di căn sang bụng, phổi và một số nơi khác.
Trước khi chuyển biến thành ung thư, từ giai đoạn nhiễm HPV type 16, tế bào cịn phải trải qua các giai đoạn tổn thương trong tế bào biểu mơ cổ tử cung hay
nghịch sản cổ tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasia -CIN). Tuỳ mức độ nặng
nhẹ mà người ta chia CIN thành ba loại: CIN I, CIN II và CIN III, trong đĩ CIN III tổn thương nặng nhất. Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng, hiện tượng chèn gen
của HPV type 16 chỉ xảy ra ở trường hợp bị CIN II, III và ở ung thư cổ tử cung, cịn CIN I chỉ hiện diện DNA virut dưới dạng episome [29].
Một vài thống kê cho thấy, đối với những bệnh nhân đang ở giai đoạn CIN I thì cĩ khoảng 60% trường hợp tự thối biến, 30% vẫn giữ nguyên tình trạng, 10% tiến triển thành CIN III và trong đĩ 1% trở thành ung thư. Với CIN II, 40% tự thối biến, 40% giữ nguyên tình trạng, 20% tiến triển thành CIN III và trong đĩ 5% chuyển sang ung thư. Đối với CIN III, cĩ 33% tự thối biến và hơn 12% chuyển thành ung thư [43].
Bảng 1.1: Tỷ lệ tiến triển của các giai đoạn CIN sang ung thư cổ tử cung
Diễn biến tế bào
Trạng thái tế bào Tự thối biến (%) CIN I (%) CIN II (%) CIN III (%) Chuyển từ CIN III sang ung thư
(%)
CIN I 60 30 10 1
CIN II 40 40 20 5
CIN III 33 67 12
Theo một nghiên cứu khác về mối tương quan giữa tỉ lệ gắn chèn và mức độ tổn thương CIN trong tế bào cổ tử cung, hiện tượng gắn chèn xuất hiện trong 4.5% trường hợp CIN II, 15.6% đối với CIN III và cao nhất là 87.5% đối với bệnh nhân đã bị ung thư cổ tử cung [34].
1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen người hiện nay hiện nay
Trên thế gới, Feng Wang-Johanning và cộng sự (2002), nghiên cứu về định lượng DNA và RNA của gene E6 và E7 HPV type 16 bằng kỹ thuật Realtime PCR đã đưa ra kết luận: Sử dụng Kit STAT-60 (Tel – Test Int., Friendswood, TX) để
tách chiết tế bào thu nhận DNA và RNA. Trình tự mồi: với HPV-16 E6: mồi xuơi: 5’-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3’, mồi ngược: 5’-TCATGTATAGTTGTTTG CAGCTCTGT-3’, Probe: 5’-FAM-AGGAGCGACCCGGAAAGTTACCACAGTT -BHQ-3’; với HPV-16 E7: mồi xuơi: 3’-AAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-3’,
mồi ngược: GCCCATTAACAGGTCTTCCAAA-3’, Probe: 5’-FAM-
TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTA-BHQ-3’. Phản ứng Realtime PCR với thể tích 25µl gồm: 1X Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 100 nM mồi xuơi, 100 nM mồi ngược và 150 nM probe. Chương trình luân nhiệt: 94°C – 1 phút; 94°C - 30 giây, 55°C – 30 giây, 72°C – 30 giây, lặp lại 40 chu kỳ [20].
Panu Peitsaro và cộng sự (2002), khi nghiên cứu về tiền ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra bằng kỹ thuật Realtime PCR, đã đưa ra: Tế bào tách chiết theo quy trình của Kurvinen, cĩ bổ sung enzyme proteinase K. Trình tự mồi: Probe
16E6PRO 5’-(6-FAM)-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-(DQ)-3’,
Mồi 1, 16E6F 5’-GAGAACTGCAATGTTTCAGGACC-3’; Mồi 2, 16E6R 5’- GTATAGTTGTTTGCAGCTCTGTGC-3’. Thực hiện phản ứng Realtime PCR một bước với 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (PEApplied Biosystems, Perkin- Elmer), nồng độ mỗi mồi và probe cuối cùng là 0.15µM và 0.05µM, chương trình luân nhiệt: 50°C - 2 phút; 95°C - 10 phút; 95°C – 15 giây, 60°C – 60 giây, lặp lại 40 chu kỳ [44].
Tại Việt Nam, hiện ghi nhận rất ít những cơng bố về nghiên cứu phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 cũng như các type khác thuộc nhĩm “nguy
cơ cao” vào bộ gen người. Nguyễn Văn Hưng và cộng sự (2009), nghiên cứu “Xây
dựng quy trình Realtime RT-PCR xác định mRNA E6 và E7 của Human papilloma
virus (HPV) 16 và 18” cho thấy: Tế bào được tách chiết theo phương pháp sử dụng
sau đĩ xử lý dịch tách chiết với Dnase. Mồi và probe khuếch đại gen E6 cĩ trình tự sau: E6-16f: 5’ – GAGAACTGCAATGTTTCAGGA; E6-16r: 5’ – TGTATAGTTG TTTGCAGCTCTG – 3’; Probe E6-16: 5’-FAM GAGCGACCCAGAAAGTTACC ACAGTT– TAMRA-3’.
Mồi và probe khuếch đại gen E7 cĩ trình tự: E7-16f: 5’ – TTGCAAGTGTGACTCTACGCTT – 3’; E7-16r: 5’ – GTGTGCCCATTAACAG GTCTT – 3’; Probe E7-16: 5’-FAM TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATT C– TAMRA-3’.
Phản ứng được thực hiện trên máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương
trình nhiệt bao gồm 250C- 5’ (1 chu kỳ), 420C- 30’ (1 chu kỳ), 850C- 5’ (1 chu kỳ)
và 950C- 5’ (1 chu kỳ) và 40 chu kỳ lặp lại với 950C- 15’’, 600C- 1’. Thể tích hỗn
hợp phản ứng PCR realtime là 50 µl bao gồm: 1× dung dịch đệm PCR, 100 nmol/L mồi và mẫu dị, 400 µmol/L mỗi loại dATP, dGTP, dCTP và dTTP, 1.5 units hot-
start Taq DNA polymerase, 3 mmol/L MgCl2. Thể tích hỗn hợp phản ứng RT là
20µl bao gồm: 1× dung dịch đệm RT, 20 units RNase Inhibitor, 0,2 µg Random hexamer, 200 units M-MuLV Reverse Transcriptase và 100 ng - 5 µg RNA [3].
1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới 1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới
Hiện tại, trên tồn thế giới cĩ khoảng 630 triệu người nhiễm HPV, phụ nữ nhiễm nhiều hơn nam giới [18, 52]. Tại Mỹ, cĩ khoảng 40% phụ nữ trẻ nhiễm HPV trong vịng 3 năm sau khi cĩ quan hệ tình dục. Trên tồn thế giới, cĩ khoảng 50% đến 80% phụ nữ cĩ quan hệ tình dục bị nhiễm HPV ít nhất là một lần trong đời [16, 33]
Thơng thường phụ nữ nhiễm HPV vào những năm cuối tuổi vị thành niên đến đầu những năm 30 tuổi. Tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất vào thời điểm mới bắt đầu cĩ quan hệ tình dục ở các em gái và phụ nữ trẻ dưới 25. Trong hầu hết các trường hợp, ung thư cổ tử cung được phát hiện ở độ tuổi muộn, thường là sau tuổi 40 và số
ca phát hiện cao nhất là ở độ tuổi khoảng 45. Như vậy, cĩ một thời kỳ dài kể từ khi nhiễm vi rút và tiến triển thành ung thư [17, 41].
Hàng năm, khoảng một nửa triệu ca mới nhiễm ung thư cổ tử cung được chẩn đốn, khoảng một nửa trong số đĩ chưa từng được sàng lọc ung thư cổ tử cung trước đĩ.
Hình 1.5: Sơ đồ biểu diễn phân bố tỉ lệ bị ung thư cổ tử cung trên thế giới Trên tồn thế giới, hàng năm trên 250 ngàn phụ nữ tử vong vì căn bệnh này. Tại vùng cận sa mạc Saharan Châu Phi, Mỹ La tinh và Nam Á, số người nhiễm mới và tỷ lệ tử vong cao nhất. Tỷ lệ tử vong tại các nước đang phát triển cao gấp 4 lần tại các nước cơng nghiệp. Cĩ khoảng 80% - 85% ca tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra tại các nước đang phát triển [11, 22].
1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam
Ung thư cổ tử cung rất thường gặp, chiếm tỷ lệ khoảng 12% của tất cả các loại ung thư ở phụ nữ và là một trong hai loại ung thư cĩ tỉ lệ cao nhất ở Việt Nam. Tại Hà Nội, năm 1994, ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ tư ở nữ, với tỷ lệ 7.7/100.000 [1]. Theo ghi nhận của Nguyễn Chấn Hùng và Cs (1998), tại Thành
phố Hồ Chí Minh năm 1997, ung thư cổ tử cung là loại ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ, chiếm tỷ lệ 28% tổng số ung thư các loại, với tỷ lệ 26.8/100.000 [2].
Tại Thừa Thiên Huế, giai đoạn 2001 – 2003, theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Thăng và Cs (2005), tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung là 5.1/100.000 [7].
Theo số liệu thống kê của bệnh viện Ung bứu Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2005, cả nước cĩ thêm 4471 người mắc bệnh ung thư cổ tử cung. Theo Globocan, riêng năm 2002, Việt Nam cĩ 6224 phụ nữ mắc bệnh và 3334 phụ nữ tử vong vì căn bệnh này [66].
Theo kết quả nghiên cứu về tình hình mắc ung thư ở phụ nữ của Bệnh viện K trong giai đoạn 1998 – 2007; tại Hà Nội, tỷ lệ mới mắc chuẩn trung bình hàng năm của ung thư cổ tử cung là 6.8/100.000. Trong giai đoạn 2001-2004 tại Cần Thơ, ung