4. Ý nghĩa thực tiễn
3.2.1.Nghiên cứu nồng độ enzym DNas eI xử lý dịch mẫu sau tách chiết
RNA của chứng dương được tách chiết theo phương pháp tủa trong phenol/chloroform. Để loại bỏ hồn tồn DNA trong dung dịch mẫu sau tách chiết, enzym DNase I được sử dụng với các nồng độ khác nhau. Đề tài tiến hành thực hiện phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I với dịch sau tách chiết, kèm theo chứng âm và thu được kết quả thể hiện tại hình 3.2
Hình 3.2: Phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I
Kết quả hình 3.2 cho thấy: chứng nội luơn xuất hiện vạch 400bp, điều này chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng ức chế phản ứng; chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng nhiễm chéo. Chứng dương 2 và 3 khơng xuất hiện vạch của gen E6 và E7 chứng tỏ khơng cịn DNA cĩ chứa gen E6 và E7 cịn sĩt lại sau tách chiết. Tuy nhiên, tại mẫu chứng dương 1 cĩ xuất hiện vạch tại 287bp và 183bp tương ứng kích thước khuếch đại của gen E6 và E7. Điều này khẳng định DNA cĩ chứa gen E6 và E7 vẫn cịn sĩt lại sau tách chiết. DNA này cĩ thể là từ DNA của người đã bị gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 hoặc DNA của bộ gen HPV type 16. Hai gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người sẽ phiên mã tạo mRNA và dịch mã tạo protein ung gây ung thư. Trong khi đĩ, gen E6 và E7 tồn tại trong bộ gen HPV type 16 khơng thể phiên mã tạo mRNA và dịch mã tạo protein do bị khĩa bởi gen E2 của virut.
Mặt khác, mục tiêu của quy trình là xác định cĩ hay khơng cĩ hiện tượng gắn chèn gen E6 và E7 gây ung thư cổ tử cung của HPV type 16 vào bộ gen người. Do vậy, trong quá trình tách chiết nếu khơng loại bỏ hồn tồn DNA từ HPV type 16 thì kết quả cĩ thể là dương tính giả do sản phẩm được khuếch đại từ gen E6 và E7 của HPV type 16 bị tách rời khỏi bộ gen virut, nằm tự do trong mơi trường phản ứng, khong phai được khuếch đại từ gen đã được gắn chèn.
Để loại bỏ hồn tồn DNA cịn sĩt lại sau tách chiết nhằm loại bỏ khả năng dương tính giả, dịch sau tách chiết phải được xử lý với enzym DNase I.
Từ mẫu chứng dương cho kết quả dương tính khi phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 với phản ứng multiplex PCR khơng qua xử lý DNA được lựa chọn và tiến hành khảo sát nồng độ enzym DNase I xử lý.
Nồng độ DNase I khảo sát theo dãy gradient 1, 2, 3, 4 và 5U/phản ứng, sau đĩ thực hiện phản ứng multiplex PCR, kết quả được ghi nhận qua hình 3.3
Hình 3.3: Khảo sát nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nồng độ 1U/phản ứng; 2: nồng độ 2U/phản ứng; 3: nồng độ 3U/phản ứng; 4: nồng độ 4U/phản ứng; 5: nồng độ 5U/phản ứng.
Qua hình 3.3, tại nồng độ enzym DNase I 1U/phản ứng vẫn xuất hiện vạch tại 287bp và 183bp của gen E6 và E7 với kích thước như thiết kế, nhưng nồng độ enzym DNase I từ 2U/phản ứng trở lên thì khơng cịn xuất hiện vạch của gen E6 và E7 của HPV type 16.
Như vậy, nhằm tiết kiệm enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết, đề tài lựa chọn nồng độ enzym DNase I thích hợp 2U DNase I/phản ứng.
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi
Nhiệt độ lai thấp sẽ tạo các vạch ký sinh hoặc bắt cặp khơng chuyên biệt, gây hiện tượng dương tính giả, nhiệt độ lai cao làm giảm hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuơn và cĩ thể gây nên hiện tượng âm tính giả.
Đề tài tiến hành khảo sát nhiệt độ lai theo dãy nhiệt độ: 50; 50.7; 52; 53.9; 56; 58.3; 59.4; 600C và thu được kết quả tại hình 3.4 và bảng 3.6
Hình 3.4: Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi
T 1 2 3 4 5 6 7 8 T 1 2 T 3 4 5
400 287 183
Ghi chú: 1: 500C; 2: 50.70C; 3: 520C; 4: 53.90C;
5: 560C; 6: 58.30C; 7: 59.40C; 8: 600C
Bảng 3.6: Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi
Nhiệt độ lai (0C) 50 50,7 52 53,9 56 58,3 59,4 60
Kết quả + + + ++ ++++ +++ ++ +
Ghi chú: + xuất hiện vạch sau điện di ++ vạch sau điện di đậm
+++ vạch sau điện di rất đậm ++++ vạch sau điện di rất đậm và nét Vạch của gen E6 và E7 xuất hiện tại tất cả các nhiệt độ lai đem khảo sát, cường độ tín hiệu vạch đậm dần từ 500C tới 560C và giảm dần từ 560C tới 600C. Tuy nhiên, nhiệt độ lai trong khảo sát tại 560C (giếng 5) cho tín hiệu vạch của gen E6 và E7 đậm và rõ nét nhất.
Như vậy, 560C là nhiệt độ lai tối ưu của hệ mồi.