4. Ý nghĩa thực tiễn
2.4.7.7. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
Tiến hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các đối tượng khác nhau cĩ thể cĩ mặt trong dịch phết cổ tử cung như: DNA của người khơng bị ung thư cổ tử cung (được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện đa khoa Cần Thơ); HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli,
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae (được cung cấp từ Cơng ty cổ phần
cơng nghệ Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh), kèm theo mẫu chứng dương.
Quy trình sẽ đặc hiệu khi cho kết quả dương tính với mẫu chứng dương và âm tính với các đối tượng cịn lại.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4.8. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch phết cổ tử cung bệnh phẩm thu thập tại Tp. Buơn Ma Thuột
Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR đã nghiên cứu trên 86 mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buơn Ma Thuột – Đăk Lăk, qua đĩ xác định sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Qua nghiên cứu và thực hiện đề tài, chúng tơi đi tới một số kết luận sau: 1. Thiết kế thành cơng hệ mồi phát hiện đặc hiệu sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
2. Thiết kế thành cơng chứng nội nhằm kiểm sốt nội phản ứng.
3. Bước đầu xây dựng thành cơng các điều kiện của quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR
- Nồng độ enzym DNase I thích hợp cho xử lý DNA cịn sĩt lại sau tách chiết: 2 U/phản ứng.
- Nhiệt độ lai tối ưu của phản ứng: 560C.
- Nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng tại 400nM với cặp mồi E6f-E6r và 500nM với cặp mồi E7f-E7r.
- Nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng: 3mM
- Nồng độ dNTP tối ưu cho phản ứng: 200µM
- Độ nhạy của quy trình 103 bản sao mRNA E6 và E7/ml
- Quy trình nghiên cứu đặc hiệu cho phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
4. Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại của qui trình đã khẳng định sản phẩm khuếch đại thuộc gen E6 và E7 của HPV type 16 do gắn chèn vào bộ gen người. 5. Kiểm chứng quy trình trên 86 mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buơn Ma Thuột và đã phát hiện 1 mẫu thu tại phịng khám số 120 Hồ Tùng Mậucĩ gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
4.2. Kiến nghị
Nhằm hồn thiện và nâng cao hiệu quả phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đề tài cĩ một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện đánh giá hiệu lực sơ cấp và thứ cấp của quy trình nhằm tạo KIT để ứng dụng cho chẩn đốn tiền ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR.
2. Mở rộng nghiên cứu hồn thiện quy trình chẩn đốn tiền ung thư cổ tử cung trên các HPV type khác thuộc nhĩm type "nguy cơ cao" gây ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR.
Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của HPV type 16 HPV type 16
3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi
Sau khi thiết kế và kiểm tra mồi bằng phần mền ClustalX 1.81 (EMBL, Châu Âu) và Annhyb 4.922 (Olivier Friard, Hoa Kỳ), trình tự mồi được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thiết kế mồi
Ký hiệu
mồi
Tên mồi Trình tự mồi 5’ – 3’ Vị trí trên
gen Gen
Kích thước sản phẩm
(bp) E6f Mồi xuơi CACAGAGCTGCAAACAACTATACA 116–139
E6 287 E6r Mồi ngược GACACAGTGGCTTTTGACAGT 402–382
E7f Mồi xuơi AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 91–110
E7 183 E7r Mồi ngược GCACACAATTCCTAGTGTGC 273-254
Qua bảng 3.1 cho thấy mồi xuơi E6f cĩ vị trí từ nucleotide 116 tới nucleotide 139 và mồi ngược E6r cĩ vị trí từ nucleotide 420 tới nucleotide 382 của gen E6. Cặp mồi E6f – E6r khuếch đại một đoạn DNA cĩ kích thước 287 bp. Mồi xuơi E76f cĩ vị trí từ nucleotide 91 tới nucleotide 110 và mồi ngược E7r cĩ vị trí từ nucleotide 273 tới nucleotide 254 của gen E76. Cặp mồi E76f – E76r khuếch đại một đoạn DNA cĩ kích thước 183 bp.
Thơng tin về đặc tính và cấu trúc thứ cấp của mồi thể hiện qua bảng 3.2; 3.3 và 3.4.
Bảng 3.2. Đặc tính của hệ mồi thiết kế Đặc tính mồi Tên mồi Chiều dài mồi (bp) Tm ( 0 C) %GC E6f 24 55.4 41.7 E6r 21 55.6 47.6 E7f 21 56.9 55 E7r 20 54.3 50
Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế
Đặc tính mồi Tên mồi
Hairpin loop Self-dimer
(kcal/mole) Năng lượng (kcal/mole) Tm (0C) E6f -0.29 29.20 -7.05 E6r 0.34 19.9 -3.30 E7f -1.19 38.3 -6.34 E7r -4.69 40.5 -9.73
Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế
Tên mồi E6f E6r E7f E7r
E6f -7.05 -5.84 -7.91 -5.25
E6r -3.3 -4.74 -5.25
E7f -6.34 -6.24
E7r -9.73
Thơng qua bảng 3.2; chiều dài, nhiệt độ biến tính và %GC của các mồi thiết kế đều đạt theo tiêu chuẩn thiết kế mồi. Đặc biệt, nhiệt độ biến tính của các mồi chênh lệch nhau khơng cao và nhiệt độ biến tính trung bình của các mồi là 55.50C.
Sự chênh lệch nhiệt độ biến tính của các mồi khơng cao là điều kiện thuận lợi cho mồi bắt cặp với mạch khuơn đạt hiệu quả cao.
Cấu trúc thứ cấp của mồi là các cấu trúc được hình thành ngay khi ở trạng thái bình thường như cấu trúc hairpin loop (cấu trúc kẹp tĩc), Self-dimer (sự tự bắt cặp của mồi), hetero-dimer (sự bắt cặp của mồi này với mồi khác),.. Các cấu trúc này cĩ thể bị phá hủy bởi nhiều tác nhân như nhiệt độ,… Sự hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi sẽ làm giảm hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuơn; do vậy, làm giảm hiệu quả khuếch đại sản phẩm trong phản ứng PCR.
Qua bảng 3.3, đặc tính cấu trúc kẹp tĩc của mồi (hairpin loop) phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế mồi. Mức năng lượng tạo thành cấu trúc kẹp tĩc của các mồi đều >-9 kcal/mole; do vậy, cấu trúc này dễ dàng bị phá vỡ bởi nhiệt. Mặt khác, nhiệt độ biến tính của các cấu trúc kẹp tĩc thấp hơn nhiệt độ biến tính của mồi. Điều này khẳng định, tại nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và mạch khuơn thì cấu trúc kẹp tĩc của mồi đã bị phá hủy và hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuơn khơng bị ảnh hưởng bởi cấu trúc này. Bên cạnh đĩ, năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E6f, E6r và E7f đều >-9 kcal/mole phù hợp với tiêu chuẩn lý thuyết nhưng năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole). Tuy nhiên, mức năng lượng tạo cấu trúc này khơng vượt quá cao so với tiêu chuẩn và cĩ thể phá vỡ nhờ tăng nhiệt độ tại bước gắn mồi. Do vậy, đề tài vẫn lựa chọn và bằng thực nghiệm đã cho thấy cặp mồi E7 vẫn hoạt động bình thường.
Tại bảng 3.4, cũng tương tự, mức năng lượng tạo cấu trúc thứ cấp hetero- dimer của mồi E6f, E6r và E7f đạt tiêu chuẩn thiết kế. Ngoại trừ năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole). Tuy vậy, sự chênh lệch này khơng quá cao và bằng thực nghiệm cũng cho thấy cặp mồi E7 hoạt động bình thường.
Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi về mặt lý thuyết bằng phần mền trực tuyến BLAST trên NCBI cho thấy: mồi xuơi E6f và mồi ngược E6r chỉ tương đồng với các trình tự gen E6 của HPV type 16 được cơng bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, mức độ tương đồng là 100%, chỉ số nhận diện mức độ tương đồng là 100%; mồi xuơi E7f và mồi ngược E7r chỉ tương đồng với các trình tự gen E7 của HPV type 16 được cơng bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, với mức độ tương đồng là 100%, chỉ số nhận diện mức độ tương đồng là 100% (phụ lục 1). Như vậy, hệ mồi thiết kế là đặc hiệu cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16.
Từ các kết quả trên về mặt lý thuyết, đề tài đã thiết kế cặp mồi E6f-E6r và E7f-E7r đạt tiêu chuẩn cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16. Cặp mồi đạt tiêu chuẩn được lựa chọn và gửi tổng hợp tại Cơng ty IDT (Hoa Kỳ).
3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế
Sau khi tách chiết RNA của chứng dương đã xác định ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra, tiến hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR và thu được kết quả thể hiện qua hình 3.1
Hình 3.1. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế
Ghi chú: N: chứng âm; T: thang 100 bp; CD1, CD2, CD3: chứng dương 1, 2, 3
Kết quả cho thấy, trong mỗi phản ứng, chứng nội luơn xuất hiện vạch cĩ kích thước 400bp như thiết kế, các mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) xuất hiện 2
400 287 183
vạch, một cĩ kích thước 287bp (của gen E6) và một cĩ kích thước 183bp (của gen E7) đúng như mong muốn. Các vạch đều rõ nét và khơng cĩ băng ký sinh.
Như vậy, chứng nội hoạt động bình thường và sau điện di cho vạch cĩ kích thước đúng như thiết kế. Cặp mồi thiết kế cĩ khả năng khuếch đại đoạn DNA cĩ kích thước 287bp của gen E6 và 183bp của gen E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người, các vạch đều rõ nét và khơng cĩ băng ký sinh.
3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau khi gửi 2 sản phẩm khuếch đại ký hiệu E6_E6 (khuếch đại từ gen E6) và E7_E7 (khuếch đại từ gen E7) của mẫu chứng dương CD1 được gửi tới cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự, mỗi sản phẩm khuếch đại giải trình tự cả 2 mạch. Kết quả được trình bày qua bảng 3.5 và phụ lục 3.
Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người
Ký hiệu mẫu giải Tên mạch giải Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Kích thước giải được (bp) Kích thước thiết kế (bp) E6_E6 Mạch xuơi GNNTACTNNGNTNGANGGTGTGTACTGCAGCA ACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGC TTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGG GAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAA GTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTAT TGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAG CAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATT AGG 234 287 Mạch ngược NNNNCNNGNANATNANCACACAACGGTTTGTT GTATTGCTGTTCNAATGTTGTTCCATACAAACT ATAACAATAATGTCTATACTCACTAATTTTAGA ATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATA TGGATTCCCATCTCTATATACTATGCATAAATC CCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCA GTAACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATA TTATTTCA 237
E7_E7 Mạch xuơi NNGGNNNGANAGNNTGANAGCAGAACCGGAC AGAAGCCCATTTACAATTATTGTAACCTTTTGT TGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGA AGAC 134 183 Mạch ngược ANNNTNAGNCTNAGTACGATGTCTACGTGTGT GCTTTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCAC ACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGG GCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTGGACCA TCTA 134
Ghi chú: N: nucleotide khơng xác định.
Qua bảng 3.5 cho thấy kích thước giải trình tự thu được của 2 sản phẩm đều thấp hơn so với kích thước thiết kế. Kích thước trong thiết kế đối với khuếch đại đoạn gen E6 là 287bp nhưng kích thước giải trình tự thu được của mẫu E6_E6 với mạch xuơi là 234bp, mạch ngược là 237bp. Tương tự, kích thước thiết kế khuếch đại đoạn gen E7 là 183bp nhưng kích thước giải trình tự thu được của mẫu E7_E7 với mạch xuơi và mạch ngược là 134bp. Cĩ sự chênh lệch và số nucleotic là do trong kỹ thuật giải trình tự, các nucleotide của các mồi sẽ khơng được giải lại. Mặt khác, một số nucleotide đầu tiên trong quá trình giải thường bị nhiễu tín hiệu, khơng xác định chính xác tên loại nucleotide và được ký hiệu là N. Do vậy, sản phẩm giải trình tự thu được sẽ cho kích thước nhỏ hơn so với sản phẩm trong thiết kế và khuếch đại.
Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng phần mềm ClustalX 1.81 cho thấy: trình tự nucleotide giải được của mạch xuơi, mạch ngược mẫu E6_E6 và E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm và thuộc gen E6 (vị trí từ nucleotide 116 tới 402) do HPV type 16 gắn chèn. Tương tự như vậy, trình tự nucleotide giải được của mạch xuơi, mạch ngược mẫu E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm thuộc gen E7 (vị trí từ nucleotide 273 tới 91) của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người (phụ lục 4).
Ngồi ra, nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm khuếch đại với các trình tự gen được cơng bố, đề tài sử dụng phần mềm BLAST để tìm kiếm các trình tự gen được cơng bố trên NCBI tương đồng với sản phẩm giải trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm giải trình tự chỉ tương đồng với các trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 với mức độ tương đồng 99% đối với sản phẩm khuếch đại từ gen E6 và 98% đối với sản phẩm khuếch đại từ gen E7 (phụ lục 5).
Như vậy, bằng lý thuyết và thực nghiệm đều cho thấy, sản khuếch đại là của gen E6 và E7 của HPV type 16 do gắn chèn và quy trình nghiên cứu phát hiện đặc hiệu sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR
3.2.1. Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết
RNA của chứng dương được tách chiết theo phương pháp tủa trong phenol/chloroform. Để loại bỏ hồn tồn DNA trong dung dịch mẫu sau tách chiết, enzym DNase I được sử dụng với các nồng độ khác nhau. Đề tài tiến hành thực hiện phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I với dịch sau tách chiết, kèm theo chứng âm và thu được kết quả thể hiện tại hình 3.2
Hình 3.2: Phản ứng Multiplex PCR trên 3 mẫu chứng dương chưa xử lý enzym DNase I
Kết quả hình 3.2 cho thấy: chứng nội luơn xuất hiện vạch 400bp, điều này chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng ức chế phản ứng; chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ khơng cĩ hiện tượng nhiễm chéo. Chứng dương 2 và 3 khơng xuất hiện vạch của gen E6 và E7 chứng tỏ khơng cịn DNA cĩ chứa gen E6 và E7 cịn sĩt lại sau tách chiết. Tuy nhiên, tại mẫu chứng dương 1 cĩ xuất hiện vạch tại 287bp và 183bp tương ứng kích thước khuếch đại của gen E6 và E7. Điều này khẳng định DNA cĩ chứa gen E6 và E7 vẫn cịn sĩt lại sau tách chiết. DNA này cĩ thể là từ DNA của người đã bị gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 hoặc DNA của bộ gen HPV type 16. Hai gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người sẽ phiên mã tạo mRNA và dịch mã tạo protein ung gây ung thư. Trong khi đĩ, gen E6 và E7 tồn tại trong bộ gen HPV type 16 khơng thể phiên mã tạo mRNA và dịch mã tạo protein do bị khĩa bởi gen E2 của virut.
Mặt khác, mục tiêu của quy trình là xác định cĩ hay khơng cĩ hiện tượng gắn chèn gen E6 và E7 gây ung thư cổ tử cung của HPV type 16 vào bộ gen người. Do vậy, trong quá trình tách chiết nếu khơng loại bỏ hồn tồn DNA từ HPV type 16 thì kết quả cĩ thể là dương tính giả do sản phẩm được khuếch đại từ gen E6 và E7 của HPV type 16 bị tách rời khỏi bộ gen virut, nằm tự do trong mơi trường phản ứng, khong phai được khuếch đại từ gen đã được gắn chèn.
Để loại bỏ hồn tồn DNA cịn sĩt lại sau tách chiết nhằm loại bỏ khả năng dương tính giả, dịch sau tách chiết phải được xử lý với enzym DNase I.
Từ mẫu chứng dương cho kết quả dương tính khi phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 với phản ứng multiplex PCR khơng qua xử lý DNA được lựa chọn và tiến hành khảo sát nồng độ enzym DNase I xử lý.
Nồng độ DNase I khảo sát theo dãy gradient 1, 2, 3, 4 và 5U/phản ứng, sau đĩ thực hiện phản ứng multiplex PCR, kết quả được ghi nhận qua hình 3.3
Hình 3.3: Khảo sát nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết