4. Ý nghĩa thực tiễn
3.2.3.Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng PCR
Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính tốn tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại ký sinh, ngược lại hiệu quả khuếch đại của phản ứng khơng cao.
Ngồi ra, trong phản ứng PCR thường xảy ra việc các cặp mồi cạnh tranh nhau nên hiệu quả phản ứng PCR trên mỗi cặp mồi sẽ khơng cao; do đĩ, việc tối ưu nồng độ mỗi mồi trong phản ứng PCR là cần thiết.
Đề tài tiến hành khảo sát nồng độ của mỗi cặp mồi từ 100nM tới 500nM và thu được kết quả qua hình 3.5
Ghi chú: Hình 3.5 B: T: thang DNA 100bp; 11: 300nM mồi E6f-E6r, 100nM mồi
E7f-E7r; 12: 300nM mồi E6f-E6r, 200nM mồi E7f-E7r; 13: 300nM mồi E6f-E6r, 300nM mồi E7f-E7r; 14: 300nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 15: 300nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r; 16: 400nM mồi E6f-E6r, 100nM mồi E7f-E7r;
17: 400nM mồi E6f-E6r, 200nM mồi E7f-E7r; 18: 400nM mồi E6f-E6r, 300nM mồi
E7f-E7r; 19: 400nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 20: 400nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r.
Hình 3.5F: T: thang DNA 100bp; 41: 500nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 42:
400nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 43: 300nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f- E7r; 44: 200nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 45: 100nM mồi E6f-E6r, 400nM mồi E7f-E7r; 46: 500nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r; 47: 400nM mồi E6f-E6r,
500nM mồi E7f-E7r; 48: 300nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r; 49: 200nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r; 50: 100nM mồi E6f-E6r, 500nM mồi E7f-E7r.
Bảng 3.7: Khảo sát nồng độ hệ mồi trong phản ứng
Mồi Tỷ lệ mồi
Mồi E6f – E6r (nM)
Mồi E7f - E7r (nM) Kết quả Gen E6 Gen E7 1:1 100 100 + - 1:2 200 + + 1:3 300 + + 1:4 400 + + 1:5 500 + + 2:1 200 100 + - 2:2 200 + + 2:3 300 + + 2:4 400 + +
2:5 500 + + 3:1 300 100 + - 3:2 200 + + 3:3 300 + + 3:4 400 + + 3:5 500 + + 4:1 400 100 + - 4:2 200 + + 4:3 300 + + 4:4 400 + + 4:5 500 ++ ++ 5:1 500 100 + - 5:2 200 + + 5:3 300 + + 5:4 400 + + 5:5 500 + + 1:1 100 100 + - 2:1 200 + - 3:1 300 + - 4:1 400 + - 5:1 500 + - 1:2 100 200 + + 2:2 200 + + 3:2 300 + + 4:2 400 + + 5:2 500 + +
1:3 100 300 + + 2:3 200 + + 3:3 300 + + 4:3 400 + + 5:3 500 + + 1:4 100 400 + + 2:4 200 + + 3:4 300 + + 4:4 400 + + 5:4 500 + + 1:5 100 500 + + 2:5 200 + + 3:5 300 + + 4:5 400 ++ ++ 5:5 500 + +
Ghi chú: + xuất hiện vạch sau điện di - khơng xuất hiện vạch sau điện di ++ vạch sau điện di rất đậm và rõ nét
Hình 3.5 và bảng 3.7 cho thấy: kết quả điện di đều xuất hiện vạch của gen E6 đúng như thiết kế tại tất cả các nồng độ của cặp mồi E6f-E6r đem khảo sát, cường độ tín hiệu vạch sau điện di đậm dần theo dải tăng nồng độ của cặp mồi E6f-E6r. Ngược lại, nồng độ của cặp mồi E7f-E7r tại 100nM trong khảo sát khơng cho tín hiệu vạch của gen E7. Điều này cĩ thể là do nồng độ mồi quá thấp chưa đủ khuếch đại gen E7 tạo ra số lượng lớn bản hoặc cĩ sự cạnh tranh giữa cặp mồi E6 với cặp mồi E7f-E7r hoặc do sự ức chế giữa các mồi với nhau. Tuy nhiên, nồng độ của cặp mồi E7f-E7r từ 200nM trở lên trong mỗi phản ứng đem khảo sát đều cho tín hiệu
vạch của gen E7 đúng như mong muốn. Tín hiệu vạch của gen E7 đậm dần từ 200 tới 400nM và mờ hơn tại nồng độ 500nM.
Về đánh giá chung hiệu quả khuếch đại của 2 cặp mồi trong một phản ứng đã cho thấy, tại nồng độ 400nM của cặp mồi E6f-E6r và 500nM của cặp mồi E7f-E7r
(giếng 20 của hình 3.5B và giếng 47 của hình 3.5F) đều cho tín hiệu vạch khuếch
đại của gen E6 và E7 đậm, rõ nét nhất.
Do vậy, đề tài lựa chọn nồng độ cặp mồi E6f-E6r tại 400nM và cặp mồi E7f- E7r tại 500nM là nồng độ tối ưu của hệ mồi trong phản ứng.
3.2.4. Khảo sát nồng độ Mg2+
Nồng độ Mg2+ ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNA khuơn mẫu, quá trình ủ của mồi, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq DNA polymerase và độ chính xác của kết quả. Nồng độ Mg2+ quá cao sẽ làm cho DNA sợi đơi ổn định hơn. Mặt khác, nĩ cịn làm gia tăng hiện tượng bắt cặp giả dẫn đến suất hiện sản phẩm PCR khơng đặc hiệu với số lượng khá lớn. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp DNA. Do vậy, cần phải tối ưu nồng độ Mg2+ trong mỗi phản ứng nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại và tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.
Nồng độ Mg2+ trong thí nghiệm được khảo sát tại các nồng độ: 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0; 4.5 và 5.0 mM và thu được kết quả qua hình 3.6.
Hình 3.6: Khảo sát nồng độ Mg2+
1 2 3 4 5 T
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nồng độ Mg2+ tại 1.0mM; 2: nồng độ Mg2+ tại 1.5mM;
3: nồng độ Mg2+ tại 2.0mM; 4: nồng độ Mg2+ tại 2.5mM; 5: nồng độ Mg2+ tại 3.0mM; 6: nồng độ Mg2+ tại 3.5mM; 7: nồng độ Mg2+ tại 4.0mM; 8: nồng độ Mg2+
tại 4.5mM; 9: nồng độ Mg2+ tại 5.0 mM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết qủa điện di tại hình 3.6 cho thấy ở tất cả các phản ứng PCR đều cho sản phẩm khuếch đại. Tuy nhiên, sản phẩm khuếch đại rõ và nét nhất khi thực hiện với nồng độ Mg2+ tại 3 mM (giếng 5).
Như vậy, 3 mM là nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng PCR.
3.2.5. Khảo sát nồng độ dNTP
Trong mỗi phản ứng luơn sử dụng nồng độ 4 loại dNTP bằng nhau, nếu hỗn hợp dNTP khơng cân bằng sẽ làm giảm độ chính xác của Taq DNA polymerase.
Trong thí nghiệm, nồng độ 4 loại dNTP tổng cộng trong mỗi phản ứng được khảo sát theo dãy sau: 120; 160; 200; 240 và 280µM và thu được kết quả:
Hình 3.7: Khảo sát nồng độ dNTP
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nồng độ 120µM; 2: nồng độ 160µM; 3: nồng độ
200µM; 4: nồng độ 240µM; 5: nồng độ 280µM
Kết quả khảo sát nồng độ dNTP tại hình 3.7 cho thấy tất cả các nồng độ dNTP trong khảo sát đều xuất hiện vạch như mong muốn, trong đĩ tín hiệu vạch đậm dần theo nồng độ dNTP từ 120 tới 280 µM. Tại nồng độ 120 µM của dNTP
đem khảo sát xuất hiện vạch rất mờ; tín hiệu vạch đậm và rõ nét nhất thể hiện tại nồng độ 280 µM (giếng số 5).
Tuy nhiên, nhằm tiết kiệm dNTP, đề tài lựa chọn nồng độ dNTP tối ưu của phản ứng PCR tại 200 µM.
3.2.6. Khảo sát độ nhạy của quy trình
Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của phương pháp chẩn đốn. Độ nhạy cho biết lượng bản sao nhỏ nhất mà một phương pháp cĩ thể cho kết quả dương tính.
Từ mẫu chứng dương đã biết trước mật độ là 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml. Mẫu được tách chiết và pha lỗng bậc 10 liên tiếp tạo thành các mật độ: 106; 105; 104; 103; 102; 101 bản sao mRNA E6 và E7/ml; sau đĩ, thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR. Hình 3.8 và Bảng 3.7 trình bày kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình.
Hình 3.8: Khảo sát độ nhạy của quy trình
Ghi chú: T: thang 100bp; 1: 101; 2: 102; 3: 103; 4: 104; 5: 105 và 6: 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml
Bảng 3.8: Khảo sát độ nhạy của quy trình
Mật độ chứng dương (bản
sao mRNA E6 và E7/ml) 10
6
105 104 103 102 101
Qua hình 3.8 và bảng 3.8 cho thấy vạch mục tiêu của gen E6 và E7 xuất hiện từ mật độ 103 tới 106 bản sao mRNA E6 và E7/ml và cường độ tín hiệu vạch đậm dần theo mật độ tăng dần của mẫu chứng. Tại mật độ 101 và 102 bản sao mRNA E6 và E7/ml khơng cho tín hiệu vạch.
Như vậy, giới hạn phát hiện hay độ nhạy của quy trình là 103 bản sao mRNA E6 và E7/ml.
3.2.7. Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
Nhằm khảo sát độ đặc hiệu của quy trình, đề tài thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các đối tượng cĩ thể cĩ mặt trong dịch phết cổ tử cung như: DNA của người khơng bị ung thư cổ tử cung (được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện đa khoa Cần Thơ), HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae (được cung cấp từ Cơng ty cổ phần cơng nghệ Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh).
Hình 3.9: Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
Ghi chú: CD: chứng dương; T: thang DNA 100bp; N: chứng âm; A: DNA của người
khơng bị ung thư cổ tử cung; B: HPV type 18, C: HPV type 11; D: HPV type 6; E: HPV type 33; F: HPV type 45; G: E.coli; H: Chlamydia trachomatis; K: Neisseria
gonorrhoeae.
Kết quả thể hiện qua hình 3.9 cho thấy chứng nội luơn xuất hiện vạch 400 bp, chứng âm âm tính và quy trình chỉ cho tín hiệu vạch của gen E6, E7 của chứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dương tức từ mẫu của người bị ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra và âm tính với các đối tượng cịn lại trong khảo sát.
Do vậy, bằng thực nghiệm, quy trình nghiên cứu là đặc hiệu cho phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.