4. Ý nghĩa thực tiễn
3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E
HPV type 16
3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi
Sau khi thiết kế và kiểm tra mồi bằng phần mền ClustalX 1.81 (EMBL, Châu Âu) và Annhyb 4.922 (Olivier Friard, Hoa Kỳ), trình tự mồi được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thiết kế mồi
Ký hiệu
mồi
Tên mồi Trình tự mồi 5’ – 3’ Vị trí trên
gen Gen
Kích thước sản phẩm
(bp) E6f Mồi xuơi CACAGAGCTGCAAACAACTATACA 116–139
E6 287 E6r Mồi ngược GACACAGTGGCTTTTGACAGT 402–382
E7f Mồi xuơi AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 91–110
E7 183 E7r Mồi ngược GCACACAATTCCTAGTGTGC 273-254
Qua bảng 3.1 cho thấy mồi xuơi E6f cĩ vị trí từ nucleotide 116 tới nucleotide 139 và mồi ngược E6r cĩ vị trí từ nucleotide 420 tới nucleotide 382 của gen E6. Cặp mồi E6f – E6r khuếch đại một đoạn DNA cĩ kích thước 287 bp. Mồi xuơi E76f cĩ vị trí từ nucleotide 91 tới nucleotide 110 và mồi ngược E7r cĩ vị trí từ nucleotide 273 tới nucleotide 254 của gen E76. Cặp mồi E76f – E76r khuếch đại một đoạn DNA cĩ kích thước 183 bp.
Thơng tin về đặc tính và cấu trúc thứ cấp của mồi thể hiện qua bảng 3.2; 3.3 và 3.4.
Bảng 3.2. Đặc tính của hệ mồi thiết kế Đặc tính mồi Tên mồi Chiều dài mồi (bp) Tm ( 0 C) %GC E6f 24 55.4 41.7 E6r 21 55.6 47.6 E7f 21 56.9 55 E7r 20 54.3 50
Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế
Đặc tính mồi Tên mồi
Hairpin loop Self-dimer
(kcal/mole) Năng lượng (kcal/mole) Tm (0C) E6f -0.29 29.20 -7.05 E6r 0.34 19.9 -3.30 E7f -1.19 38.3 -6.34 E7r -4.69 40.5 -9.73
Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế
Tên mồi E6f E6r E7f E7r
E6f -7.05 -5.84 -7.91 -5.25
E6r -3.3 -4.74 -5.25
E7f -6.34 -6.24
E7r -9.73
Thơng qua bảng 3.2; chiều dài, nhiệt độ biến tính và %GC của các mồi thiết kế đều đạt theo tiêu chuẩn thiết kế mồi. Đặc biệt, nhiệt độ biến tính của các mồi chênh lệch nhau khơng cao và nhiệt độ biến tính trung bình của các mồi là 55.50C.
Sự chênh lệch nhiệt độ biến tính của các mồi khơng cao là điều kiện thuận lợi cho mồi bắt cặp với mạch khuơn đạt hiệu quả cao.
Cấu trúc thứ cấp của mồi là các cấu trúc được hình thành ngay khi ở trạng thái bình thường như cấu trúc hairpin loop (cấu trúc kẹp tĩc), Self-dimer (sự tự bắt cặp của mồi), hetero-dimer (sự bắt cặp của mồi này với mồi khác),.. Các cấu trúc này cĩ thể bị phá hủy bởi nhiều tác nhân như nhiệt độ,… Sự hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi sẽ làm giảm hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuơn; do vậy, làm giảm hiệu quả khuếch đại sản phẩm trong phản ứng PCR.
Qua bảng 3.3, đặc tính cấu trúc kẹp tĩc của mồi (hairpin loop) phù hợp với tiêu chuẩn thiết kế mồi. Mức năng lượng tạo thành cấu trúc kẹp tĩc của các mồi đều >-9 kcal/mole; do vậy, cấu trúc này dễ dàng bị phá vỡ bởi nhiệt. Mặt khác, nhiệt độ biến tính của các cấu trúc kẹp tĩc thấp hơn nhiệt độ biến tính của mồi. Điều này khẳng định, tại nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và mạch khuơn thì cấu trúc kẹp tĩc của mồi đã bị phá hủy và hiệu quả bắt cặp giữa mồi với mạch khuơn khơng bị ảnh hưởng bởi cấu trúc này. Bên cạnh đĩ, năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E6f, E6r và E7f đều >-9 kcal/mole phù hợp với tiêu chuẩn lý thuyết nhưng năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole). Tuy nhiên, mức năng lượng tạo cấu trúc này khơng vượt quá cao so với tiêu chuẩn và cĩ thể phá vỡ nhờ tăng nhiệt độ tại bước gắn mồi. Do vậy, đề tài vẫn lựa chọn và bằng thực nghiệm đã cho thấy cặp mồi E7 vẫn hoạt động bình thường.
Tại bảng 3.4, cũng tương tự, mức năng lượng tạo cấu trúc thứ cấp hetero- dimer của mồi E6f, E6r và E7f đạt tiêu chuẩn thiết kế. Ngoại trừ năng lượng tạo cấu trúc Self-dimer của mồi E7r là -9.73 kcal/mole nhỏ hơn tiêu chuẩn thiết kế của mồi (> -9 kcal/mole). Tuy vậy, sự chênh lệch này khơng quá cao và bằng thực nghiệm cũng cho thấy cặp mồi E7 hoạt động bình thường.
Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi về mặt lý thuyết bằng phần mền trực tuyến BLAST trên NCBI cho thấy: mồi xuơi E6f và mồi ngược E6r chỉ tương đồng với các trình tự gen E6 của HPV type 16 được cơng bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, mức độ tương đồng là 100%, chỉ số nhận diện mức độ tương đồng là 100%; mồi xuơi E7f và mồi ngược E7r chỉ tương đồng với các trình tự gen E7 của HPV type 16 được cơng bố trên cơ sở dữ liệu NCBI, với mức độ tương đồng là 100%, chỉ số nhận diện mức độ tương đồng là 100% (phụ lục 1). Như vậy, hệ mồi thiết kế là đặc hiệu cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16.
Từ các kết quả trên về mặt lý thuyết, đề tài đã thiết kế cặp mồi E6f-E6r và E7f-E7r đạt tiêu chuẩn cho phát hiện gen E6 và E7 của HPV type 16. Cặp mồi đạt tiêu chuẩn được lựa chọn và gửi tổng hợp tại Cơng ty IDT (Hoa Kỳ).
3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế
Sau khi tách chiết RNA của chứng dương đã xác định ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra, tiến hành thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR và thu được kết quả thể hiện qua hình 3.1
Hình 3.1. Đánh giá khả năng khuếch đại của hệ mồi thiết kế
Ghi chú: N: chứng âm; T: thang 100 bp; CD1, CD2, CD3: chứng dương 1, 2, 3
Kết quả cho thấy, trong mỗi phản ứng, chứng nội luơn xuất hiện vạch cĩ kích thước 400bp như thiết kế, các mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) xuất hiện 2
400 287 183
vạch, một cĩ kích thước 287bp (của gen E6) và một cĩ kích thước 183bp (của gen E7) đúng như mong muốn. Các vạch đều rõ nét và khơng cĩ băng ký sinh.
Như vậy, chứng nội hoạt động bình thường và sau điện di cho vạch cĩ kích thước đúng như thiết kế. Cặp mồi thiết kế cĩ khả năng khuếch đại đoạn DNA cĩ kích thước 287bp của gen E6 và 183bp của gen E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người, các vạch đều rõ nét và khơng cĩ băng ký sinh.
3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau khi gửi 2 sản phẩm khuếch đại ký hiệu E6_E6 (khuếch đại từ gen E6) và E7_E7 (khuếch đại từ gen E7) của mẫu chứng dương CD1 được gửi tới cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự, mỗi sản phẩm khuếch đại giải trình tự cả 2 mạch. Kết quả được trình bày qua bảng 3.5 và phụ lục 3.
Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người
Ký hiệu mẫu giải Tên mạch giải Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Kích thước giải được (bp) Kích thước thiết kế (bp) E6_E6 Mạch xuơi GNNTACTNNGNTNGANGGTGTGTACTGCAGCA ACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGC TTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGG GAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAA GTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTAT TGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAG CAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATT AGG 234 287 Mạch ngược NNNNCNNGNANATNANCACACAACGGTTTGTT GTATTGCTGTTCNAATGTTGTTCCATACAAACT ATAACAATAATGTCTATACTCACTAATTTTAGA ATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATA TGGATTCCCATCTCTATATACTATGCATAAATC CCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCA GTAACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATA TTATTTCA 237
E7_E7 Mạch xuơi NNGGNNNGANAGNNTGANAGCAGAACCGGAC AGAAGCCCATTTACAATTATTGTAACCTTTTGT TGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGA AGAC 134 183 Mạch ngược ANNNTNAGNCTNAGTACGATGTCTACGTGTGT GCTTTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCAC ACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGG GCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTGGACCA TCTA 134
Ghi chú: N: nucleotide khơng xác định.
Qua bảng 3.5 cho thấy kích thước giải trình tự thu được của 2 sản phẩm đều thấp hơn so với kích thước thiết kế. Kích thước trong thiết kế đối với khuếch đại đoạn gen E6 là 287bp nhưng kích thước giải trình tự thu được của mẫu E6_E6 với mạch xuơi là 234bp, mạch ngược là 237bp. Tương tự, kích thước thiết kế khuếch đại đoạn gen E7 là 183bp nhưng kích thước giải trình tự thu được của mẫu E7_E7 với mạch xuơi và mạch ngược là 134bp. Cĩ sự chênh lệch và số nucleotic là do trong kỹ thuật giải trình tự, các nucleotide của các mồi sẽ khơng được giải lại. Mặt khác, một số nucleotide đầu tiên trong quá trình giải thường bị nhiễu tín hiệu, khơng xác định chính xác tên loại nucleotide và được ký hiệu là N. Do vậy, sản phẩm giải trình tự thu được sẽ cho kích thước nhỏ hơn so với sản phẩm trong thiết kế và khuếch đại.
Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng phần mềm ClustalX 1.81 cho thấy: trình tự nucleotide giải được của mạch xuơi, mạch ngược mẫu E6_E6 và E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm và thuộc gen E6 (vị trí từ nucleotide 116 tới 402) do HPV type 16 gắn chèn. Tương tự như vậy, trình tự nucleotide giải được của mạch xuơi, mạch ngược mẫu E7_E7 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm thuộc gen E7 (vị trí từ nucleotide 273 tới 91) của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen người (phụ lục 4).
Ngồi ra, nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm khuếch đại với các trình tự gen được cơng bố, đề tài sử dụng phần mềm BLAST để tìm kiếm các trình tự gen được cơng bố trên NCBI tương đồng với sản phẩm giải trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm giải trình tự chỉ tương đồng với các trình tự gen E6 và E7 của HPV type 16 với mức độ tương đồng 99% đối với sản phẩm khuếch đại từ gen E6 và 98% đối với sản phẩm khuếch đại từ gen E7 (phụ lục 5).
Như vậy, bằng lý thuyết và thực nghiệm đều cho thấy, sản khuếch đại là của gen E6 và E7 của HPV type 16 do gắn chèn và quy trình nghiên cứu phát hiện đặc hiệu sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ gen người.