4. Ý nghĩa thực tiễn
1.2.5.Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen
hiện nay
Trên thế gới, Feng Wang-Johanning và cộng sự (2002), nghiên cứu về định lượng DNA và RNA của gene E6 và E7 HPV type 16 bằng kỹ thuật Realtime PCR đã đưa ra kết luận: Sử dụng Kit STAT-60 (Tel – Test Int., Friendswood, TX) để
tách chiết tế bào thu nhận DNA và RNA. Trình tự mồi: với HPV-16 E6: mồi xuơi: 5’-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3’, mồi ngược: 5’-TCATGTATAGTTGTTTG CAGCTCTGT-3’, Probe: 5’-FAM-AGGAGCGACCCGGAAAGTTACCACAGTT -BHQ-3’; với HPV-16 E7: mồi xuơi: 3’-AAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-3’,
mồi ngược: GCCCATTAACAGGTCTTCCAAA-3’, Probe: 5’-FAM-
TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTA-BHQ-3’. Phản ứng Realtime PCR với thể tích 25µl gồm: 1X Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 100 nM mồi xuơi, 100 nM mồi ngược và 150 nM probe. Chương trình luân nhiệt: 94°C – 1 phút; 94°C - 30 giây, 55°C – 30 giây, 72°C – 30 giây, lặp lại 40 chu kỳ [20].
Panu Peitsaro và cộng sự (2002), khi nghiên cứu về tiền ung thư cổ tử cung do HPV type 16 gây ra bằng kỹ thuật Realtime PCR, đã đưa ra: Tế bào tách chiết theo quy trình của Kurvinen, cĩ bổ sung enzyme proteinase K. Trình tự mồi: Probe
16E6PRO 5’-(6-FAM)-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-(DQ)-3’,
Mồi 1, 16E6F 5’-GAGAACTGCAATGTTTCAGGACC-3’; Mồi 2, 16E6R 5’- GTATAGTTGTTTGCAGCTCTGTGC-3’. Thực hiện phản ứng Realtime PCR một bước với 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (PEApplied Biosystems, Perkin- Elmer), nồng độ mỗi mồi và probe cuối cùng là 0.15µM và 0.05µM, chương trình luân nhiệt: 50°C - 2 phút; 95°C - 10 phút; 95°C – 15 giây, 60°C – 60 giây, lặp lại 40 chu kỳ [44].
Tại Việt Nam, hiện ghi nhận rất ít những cơng bố về nghiên cứu phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 cũng như các type khác thuộc nhĩm “nguy
cơ cao” vào bộ gen người. Nguyễn Văn Hưng và cộng sự (2009), nghiên cứu “Xây
dựng quy trình Realtime RT-PCR xác định mRNA E6 và E7 của Human papilloma
virus (HPV) 16 và 18” cho thấy: Tế bào được tách chiết theo phương pháp sử dụng
sau đĩ xử lý dịch tách chiết với Dnase. Mồi và probe khuếch đại gen E6 cĩ trình tự sau: E6-16f: 5’ – GAGAACTGCAATGTTTCAGGA; E6-16r: 5’ – TGTATAGTTG TTTGCAGCTCTG – 3’; Probe E6-16: 5’-FAM GAGCGACCCAGAAAGTTACC ACAGTT– TAMRA-3’.
Mồi và probe khuếch đại gen E7 cĩ trình tự: E7-16f: 5’ – TTGCAAGTGTGACTCTACGCTT – 3’; E7-16r: 5’ – GTGTGCCCATTAACAG GTCTT – 3’; Probe E7-16: 5’-FAM TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATT C– TAMRA-3’.
Phản ứng được thực hiện trên máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương
trình nhiệt bao gồm 250C- 5’ (1 chu kỳ), 420C- 30’ (1 chu kỳ), 850C- 5’ (1 chu kỳ)
và 950C- 5’ (1 chu kỳ) và 40 chu kỳ lặp lại với 950C- 15’’, 600C- 1’. Thể tích hỗn
hợp phản ứng PCR realtime là 50 µl bao gồm: 1× dung dịch đệm PCR, 100 nmol/L mồi và mẫu dị, 400 µmol/L mỗi loại dATP, dGTP, dCTP và dTTP, 1.5 units hot-
start Taq DNA polymerase, 3 mmol/L MgCl2. Thể tích hỗn hợp phản ứng RT là
20µl bao gồm: 1× dung dịch đệm RT, 20 units RNase Inhibitor, 0,2 µg Random hexamer, 200 units M-MuLV Reverse Transcriptase và 100 ng - 5 µg RNA [3].