(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lã Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Minh Hiền Hà Nội, 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin đảm bảo tính khách quan kết xử lý số liệu nghiên cứu Hà Nội, ngày Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lã Thị Huyền, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào động vật- Viện CNSH PGS.TS Nguyễn Minh Hiền, Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Các Cô bảo cho nhiều ý kiến hƣớng dẫn qúy báu, động viên giúp đỡ giải khó khăn vƣớng mắc q trình thực luận án tạo điều kiện cho hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH CN Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn anh chị khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt em Nguyễn Trọng Linh đồng hành tơi q trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô khoa CNSH - Học viện KH CN, thầy cô hội đồng nghiên cứu sinh nhiệt tình dạy bảo giúp đỡ tơi, cho tơi ý kiến q báu để sửa chữa hồn thiện luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho chuyên tâm làm việc hoàn thành luận án Cuối xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, đồng nghiệp Khoa NôngLâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ động viên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu công tác Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả NCS Nguyễn Thị Loan iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan …………………………………………………………………… Lời cảm ơn……………………………………………………………………… Mục lục ……………………………………………… ………… Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt ………………………………………… Danh mục bảng …………………………………………………… ……… Danh mục hình……………………………………………………… MỞ ĐẦU………………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nguyên vi khuẩn gây nhiễm k 1.1.1 Lịch sử phát nghiên cứu nhiễm khuẩn 1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện ……… 1.1.3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Một số kỹ thuật phát vi khuẩn gây nhiễm 1.2.1 Cấy máu xét nghiệm sinh hoá ………………… 1.2.2 1.3 Kỹ thuật xác định có mặt DNA …………… ………………………… Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex real vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …… 1.3.1 Trên giới ……………………………………… 1.3.2 Ở Việt Nam ……………………………………… 1.4 Kháng sinh kháng kháng sinh vi khuẩn … 1.4.1 Kháng sinh chế tác động …………………… 1.4.2 Kháng kháng sinh vi khuẩn chế kháng k 1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu ………………………… 2.1.1 Các mẫu bệnh phẩm…… ……………………… 2.1.2 Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu …………………… 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………… 2.2.1 Nguyên vật liệu ………………………………… iv 2.2.2 Các thiết bị ……………………………………… 2.2.3 Hoá chất………………………………………… 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………… 2.3.1 Nhóm phƣơng pháp vi sinh truyền thống ……… 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử ………………… 2.3.3 2.3.4 Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổ sinh phẩm multiplex realtime PCR … Phƣơng pháp thống kê ………………………… 2.4 Đạo đức nghiên cứu …………………………… CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật gây nhiễ 3.1.1 Kết phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm 3.1.2 Tỉ lệ loại vi sinh vật phân lập đƣợc ………… 3.1.3 Kết phân tích gen 16S rARN từ chủng vi 3.2 3.2.1 Kết phát triển sinh phẩm multiplex rea đồng thời tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩ Kết lựa chọn, phân tích trình tự gen đích …… 3.2.2 Kết thiết kế mồi mẫu dò ………………… 3.2.3 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi mẫu dò 3.2.4 Kết phản ứng multiplex realtime PCR cá 3.2.5 Kết tối ƣu phản ứng realtime PCR ………… 3.2.6 Kết xác định ngƣỡng phát …………… 3.2.7 Kết tạo đối chứng dƣơng ……………… 3.2.8 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ………… 3.2.9 Kết xác định độ ổn định …………………… 3.3 3.3.1 Kết kháng sinh đồ chủng vi khuẩn mã hoá beta-lactamase mở rộng vi khuẩn Kết kháng sinh đồ …………………………… 3.3.2 Kết xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………… ……… DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết đầy đủ Phần viết tắt Ac Acinetobacter baumannii BV Bệnh viện Ct Thresold cycle (chu kì ngƣỡng) CTX-M Cefotaxime- Munich DNA Deoxyribonucleic Axit Ec Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh Châu Âu) ESBL Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng) FN Fall Negative (âm tính giả) FP Fall Positive (dƣơng tính giả) GADPH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HAI Hospital Aquired- Infections Hu Human I Intermediate (trung gian) Kp Klebsiella pneumoniae MRSA Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus NK Nhiễm khuẩn NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện Pa Pseudomonas aeruginosa PCR Polymerase Chain Reaction S Sensitivity (nhạy cảm) Sa Staphylococcus aureus R Resistant (đề kháng) VSV Vi sinh vật WHO World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1.Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……………………………… Bảng 1.2.Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp ……… Bảng 1.3.Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao … Bảng 2.1.Trình tự cặp mồi, mẫu dị gen đích chủng vi khuẩn …… Bảng 2.2.Trình tự mồi 16S rARN gen mã hố ESBL ……………………… Bảng 2.3.Thành phần chƣơng trình chạy phản ứng PCR ………………… Bảng 2.4.Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi mẫu dị với DNA đích ………………… Bảng 2.5.Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi mẫu dò với DNA đích vi khuẩn …………………………… Bảng 2.6.Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn … Bảng 2.7.Thành phần phản ứng realtime PCR mẫu chủng chuẩn ………… Bảng 3.1.Tỷ lệ xét nghiệm tỷ lệ cấy dƣơng tính theo loại bệnh phẩm ……… Bảng 3.2.Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ……………………… Bảng 3.3.Các mồi mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ……………… Bảng 3.4.Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae DNA ngƣời ……… Bảng 3.5.Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn S aureus, E coli, P aeruginosa………………… Bảng 3.6.Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu hỗn hợp mồi, mẫu dị với DNA đích vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae gen GADPH ………………………… Bảng 3.7.Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ……………… Bảng 3.8.Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn A baumannii, K pneumoniae ngƣời (Hu) ……… vii Bảng 3.9 Giá trị chu kì chủng chuẩn Bảng 3.10 Giá trị chu kì nhiệt độ khác Bảng 3.11 Giá trị chu Master mix ID Bảng 3.12 Giá trị chu kì nồng độ pha l Bảng 3.13 So sánh phƣơ bệnh phẩm … Bảng 3.14 Kết phá realtime PCR Bảng 3.15 Giá trị chu kì Bảng 3.16 Tỷ lệ kháng k Bảng 3.17 Tỷ lệ kháng k Bảng 3.18 Tỷ lệ kháng k Bảng 3.19 Tính nhạy Bảng 3.20 Các mẫu E c viii Hình 1.1 Định nghĩa Hình 1.2 Nhân tố liê Hình 1.3 Cơ chế trao Hình 1.4 Cơ chế Hình 1.5 Bản đồ t Hình 2.1 Sơ đồ nghi Hình 3.1 Hình ảnh k Hình 3.2 Hình ảnh k Hình 3.3 Hình ảnh đ A bauman Hình 3.4 Hình ảnh n chủng vi kh Hình 3.5 Hình ảnh n chủng vi kh Hình 3.6 Kiểm tra tí chủng vi kh Kết PC Hình 3.7 gyrB P aureus g Hình 3.8 Biểu đồ kh Klebsiella p Hình 3.9 Biểu đồ kh (C): P aeru Hình 3.10 Biểu đồ kh DNA đích Hình 3.11 Biểu đồ kh DNA đích vi DNA ngƣời ………………………………………………… PHỤ LỤC 6.1 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN THANH NHÀN CUNG CẤP ĐỢT STT Mã bệnh nhân BN1 BN2 BN3 BN4 BN5 BN6 BN7 BN8 BN9 10 BN10 11 BN11 12 BN12 13 BN13 14 BN14 15 BN15 16 BN16 17 BN17 18 BN18 STT Mã bệnh nhân 19 BN19 20 BN20 21 BN21 22 BN22 23 BN23 24 BN24 25 BN25 26 BN26 27 BN27 28 BN28 29 BN29 30 BN30 31 BN31 32 BN32 33 BN33 34 BN34 35 BN35 36 BN36 37 BN37 38 BN38 39 BN39 40 BN40 STT Mã bệnh nhân 41 BN41 42 BN42 43 BN43 44 BN44 45 BN45 46 BN46 47 BN47 48 BN48 49 BN49 50 BN50 51 BN51 52 BN52 53 BN53 54 BN54 55 BN55 56 BN56 57 BN57 58 BN58 59 BN59 60 BN60 61 BN61 62 BN62 STT Mã bệnh nhân 63 BN63 64 BN64 65 BN65 66 BN66 67 BN67 68 BN68 PHỤ LỤC 6.2 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN THANH NHÀN CUNG CẤP ĐỢT STT Mã NC D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 10 D10 11 D11 12 D12 13 D13 14 D14 15 D15 16 D16 17 D17 18 D18 19 D19 STT Mã NC 20 D20 21 D21 22 D22 23 D23 24 D24 25 D25 26 D26 27 D27 28 D28 29 D29 30 D30 31 D31 32 D32 33 D33 34 M1 35 M2 36 M3 37 M4 38 M5 39 NT1 40 NT2 41 NT3 42 NT4 STT Mã NC 43 NT5 44 NT6 45 Đờm 46 Đờm 47 Đờm 48 Đờm 49 Đờm 50 Đờm 51 Đờm 12 PHỤ LỤC 6.3 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN ĐỨC GIANG CUNG CẤP STT Mã NC Mẫ DG1 Đờm DG2 Đờm DG3 Đờm DG4 Đờm DG5 Đờm DG6 Đờm DG7 Đờm DG8 Đờm DG9 Đờm 10 DG10 Đờm 11 DG11 Đờm 12 DG12 Đờm 13 DG13 Nƣớc 14 DG14 Nƣớc 15 DG15 Nƣớc 16 DG16 Nƣớc 17 DG17 Nƣớc 18 DG18 Nƣớc 19 DG19 Nƣớc 20 DG20 Nƣớc 21 DG21 Nƣớc 22 DG22 Má 23 DG23 Má 24 DG24 Má ... 1.4 Kháng sinh kháng kháng sinh vi khuẩn … 1.4.1 Kháng sinh chế tác động …………………… 1.4.2 Kháng kháng sinh vi khuẩn chế kháng k 1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ... sinh phẩm multiplex realtime PCR phát số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện khảo sát tính kháng kháng sinh? ?? với mục tiêu sau: Phân lập định danh đƣợc chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. .. phân lập chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ mẫu bệnh phẩm Nghiên cứu phát triển sinh phẩm multiplex realtime PCR phát tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A baumannii,