ý kiến rất phấn kích vì ứng dụng quá tuyệt vời của PCR, nhưng cũng có các tiếng nói hòai nghi cho là kỹ thuật này sẽ khó áp dụng được một cách rộng rãi vì Việt Nam chúng ta chưa thể thoát ra được các điều kiện quá hạn chế của một quốc gia có thu nhập thấp, nền tảng khoa học kỹ thuật chưa sẵn sàng cho những kỹ thuật cao cấp như vậy. Tuy nhiên, chỉ một thời gian ngắn không quá hai năm sau đó, năm 1997 với sự động viên của GS. Đỗ Đình Hồ và sự khuyến khích tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu nhà trường thời đó, đơn vị sinh học phân tử y khoa của chúng tôi đã ra đời với ứng dụng PCR đầu tiên được triển khai là PCR phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm khác nhau. Một trường hợp xét nghiệm PCR thành công mà chúng tôi không thể quên được là đã giúp chẩn đoán xác định mẹ của một Phó Giám Đốc Bệnhý kiến rất phấn kích vì ứng dụng quá tuyệt vời của PCR, nhưng cũng có các tiếng nói hòai nghi cho là kỹ thuật này sẽ khó áp dụng được một cách rộng rãi vì Việt Nam chúng ta chưa thể thoát ra được các điều kiện quá hạn chế của một quốc gia có thu nhập thấp, nền tảng khoa học kỹ thuật chưa sẵn sàng cho những kỹ thuật cao cấp như vậy. Tuy nhiên, chỉ một thời gian ngắn không quá hai năm sau đó, năm 1997 với sự động viên của GS. Đỗ Đình Hồ và sự khuyến khích tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu nhà trường thời đó, đơn vị sinh học phân tử y khoa của chúng tôi đã ra đời với ứng dụng PCR đầu tiên được triển khai là PCR phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm khác nhau. Một trường hợp xét nghiệm PCR thành công mà chúng tôi không thể quên được là đã giúp chẩn đoán xác định mẹ của một Phó Giám Đốc Bệnhý kiến rất phấn kích vì ứng dụng quá tuyệt vời của PCR, nhưng cũng có các tiếng nói hòai nghi cho là kỹ thuật này sẽ khó áp dụng được một cách rộng rãi vì Việt Nam chúng ta chưa thể thoát ra được các điều kiện quá hạn chế của một quốc gia có thu nhập thấp, nền tảng khoa học kỹ thuật chưa sẵn sàng cho những kỹ thuật cao cấp như vậy. Tuy nhiên, chỉ một thời gian ngắn không quá hai năm sau đó, năm 1997 với sự động viên của GS. Đỗ Đình Hồ và sự khuyến khích tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu nhà trường thời đó, đơn vị sinh học phân tử y khoa của chúng tôi đã ra đời với ứng dụng PCR đầu tiên được triển khai là PCR phát hiện M. tuberculosis trong các bệnh phẩm khác nhau. Một trường hợp xét nghiệm PCR thành công mà chúng tôi không thể quên được là đã giúp chẩn đoán xác định mẹ của một Phó Giám Đốc Bệnh
PHẠM HÙNG VÂN PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC Chi Nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh 2009 Lời nói đầu Cách 14 năm, TS Nguyễn Đức Thái, ch nhi m chương trình nghiên cứu gene thiên đầu thống glaucoma) UCSF, thăm báo cáo kỹ thuật PCR với mong ước kỹ thuật ứng dụng chẩn đoán - nghiên cứu y học Việt Nam, nơi bắt đầu Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh Trong phần thảo luận sơi hơm đó, có nhiều ý kiến phấn kích ứng dụng tuyệt vời PCR, có tiếng nói hịai nghi cho kỹ thuật khó áp dụng cách rộng rãi Việt Nam chưa thể điều kiện hạn chế quốc gia có thu nhập thấp, tảng khoa học kỹ thuật chưa sẵn sàng cho kỹ thuật cao cấp Tuy nhiên, thời gian ngắn không hai năm sau đó, năm với động viên GS Đỗ Đình Hồ khuyến khích tạo điều kiện Ban Giám Hiệu nhà trường thời đó, đơn vị sinh học phân tử y khoa đời với ứng dụng PCR triển khai PCR phát M tuberculosis bệnh phẩm khác Một trường hợp xét nghiệm PCR thành công mà quên giúp chẩn đốn xác định mẹ Phó Giám Đốc Bệnh Viện TP HCM bị lao thận khơng phải ung thư thận chẩn đốn lâm sàng, nhờ vài tháng sau điều trị, mẹ anh hết hẳn tiểu máu, chịu liệu pháp phẩu thuật nặng nề mà khơng trúng đích Tiếp tục từ thành cơng PCR chẩn đốn lao này, chúng tơi triển khai thành công PCR phát HBV đến tác nhân khó HCV Thành cơng xây dựng phát triến kỹ thuật RT-PCR phát HCV vào năm củng cố thêm niềm tin chúng tơi, nắm kỹ thuật, tìm nguồn hóa chất cần thiết, có mẫu thử, có tâm kỹ thuật dù có khó RT-PCR đưa vào ứng dụng thành cơng chẩn đốn Từ mầm ban đầu mà đơn vị sinh học phân tử y khoa trường Đại Học Y Dược TP HCM g lĩnh vực y khoa, PCR chí real-time PCR ọi qPCR), nhiều nhà nghiên cứu nhà lâm sàng Việt Nam biết đến cho định xét nghiệm để phục vụ cho mục đích chẩn đốn hay theo dõi điều trị Ngồi ra, lĩnh vực chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản, yêu cầu kiểm soát phát tác nhân gây dịch bệnh, PCR sử dụng nhiều phịng thí nghiệm khơng viện nghiên cứu lớn trung ương mà địa phương Có thể nói so sánh với nước khu vực Thái Lan, Malaysia, Philippine, Indonesia l nh vực áp dụng PCR qPCR chẩn đóan, Việt Nam khơng thua Chỉ có khác biệt Thái lan, y khoa chẳng hạn, định xét nghiệm PCR/qPCR thực bệnh viện hay trung tâm lớn đa số xét nghiệm thực hệ thống kín Cobas Taqman, hay Amplicor Roche Trong Việt Nam, xét nghiệm thực nhiều bệnh viện lớn kể vài bệnh viện tuyến tỉnh hay chí số bệnh viện tư nhân, trung tâm/phòng xét nghiệm tư nhân Lý vậ khai thác kỹ thuật PCR/qPCR kỹ thuật mở Chính yếu nhờ , cần thiết bị luân nhiệt thích hợp máy PCR real-time PCR mà giá khơng cịn cao ngất ngưỡng nữa) số thiết bị thơng thường khác có phịng thí nghiệm là xét nghiệm PCR với thuốc thử tự chế mồi me-brews) hay vài công ty nước sản xuất dựa imers) hay đọan dò tự thiết kế hay phổ biến tạp chí Tình hình phát triển có lợi mà có cần chấn chỉnh Lợi kỹ thuật phổ biến nhà lâm sàng có thêm phương tiện xét nghiệm để phát bệnh, để theo dõi điều trị với giá thành vừa phải làm nhiều nơi Nhưng vấn đề cần phải chấn chỉnh làm để kiểm sóat chất lượng xét nghiệm PCR qPCR thực nơi Kiểm sóat chất lượng theo chúng tơi khơng phải phải có certificate từ quan nhà nước thật chưa có quan nhà nước thực vấn đề kiểm sóat chất lượng xét nghiệm này, chúng tơi nghĩ có certificate có giá trị mẫu kiểm tra Do vậy, theo chúng tơi thân người làm xét nghiệm nhà chế tạo kit phải nhận diện cho xét nghiệm PCR/qPCR, điểm khâu thực xét nghiệm phải kiểm sóat để kết xét nghiệm với chất lượng người sản xuất thông báo hay người làm xét nghiệm mong muốn Để làm vậy, hiểu biết vấn đề xét nghiệm PCR/qPCR người làm xét nghiệm người nhận kết xét nghiệm hay sử dụng xét nghiệm cần thiết Đây lý chúng tơi viết sách với ước mong đóng góp phần kiến thức hạn chế cho nghiệp phát triển ứng dụng công nghệ sinh học phân tử y học sinh học nước nhà Mục lục Lời nói đầu Mục lục Polymerase Chain Reaction Các vấn đề PCR Nguyên tắc PCR Lịch sử phát minh PCR Các chìa khóa kỹ thuật giúp hồn thiện PCR 11 Phát sản xuất enzyme polymerase chịu nhiệt 11 Chế tạo máy luân nhiệt hoạt động hiệu 11 Tìm phương pháp lọai trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại 13 Vai trò mồi (primers) 14 Cách pha PCR mix 16 Kiểm tra độ nhạy PCR mix pha 19 Các PCR thường sử dụng chẩn đoán phát tác nhân nhiễm trùng 20 PCR đơn mồi (monoplex PCR) 21 PCR đa mồi (multiplex PCR) 21 PCR tổ (nested PCR) 21 PCR tổ không dừng (non-stop nested PCR) 22 Touch-down PCR 23 RT-PCR 24 PCR ứng dụng y sinh học 28 PCR công nghệ gene 28 PCR pháp y 31 PCR chẩn đoán sàng lọc bệnh lý di truyền 31 PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng 32 PCR địn bẩy thúc đẩy nhanh cơng nghệ giải trình tự 32 Real-time PCR Các vấn đề 34 Real-time PCR gì? 34 Các vấn đề kỹ thuật cần biết real-time PCR 34 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR 34 Biểu đồ chuẩn real-time PCR 36 Máy real-time PCR 41 Sử dụng nguồn sáng kích thích đèn tungstene dùng kính lọc để chiếu nguồn sáng có độ dài sóng định lên tồn giếng chứa tube phản ứng 41 Thiết bị real-time dùng sợi quang học (fiber optic cables) để đưa nguồn sáng kích thích đến tube phản ứng 42 Thiết bị real-time dùng đèn led làm nguồn sáng kích thích 42 Hóa chất thuốc thử cho real-time PCR 43 Chất phát huỳnh quang loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA 43 Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang 51 Các ứng dụng real-time PCR 60 Định lượng tác nhân đích có mẫu thử 60 Xác định tỷ lệ biến đổi gene (GMO, Gene Modified Organism) có mẫu 66 Phát khác biệt SNP xác định kiểu di truyền 67 PCR dấu vân tay DNA 70 Lịch sử 70 Các loại xét nghiệm dấu vân tay DNA 70 Các tiểu vệ tinh (minisatellite) 71 Các vi vệ tinh (microsatellite) 73 Trình tự vịng D ty thể 79 Kết luận 80 PCR giải trình t 81 Giải trình tự gì? 81 Các phương pháp giải trình tự gene 81 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA 81 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 83 Giải trình tự máy tự động (automated sequencer) 85 PCR công cụ giúp hoàn thiện mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự 88 Giải trình tự gene người 88 Làm giải trình tự gene người 88 Kết giải trình tự gene người 90 Giải trình tự gene người – đua chưa kết thúc 92 Việt Nam tham gia vào đua khơng? 94 Ứng dụng công nghệ giải trình tự phịng thí nghiệm NK-Biotek 95 Ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự để định danh vi khuẩn 95 Ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự để định danh vi nấm 104 Ứng dụng PCR-giải trình tự để phát hiện, định lượng xác định genotype HCV 106 Áp dụng PCR-giải trình tự để phát đột biến kháng thuốc HBV 109 Áp dụng PCR-giải trình tự phát đột biến precore/ promoter genotype HBV 111 PCR-giải trình tự phát đột biến kháng rifampicine INH M tuberculosis 112 Nh ng vấn đề kỹ thu t cần đ c quan tâm áp dụng PCR real-time PCR phịng thí nghiệm ch n đốn 115 Sự khác biệt phịng thí nghiệm chẩn đốn phịng thí nghiệm nghiên cứu 115 Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm áp dụng PCR real-time PCR chẩn đoán 116 Tiến trình xét nghiệm PCR real-time PCR 116 Xây dựng phịng thí nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn 140 Phòng tách chiết nucleic acid 140 Phòng đặt máy PCR real-time PCR 141 Phòng điện di đọc kết 141 Phòng pha chế thuốc thử PCR real-time PCR 142 Kinh nghiệm xây dựng phát triển PCR/real-time PCR số kỹ thu t sinh học phân tử khác nghiên cứu ch n oán 146 Từ yêu cầu thực tế phải tiếp cận y học đại chẩn đoán điều trị 146 Cần giải pháp toàn diện chẩn đoán sinh học phân tử bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính 146 Cần xét nghiệm kịp thời nhạy cảm để chẩn đoán phát tác nhân vi sinh gây bệnh mà phương tiên vi sinh hay miễn dịch không hữu hiệu 150 Đến thực tế triển khai kỹ thuật PCR, real-time PCR 154 Các rào cản 154 Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật khó thực cách chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng? 155 Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật đắt tiền không? 157 Thực tế triển khai PCR real-time PCR 158 Và thực tế triển khai kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử khác 165 Kết luận 166 ng dụng sinh học phân tử ch n óan viêm gan siêu vi - Các câu h i th ng g p 167 Viêm gan siêu vi B 167 Viêm gan siêu vi C 173 Các ph ng pháp chu n b m u cho PCR real-time PCR 178 Các phương pháp chuẩn bị mẫu trước tách chiết 178 Thuần lọai trừ tạp nhiễm cho mẫu đàm 178 Phương pháp lọai bỏ sáp paraffin cho mẫu cắt sinh thiết 179 Phương pháp thủy giải mẫu proteinase K 180 Các phương pháp tách chiết nucleic acid 181 Phương pháp BOOM để tách chiết DNA 181 Phương pháp tách chiết DNA dùng CTAB 182 Phương pháp tách chiết DNA dùng phenol chloroform 184 Phương pháp tách chiết DNA gene bạch cầu 186 Phương pháp tách chiết thô DNA mẫu thử tôm cá 187 Phương pháp tách chiết RNA tòan phần 189 Phương pháp phiên mã ngược RNA để tổng hợp cDNA 191 ài liệu có liên quan Sách tham khảo 192 Tạp chí đăng kết nghiên cứu có liên quan 192 ác giả 197 ... đa mồi (multiplex PCR) 21 PCR tổ (nested PCR) 21 PCR tổ không dừng (non-stop nested PCR) 22 Touch-down PCR 23 RT -PCR 24 PCR ứng dụng y sinh... Cách pha PCR mix 16 Kiểm tra độ nhạy PCR mix pha 19 Các PCR thường sử dụng chẩn đoán phát tác nhân nhiễm trùng 20 PCR đơn mồi (monoplex PCR) 21 PCR đa mồi... đề kỹ thuật cần quan tâm áp dụng PCR real-time PCR chẩn đoán 116 Tiến trình xét nghiệm PCR real-time PCR 116 Xây dựng phòng thí nghiệm PCR/ real-time PCR chẩn đốn 140 Phòng tách chiết