Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng potx

TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng PCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang. REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube) 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 C.41 C.39 C.36 C.33 C.31 C.29 C.34 Mẫu chưa biết [C] Standard curve PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền. - Ct (Threshold cycle): là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng. - Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ computer THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU [...]... Contamination sử dụng NC ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR E% =PCR efficiency (90%-105%) R=Corelation coefficiency (>0.990) E = 10-1/slope E=10-1/slope = 10 -1/-3.425 = 1.959 E% = (E-1) x 100% E% =(1.959 - 1) x 100% = 95,9 ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR E% =PCR efficiency (90%-105%) R=Corelation coefficiency (>0.990) Y= ax+b → Y = a.(log10Sq) + b Y: Ct Sq= 10 [(Ct-b)/a] X: log10Sq ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR TRONG CHẨN ĐỐN VÀ NGHIÊN... (CML) và bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime PCR định lượng 2 tổ hợp gen khác nhau gây bệnh là p190 và p210 So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh Realtime PCR trong nghiên cứu biểu hiện gen Ứng dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen VD: Sau khi tế bào được xử lý với kháng ngun hay hóa chất, tìm hiểu sự đáp ứng. .. e Q NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn biến tính NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn bắt cặp NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn kéo dài ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR 1) Reaction efficiency (PCR efficiency): E%, sử dụng đường cong chuẩn (standard curve) Tối ưu E 100% thì E=2 2) Reproducibility/linearity (R=Corelation coefficiency) sử dụng giá trị R hay R2 =1 đánh giá độ chính xác trong thao tác 3) Specificity sử dụng Melting.. .REALTIME PCR REALTIME PCR Log view Rael time PCR định lượng số copies trong giai đoạn tăng lũy thừa TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG REAL TIME PCR 1 Chất nhuộm khi chèn vào sợi đơi DNA sẽ phát huỳnh quang: ♦ Ethidium bromide ♦ SYBR green 1 2 Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang ♦ Taqman probe ♦ Molecular Beacon ♦ Hybridization probe… Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer MgCl2 Chất... cụ tốt nhất Realtime PCR là cơng cụ định lượng tác nhân gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm • Xác định số lượng virus (HIV, HBV, HCV ) • Xác định số lượng khởi đầu của các tác nhân gây bệnh khẩn cấp trong mẫu bệnh (Sốt xuất huyết, H5N1, H1N1 ) Theo dõi điều trị Tiên đốn mức độ nghiêm trọng và tiên đốn kết quả Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm: Samonella, Campyllobacter… Realtime PCR ứng dụng trong... thuộc chiều dài và thành phần nucleotide Thực hiện: tăng To, DNA tách nhau ra, Đưa To về 55oC Tăng dần nhiệt độ, chụp hình tín hiệu huỳnh quang mỗi 0,5oC Melting Curve PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU (Melting Curve) REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE 1 ƯU ĐIỂM Probe đặc hiệu Multiplex PCR 2 NHƯỢC ĐIỂM Giá thành cao NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG 5’... 5’ 3’ 5’ 5’ Probe Q 3’ Tube phản ứng 3’ 5’ Taq 1 Biến tính 94oC 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ l 5’ 2 Bắt cặp và kéo dài 60oC R 5’ Q 3’ Q R 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ R 1 Kéo dài mạch R Q Taq 3’ 5’ 5’ 3’ R Q 2 Phân cắt 3’ Taq 5’ 5’ 3’ R Taq 3 Hồn tất tổng hợp Q 3’ 5’ 5’ 3’ R Taq 4 Phát hiện Q 3’ 5’ 5’ 3’ Primers có nhiệt độ bắt cặp ở 60oC và Taqman probe ở 70oC REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE DNA probe Loop T... TRONG CHẨN ĐỐN VÀ NGHIÊN CỨU Realtime PCR là cơng cụ phát hiện tác nhân gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm (vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)  Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết quả  Tránh được ngoại nhiễm vì khơng cần phân tích sau PCR  Có thể định lượng trong phạm vi lớn (log 7 đến log 8)  Độ nhạy cao hơn so với PCR  Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR Thích hợp cho lâm sàng Khơng... huỳnh quang Target DNA (Template) Real-time PCR MIX Real-time PCR mix SYBR GREEN I Huỳnh quang khơng SYBR GREEN I Khơng phát huỳnh quang SYBR GREEN I SYBR GREEN I DNA cần tìm DNA không cần tìm Không phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu SYBR GREEN I  Tính đặc hiệu khơng cao  Tầm sốt sản phẩm trước khi sử dụng probe đặc hiệu  Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, khơng có primer dimer, . TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng PCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát. dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA. PHÁT HIỆN TÍN HIỆU REALTIME PCR REALTIME PCR Rael time PCR định lượng số copies trong giai đoạn tăng lũy thừa Log view Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer MgCl 2 Real-time PCR MIX Target DNA