1. Trang chủ
  2. » Giáo án - Bài giảng

BÀI GIẢNG VỀ REALTIME PCR-NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

38 1,2K 3

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 38
Dung lượng 1,41 MB

Nội dung

BÀI GIẢNG VỀ REALTIME PCR,NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

Trang 1

Trao đổi trực tuyến tại:

http://www.mientayvn.com/Y_online.html

Trang 2

TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy

Realtime PCR

Nguyên tắc và ứng dụng

Trang 3

PCR

Trang 4

PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR

PCR và phát hiện sản phẩm bằng

điện di trên gel agarose

1 Phát hiện điểm cuối

(End-Point Detection)

2 Độ đặc hiệu kém

3 Độ nhạy thấp

4 Độ phân giải kém

4 Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR

5 Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm

6 Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)

Trang 5

Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang

Trang 6

REALTIME PCR

Trang 7

HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR

Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng

Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen

Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)

Trang 8

1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6

Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11

Trang 9

C.33 C.31

C.29

C.34

Mẫu chưa biết [C]

Standard curve

Trang 10

PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU

Trang 11

Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền

Trang 12

REALTIME PCR

Trang 13

REALTIME PCR

Rael time PCR định

lượng số copies trong

giai đoạn tăng lũy thừa

Log view

Trang 14

Primers Taq polymerase

dNTP PCR buffer MgCl 2

Real-time PCR MIX

Target DNA (Template)

Real-time PCR mix

Chất phát huỳnh quang

1 Chất nhuộm khi chèn vào sợi

đôi DNA sẽ phát huỳnh quang:

Trang 15

SYBR GREEN I

Huỳnh quang

Trang 16

SYBR GREEN I

DNA cần tìm

DNA không cần tìm

Không phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu

Trang 17

 Tính đặc hiệu không cao

 Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe

đặc hiệu

 Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có

primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu

SYBR GREEN I

Trang 18

PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU

(Melting Curve)

Mục đích :

phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại

Melting temperature (Tm) của dsDNA:

–To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn –Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide

Trang 19

Melting Curve

Trang 20

PHÂN BIỆT

SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU

(Melting Curve)

Trang 21

REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE

1 ƯU ĐIỂM

Probe đặc hiệu Multiplex PCR

2 NHƯỢC ĐIỂM

Giá thành cao

Trang 22

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

Trang 25

Reporter Dye

REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE

Trang 26

Giai đoạn biến tính

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Trang 27

Giai đoạn bắt cặp

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Trang 28

Giai đoạn kéo dài

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Trang 29

1) Reaction efficiency (PCR efficiency ): E%,

sử dụng đường cong chuẩn (standard

curve) Tối ưu E 100% thì E=2

2) Reproducibility/linearity ( R=Corelation

đánh giá độ chính xác trong thao tác

3) Specificity sử dụng Melting Curve

4) Contamination sử dụng NC

ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR

Trang 32

ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR

TRONG CHẨN ĐOÁN

VÀ NGHIÊN CỨU

Trang 34

 Đơn giản, nhanh chóng,

Độ đặc hiệu tốt

Công cụ tốt nhất

Trang 35

đoán kết quả

Realtime PCR là công cụ định lượng tác nhân

gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm

Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm:

Samonella, Campyllobacter…

Trang 36

Realtime PCR ứng dụng trong ung thư học lâm sàng

Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư

-Trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) và bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime

PCR định lượng 2 tổ hợp gen khác nhau gây bệnh là p190 và p210

So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh

Trang 37

Realtime PCR trong nghiên cứu biểu hiện gen

Ứng dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen

VD: Sau khi tế bào được xử lý với kháng nguyên hay hóa chất, tìm hiểu sự đáp ứng của TB trong mức độ biểu hiện của gen đích

Trang 38

Các ứng dụng khác của Real-Time PCR

 Phát hiện GMO ( genetically modified

 Phát hiện SNP (single nucleotide

discrimination)

Ngày đăng: 11/07/2015, 08:09

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w