0

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

40 3 0
  • PCR (POLYMERASE CHAIN  REACTION)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Tài liệu liên quan

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 06/08/2022, 21:19

KỸ THUẬT DI TRUYỀN PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Thị MCác thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng3. Một số biến thể của PCR:➢ Reverse transcriptase PCR (RTPCR)➢ Hotstart PCR➢ Assembly PCR➢ Nestedseminested PCR➢ Allelespecific PCR➢ Methylation – specificỹ Nương Email ntmnuonghcmus edu vn 1 Nội dung 1 Mục tiêu, nguyên lý 2 Các thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng 3 Một số biến thể. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn 1 Mục tiêu, nguyên lý Nội dung Các thành phần phản ứng, thiết lập phản ứng Một số biến thể PCR: ➢ Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) ➢ Hot-start PCR ➢ Assembly PCR ➢ Nested/semi-nested PCR ➢ Allele-specific PCR ➢ Methylation – specific PCR ➢ Quantitative PCR (qPCR) Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L (2007) Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.) Philadelphia: F.A Davis Co Nguyên lý PCR Kary Mullis, Nobel 1993 1969 : Thermus aquaticus – Yellowstone National Park 1976 : Taq polymerase (Cetus) 1987 : Máy PCR (Perkin Elmer – Cetus) Vì cần PCR? Khả nhân đặc hiệu:  Gene diện với hàm lượng thấp mẫu, phát phương pháp  Để “nhìn thấy” gene gel agarose, cần  10-20 ng DNA Một trình tự 500 bp, 660g/mol bp, cần 109/500x660 mol (hằng số Avogadro = 6.0223) → 1.810 Nghĩa để “nhìn thấy” gene, cần nhân DNA từ 100 tế bào lên 180 triêu lần  Khả phát định lượng đặc hiệu trình tự DNA xác định tập hợp nhiều trình tự DNA  Phân lập trình tự DNA mục tiêu Đơn giản Nhanh Các thành phần PCR? CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR Primer (mồi) Mồi phải thỏa số điều kiện : (1) dài khoảng 18-24 base, (2) Tm primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) trình tự lặp lại DNA mẫu (template) Hàm lượng đủ không cao, tinh – không chứa chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ), heparin, ) Nồng độ MgCl2 Cần cho hoạt động Taq polymerase ; hàm lượng cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, thấp làm giảm hiệu nhân enzyme dNTP Thành phần loại dNTP phải cân ; hàm lượng thường không đổi thay đổi tùy điều kiện thực tế CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) Enzyme Được chọn tùy mục đích sử dụng :  Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thông dụng nhất, hoạt tính polymerase mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, hoạt tính 5’-3’ exonuclease, hoạt động phổ MgCl2 rộng  multiplex PCR Taq Stoffel DNA polymerase thêm 3’dA vào sản phẩm PCR  Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chịu nhiệt cao, nhân đọan DNA dài, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thực cao Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng”  Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : có hoạt tính 5’-3’ 3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao Taq pol 12 lần, thường dùng cycle sequencing  Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vừa có chức polymerase vừa có chức phiên mã ngược (RT)  dùng phản ưng RT-PCR  UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chịu nhiệt cao, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thực cao CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) Chương trình PCR :  Nhiệt độ : biến tính – 94-95C ; lai < Tm primer ~ 5C ; kéo dài - 72C  Thời gian chu kỳ tùy thuộc thiết bị kích thước sản phẩm  Số lượng chu kỳ thường  40 Ví dụ : chu kỳ - 95C – 5‘ 35 chu kyø – 94C – 30” 55C – 30” 72C – 45” chu kyø – 72C – 10’ Thiết bị : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate 96 giếng, (2) block nhiệt riêng biệt máy, (3) block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc NHỮNG HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR – CÁCH KHẮÊC PHỤC Ngoại nhiễm cao khả nhân DNA mạnh Sai sót DNA polymerase trình tổng hợp ➔ Lặp lại phản ứng PCR cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính trung thực cao Pfu, DeepVent, UlTma polymerase Kết phụ thuộc lớn vào toàn thao tác ➔ Kỹ thuật viên cần đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha sẳn (kit) chuẩn hóa Thiết bị đắt tiền 10 Methylation-specific PCR (MSP) DNA xử lý với sodium bisulfite, biến C khơng methyl hóa thành U PCR tiến hành với mồi phát “C” hay “U” Nhằm phát methyl hóa “đảo” CpG 26 QF - PCR Sử dụng đoạn mồi có gắn huỳnh quang để nhân trình tự STR, sau điện di hệ thống điện di mao quản Được sử dụng chẩn đoán lệch bội NST thai nhi 27 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Là multiplex PCR với probe thiết kế đặc biệt: gồm mảnh, mảnh đánh dấu huỳnh quang Có thể thiết 50 sản phẩm/phản ứng Gồm bước: (1) Biến tính DNA (2) Lai với probe (3) Nối ligase (4) PCR (5) Phân tách sản phẩm điện di mao quản Ứng dụng: Phát bất thường số lượng copy 28 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 1st 2nd 3rd 29 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 30 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 31 Các phương pháp nhân DNA khác 32 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Tổng hợp DNA thay chuỗi tự xoay vòng DNA polymerase có khả thay mạch: Bacillus stearothermophylus (Bst) DNA polymerase mồi, đẳng nhiệt: 60 - 65 oC 33 LAMP Ưu điểm : - Không cần máy luân nhiệt - Ít bị tác động chất ức chế mẫu Nhược điểm : - Không sử dụng cho nhiều mục tiêu PCR - Khó thiết kế hệ primer - Khó thiết kế multiplex 34 Helicase dependent amplification (HAD) Sử dụng Helicase,SSB protein DNA polymerase Nhược điểm : - Tối ưu hóa phản ứng thơng qua PCR - Giá hóa chất cao Rolling Circle Amplification (RCA) 36 Rolling Circle Amplification (RCA) 37 Recombinase polymerase amplification (RPA) Sử dụng recombinase, SSB protein DNA polymerase có hoạt tính “dời mạch” Nhược điểm : - Hướng dẫn thiết kế primer/probe chưa có nhiều ; primer 30-38 base - Hóa chất 01 hãng cung cấp (TwistAmp kit) CÂU HỎI Những yếu tố định tính đặc hiệu ? độ nhạy phương pháp PCR ? Làm cách tăng tính đặc hiệu, độ nhạy phương pháp PCR ? Những cách hạn chế nhược điểm phương pháp PCR Nêu số ứng dụng nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR Nêu cách thực phản ứng real-time RT-PCR Đường chuẩn ? Xây dựng ? Dùng làm ? Ct ? Vì cần xác định Ct ? Nguyên lý PCR tái tổ hợp 39 40 ... số biến thể PCR: ➢ Reverse transcriptase PCR (RT -PCR) ➢ Hot-start PCR ➢ Assembly PCR ➢ Nested/semi-nested PCR ➢ Allele-specific PCR ➢ Methylation – specific PCR ➢ Quantitative PCR (qPCR) Tài liệu... định 20 RT -PCR Gồm bước : RT (Phiên mã ngược) : tạo cDNA PCR : nhân cDNA Dùng để nhân RNA 21 Hot-start PCR HOT-START PCR & PCR “LẮP RÁP” Nhằm giảm nhân không đặc hiệu xảy trước phản ứng PCR khởi... quản Ứng dụng: Phát bất thường số lượng copy 28 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 1st 2nd 3rd 29 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 30 PCR kỹ thuật số (Digital PCR) 31 Các phương pháp nhân DNA khác 32 Loop
- Xem thêm -

Xem thêm: PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION),