Đang tải... (xem toàn văn)
m ạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có ch ọn lọc bằng tạo d òng in vitro mà không c ần sự hiện diện của tế b ào, kh ắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp.. và c ần [r]
(1)(2)
KỸ THUẬT PCR
(Polymerase Chain Reaction)
I MỞ ĐẦU:
Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay gọi phản
ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase phản ứng chuỗi tổng hợp ADN,
Karl Mullis cộng phát minh năm 1985 Kỹ thuật PCR đưa lại cách
mạng di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc tạo dịng in vitro mà không cần diện tế bào, khắc phục nhược điểm thao tác phức tạp
và cần thời gian dài kỹ thuật tạo dòng in vivo Nhờ phản ứng PCR, đoạn ADN vùng gien khuếch đại lên nhiều lần trình tự
nucleotide hai đầu đoạn biết
II NGUYÊN TẮC CƠ BẢN:
Kỹ thuật PCR sử dụng đặc điểm trình chép ADN ADN
polymerase dùng đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ
sung với sợi Các sợi ADN khn mạch đơn tạo theo cách đơn giản
đun nóng dung dịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi
(3)
cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ đến 30 nucleotid), đoạn gắn bổ sung
vào ADN khuôn điểm khởi đầu chép
Cả hai sợi ADN dùng để làm khn cho q trình tổng hợp đoạn mồi oligonucleotid cung cấp cho hai sợi Trong kỹ thuật PCR, đoạn
mồi chọn để chặn hai đầu đoạn ADN cần nhân lên, cho sợi ADN
tổng hợp đoạn mồi kéo dài phía đoạn mồi nằm sợi
kia (Hình 1c) Như vậy, sau chu kỳ điểm bám cho đoạn mồi lại xuất
(4)3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3'
Các đoạn mồi
Các đoạn mong muốn
… tiếp tục
Hình 1. Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi
trùng hợp PCR.
(Để đơn giản hóa sơ đồ, từ phần (d) không
vẽ hai sợi ADN khuôn ban đầu)
b) Các sợi tách gia nhiệt
94oC, sau hạ xuống 30-65oC,
trong 30 giây để đoạn mồi
gắn vào hai vị trí tương hợp ADN
c) Taq polymerase tổng hợp sợi
ADN tương hợp với sợi
khuôn, đoạn mồi kéo
dài phía đoạn mồi nằm bên sợi
d) Hỗn hợp phản ứng lại gia nhiệt Sợi ban đầu sợi
tổng hợp tách Trên hai sợi tổng hợp xuất điểm bám cho đoạn mồi gắn
vào
e) Taq polymerase tổng hợp sợi ADN tương hợp mới,
chuỗi lần tiến đến vị trí xác định
các cặp đoạn mồi lựa chọn
f) Quá trình lặp lại, đoạn
mồi tiếp tục gắn vào sợi
tổng hợp
g) Taq polymerase tổng hợp đoạn tương hợp sinh hai đoạn
ADN mạch kép giống hệt đoạn
cần tổng hợp Quá trình
tiếp tục
a) Vật liệu khởi đầu phân tử
(5)
Hỗn hợp phản ứng lại đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi tổng
hợp, sợi sau lại dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm bước
gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN tách rời đoạn Kết cuối phản ứng
PCR sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta có 2n-2 phân tử
ADN mạch kép nằm hai đoạn mồi (Bảng1)
Bảng 1. Hiệu nhân ADN kỹ thuật PCR
Số chu kỳ
(n)
Số phân tử ADN
mạch kép sinh ra
Số chu kỳ
(n)
Số phân tử ADN
mạch kép sinh ra
1 17 32.768
2 18 65.536
3 19 131.072
4 20 262.144
5 21 524.288
6 16 22 1.048.567
7 32 23 2.097.152
8 64 24 4.194.304
9 128 25 8.388.608
10 256 26 16.777.216
11 512 27 33.544.432
12 1.024 28 67.108.864
(6)
Các phương pháp sinh học phân tử giúp xác nhận quan hệ huyết thống phát
hiện tội phạm xác từ người nghi ngờ Chỉ cần trường cịn
mẫu vật: vài giọt máu khô, vệt tinh dịch, vài sợi lơng hay mẫu tóc, hay chí
mẫu tàn thuốc có dính vài tế bào niêm mạc miệng
CÂU HỎI
1 Hãy giải thích chế phản ứng PCR?
2 Tại thành phần đoạn mồi không chứa nhiều cặp GC?
3 Nêu ứng dụng phản ứng chuỗi PCR?
4 Tóm tắt kỹ thuật cải tiến PCR?
Tài liệu tham khảo
1 Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp –
Ứng dụng), Nxb Giáo dục
(7)PGS TS Nguyễn Văn ThanhHình 4. Sơ đồ kỹ thuật PCR-RFLP
DNA đích
Đoạn mồi
3'
5' 3' 5'
Tế bào VK
Taq polymerase
Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR
Restriction enzyme Máy luân nhiệt
(Thermocycler)
DNA cắt giới hạn