KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Trong số các tiến bộ kỹ thuật góp phần tạo ra các cuộc bùng nổ về lĩnh vực sinh học phân tử chúng ta phải kể tới kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH HỌC -   CHUYÊN ĐỀ SINH HỌC PHÂN TỬ TÌM HIỀU VỀ KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Giảng viên : GS TS Nguyễn Thành Đạt PGS.TS Đặng Hữu Lanh Học viên : Ngô Như Hải Lớp : Cao học K19 Chuyên ngành : Động vật học HÀ NỘI, – 2010 MỞ ĐẦU Trong khoảng thập kỷ qua nhân loại trải qua cách mạng sinh học, vấn đề sinh học phân tử (các trình lưu trữ, truyền đạt biểu thông tin di truyền mức độ phân tử) phận cách mạng Các kiến thức sinh học phân tử cho phép giải thích mối quan hệ cấu trúc chức đại phân tử sinh học vận hành kiểm soát q trình sinh hóa tế bào Trọng tâm sinh học phân tử việc nghiên cứu đại phân tử ADN, ARN Protein trình tái bản, phiên mã dịch mã Trong số tiến kỹ thuật góp phần tạo bùng nổ lĩnh vực sinh học phân tử phải kể tới kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR Kary Mullis đề suất vào năm 1985, phương pháp invitro để nhân nhanh đoạn ADN đó, có độ nhạy cao cần khối lượng ban đầu hạn chế Bản thân kỹ thuật mở rộng trực tiếp tính chất trình tái ADN Nhưng sử dụng theo nhiều cách khác để làm cho việc tách dòng thao tác với ADN dễ dàng hiệu Vậy nguyên tắc, thành phần tham gia, điều kiện, bước tiến hành , ứng dụng hạn chế kỹ thuật PCR tìm hiểu sau Lịch sử Phương pháp chạy PCR Kary Mullis phát minh, ông đoạt giải Nobel Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, sau năm ông đưa ý tưởng Ý kiến Mullis phát triển quy trình mà ADN nhân lên nhiều lần cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ chép enzyme ADN polymerase ADN polymerase có tự nhiên sinh vật sống, nơi mà thực chức nhân ADN tế bào phân chia Nó làm việc cách nối với sợi ADN tạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc Mullis, enzyme phản ứng nhân ADN thực ống nghiệm (in vitro) Sợi ADN đôi bị tách thành sợi đơn đun nóng 96°C Tuy nhiên, nhiệt độ ADN polymerase bị phá hủy cần bổ sung enzyme sau giai đoạn nung nóng chu kỳ Quy trình PCR gốc Mullis khơng có hiệu cao nhiều thời gian, cần lượng lớn ADN polymerase, phải liên tục lưu ý suốt trình PCR Sau đó, quy trình gốc phát triển cách dùng ADNpolymerase lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus (ưa nhiệt) sống mạch nước phun nhiệt độ 110°C ADN polymerase từ sinh vật thermostable (ổn định nhiệt độ cao) dùng PCR khơng bị phá vỡ hỗn hợp nung nóng để tách sợi ADN Từ đó, khơng cần phải thêm ADN-polymerase vào chu kỳ, trình chép ADN đơn giản tự động Một ADN-polymerase chịu nhiệt phân lập từ Thermus aquaticus gọi Taq Taq polymerase dùng rộng rãi thực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm Taq nhầm lẫn trình chép ADN, dẫn đến đột biến (sai) chuỗi ADN, thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase Pwo hay Pfu, phân lập từ Archaea có chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) làm giảm cách đáng kể số đột biến xảy chuỗi ADN chép Ngày nay, kết hợp Taq Pfu cung cấp độ tin cậy cao lẫn nhân xác ADN I Khái niệm chung Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction) phương pháp in vitro để nhân nhanh đoạn AND đó, có độ nhạy cao, mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế II Nguyên lý Kỹ thuật tổng hợp ADN thể tuân thủ nguyên tắc chép ADN thể như: Đoạn cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn, cần có cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu điều kiện môi trường thích hợp enzym ADN polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác dùng nhiệt độ cao (94 oC) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym AND polymerase chịu nhiệt hệ thống điều nhiệt thích hợp cho giai đoạn phản ứng tổng hợp với đoạn mồi thiết kế chủ động Nhờ kỹ thuật PCR mà với lượng nhỏ ADN ban đầu thu đủ lượng ADN cần thiết để tiến hành thí nghiệm ADN III Các điều kiện phản ứng PCR Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có thành phần sau: - ADN khuôn - Mồi - ADN polymerase - Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP) - Dung dịch đệm (buffer) ADN khuôn (template) Gần loại ADN, dù mạch thẳng, mạch vòng, ADN plasmit, ADN hệ gen, cADN, ARN…đều làm khn cho phản ứng PCR ADN lấy từ nguồn không quan trọng yêu cầu vị trí gắn mồi trình tự chúng cịn ngun vẹn có mẫu ADN mà tuổi đến nghìn năm sử dụng thành công phản ứng PCR Chúng ta xem xét việc nhân bội phân tử ADN đích Khi lượng phân tử ADN ban đầu nhỏ, nhiễm (có mặt ADN mà khơng quan tâm) trở thành vấn đề Đặc tính nhân bội kỹ thuật PCR có nghĩa là, chí nhiễm ADN phá hỏng thí nghiệm Nhiễm từ nhiều nguồn khác nhau, kể từ nhà nghiên cứu thực thí nghiệm, từ ống nghiệm, từ đầu tip, chí từ enzym dung mơi dùng cho thí nghiệm Trong thí nghiệm PCR điển hình, khoảng 0,1 - µ g hệ gen thêm vào phản ứng để thực PCR với số chu kỳ mà có đủ vật liệu cho thí nghiệm Điều giúp giảm thiểu khả nguồn nhiễm đươc nhân bội Lượng ADN tương ứng với trình tự đích? Nếu bạn thêm µ g ADN hệ gen người tương ứng với x 10 -6/(6,4 x 109 x 650) = 2,4.10-19 mol Vì ADN người chứa khoảng 6,4 x 10 bp khối lượng phân tử trung bình cặp bazơ 650 Da nên µ g ADN người tương với 2,4 x 10-19mol x x 1023 (số Avogadro) = khoảng 144.000 phân tử Một đoạn ADN hệ gen dài 1000bp nhân bội triệu lần (sau 25 chu kỳ PCR) sinh khoảng 10 µ g đoạn ADN Lượng nhỏ đủ để nhận biết cách nhuộm ethidium bromide sau điện di Mồi (primer) Thành công phản ứng PCR có hiệu cao hay khơng phụ thuộc vào mồi Mồi gồm mồi xuôi (sens primer) mồi ngược (antisens primer) Các cặp mồi cần thiết kế để mồi nhận biết sợi có nghĩa ADN mà ta cần tái bản, cịn mồi nhận biết sợi đối nghĩa Các mồi có đặc điểm sau: - Dài khoảng 17 – 30 nucleotit - Có hàm lượng GC khoảng 50% - Nhiệt độ giai đoạn gắn mồi cặp mồi (được tính từ phương trình 2(AT) + 4(GC)) thí nghiệm phải - Trình tự nucleotit phải đảm bảo mồi khơng gắn vào trình tự lặp lại ADN đích - Từng mồi khơng chứa đoạn trình tự bổ trợ Ví dụ, mồi có trình tự 5’ – GAGATCGATGCATCGATCTC – 3’ mồi PCR tốt (vì dài 20 nucleotit, GC chiếm 50% khơng chứa trình tự lặp lại) lại mang trình tự bổ trợ hai đầu tạo cấu trúc cặp tóc đầu ’ gắn kết với đầu 3’ Khi phản ứng PCR không diễn - Hai mồi cặp không bổ trợ đầu ’ hai mồi khơng bổ trợ Ví dụ, hai mồi 5’ – GATCGATCGATACGTGATCC – 3’ 5’ – CGTAGCTAGCTAGGATCACG – 3’ dường cặp mồi tốt Tuy nhiên, đầu 3’ hai mồi lại bổ trợ tạo primer dime tái chu kỳ phản ưng PCR: 5’ – GATCGATCGATACGTGATCC – 3’ 3’ – GCACTAGGATCGATCGATGC – 5’ PCR 5’ – GATCGATCGATACGTGATCCTAGCTAGCTACG – 3’ 3’ – CTAGCTAGCTATGCACTAGGATCGATCGATGC – 5’ * Ghép đôi sai mồi Các mồi oligonucleotit dùng cho kỹ thuật PCR phải ghép đơi xác với trình tự đích Điều đặc biệt có ý nghĩa cố tạo đột biến biến đổi có chủ ý đoạn trình tự ADN nhân bội, muốn tìm trình tự gen tương đồng với trình tự biết Vị trí mồi phải ghép đơi thật xác với trình tự đích đầu ’ Nếu đầu 3’ không ghép đơi xác polymerase khơng tiếp tục tổng hợp hiệu thí nghiệm hỏng hồn tồn Để hiểu cách sử dụng PCR để gây tạo đột biến sản phẩm, chung ta cần tìm hiểu kỹ mồi Mồi khơng khởi đầu q trình tái ADN mà chúng tổng hợp lồng ghép vào sản phẩm cuối Như vậy, thay đổi bazơ giưã mồi ADN khuôn đưa vào sản phẩm Vì khơng thể gây tạo đột biến đầu ’ nên vị trí thích hợp để biến đổi đầu 5’ mồi Mồi 5’ – GAATTCATGAAGCTACTGTCTTCT – 3’ 5’ TGAAAGATGAAGCTACTGTCTTCT ’ ACTTTCTACTTCGATGACAGAAGA GGATTATTTGTACAAGATAATGTG ’ Gen GAL4 CCTAATAAACATGTTCTATTACAC 5’ 3’ – CCTAATAAACATGTTCTACCTAGG – 5’ Mồi PCR EcoRI BamHI 5’ – GAATTCATGAAGCTACTGTCTTCT 3’ – CTTAAGTACTTCGATGACAGAAGA Gen GAL4 GGATTATTTGTACAAGATAATGTG ’ CCTAATAAACATGTTCTATTACAC ’ Các mồi dùng để nhân phần gen GAL4 từ hệ gen Saccharomyces cerevisiae có gắn thêm vị trí nhận biết enzym giới hạn Các sản phẩm PCR chứa trình tự Trong trường hợp trên, sử dung mồi có chứa trình tự bổ sung đầu 5’ Ở mồi 1, trình tự nhận biết cho enzym giới hạn EcoRI đầu 5’ đoạn trình tự dùng để nhận biết gen GAL4 Trình tự nhận biết EcoRI khơng kết đơi xác với trình tự đích khơng đủ để ngăn cản kết hợp đặc hiệu mồi trình tự có mặt tất sản phẩm PCR Mồi chứa trình tự nhận biết cho enzym giới hạn BamHI Việc tách dòng sản phẩm cuối trở nên dễ dàng sau cắt enzym giới hạn Thường enzym giới hạn cần đoạn trình tự dài trình tự nhận biết chúng để cắt thật hiệu Vì vậy, người ta thường bổ sung thêm đến nucleotit vào trước trình tự nhận biết enzym giới hạn Các nucleotit thường G C (được gọi kẹp GC) để tăng khả nắng gắn mồi hai mạch tăng hiệu cắt enzym giới hạn Bất kỳ đôi bazơ ghép sai mồi ADN khuôn đưa vào sản phẩm PCR cuối Vì vậy, tạo đột biến mong muốn sản phẩm PCR cách thay đổi trình tự mồi Điều đặc biệt quan trọng ta muốn thay đổi trình tự mã hóa gen để thay đổi trình tự axit amin, hoặc, ví dụ, ta muốn thay đổi codon cua gen để tạo vị trí nhận biết enzym giới hạn mà khơng làm thay đổi trình tự axit amin protein Lợi ích thứ hai primer ghép đơi sai để tìm gen mã hóa protein cụ thể tìm gen tương đồng Việc tách đặc trưng hóa protein việc phổ biến hóa sinh học Ví dụ, ta tách protein mà đầu amin có trình tự axit amin: Met – Ile – Trp – Pro – Phe Tính thối hóa mã cho biết trình tự axit amin mã hóa trình tự ADN sau: Met – Ile – Trp – Pro – Phe 5’ – ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3’ C C T T T G Chúng ta biết codon dùng để mã hóa axit amin Vì vậy, để nhân đoạn trình tự mã hóa protein đó, phải thiết kế mồi thối hóa, nghĩa phải gắn với tổ hợp có mã hóa cho axit amin Mồi thực chức đó: 5’ – ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3’ C T T Các ADN polymerase Là enzym xúc tác cho trình lắp ráp nucleotit A, T, G, C vào mạch ADN tổng hợp Ngày người ta dùng nhiều loại ADN polymerase: Taq ADN polymerase, Pfu ADN polymerase, T4 ADN polymerase, Tth ADN polymerase phổ biến Taq ADN polymerase Taq ADN polymerase tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Vi khuẩn chịu nhiệt độ từ 50oC – 80oC sinh trưởng tối ưu nhiệt độ 70oC Taq ADN polymerase enzym đơn phân, có khối lượng phân tử 90kDa Bản thân enzym chịu nhiệt, xúc tác tái ADN 74 oC chí trì khả hoạt động chức sau ủ 95oC Enzym có hoạt tính polymerase 5’ – 3’ hoạt tính exonuclease 5’ – 3’ khơng có hoạt tính exonuclease ’– 5’ (đọc sửa) Khơng có hoạt tính đọc sửa nghĩa là, bazơ sai xen vào chuỗi polynucleotit tổng hợp khơng bị loại bỏ Taq ADN polymerase có xu hướng tổng hợp có sai sót sinh đột biến sản phẩm PCR Trong thí nghiệm đánh giá in vitro Taq ADN polymerase ghép sai bazơ với tần số 1/10 - 1/105 Tỷ lệ sai sót xấu 1/104, nghĩa 1kb trình tự nhân sau 25 vịng tái khoảng 10% sản phẩm có chứa đột biến Tuy nhiên, đột biến xảy chu kỳ nhân lên chu kỳ sau nên tần số đột biến thực khác thí nghiệm khác Mặc dù vậy, mức độ sai sót có ảnh hưởng khác đến đầu sản phẩm PCR Nếu thí nghiệm PCR thiết kế để xác định có hay khơng có gen cụ thể đoạn ADN đích sai sót q trình nhân bội không ảnh hưởng Tuy nhiên, để nghiên cứu chức gen sai sót tác động nghiêm trọng đến thí nghiệm Một khía cạnh khác hoạt động chức Taq ADN polymerase có xu hướng gắn deoxynucleotit (thường adenosine) vào đầu ’ mạch tổng hợp, không phụ thuộc vào mạch khuôn Kết là, sản phẩm PCR Taq ADN polymerase tạo đầu mà có nucleotit A nhơ đầu ’ Đặc điểm khai thác để tách dòng sản phẩm PCR Sau Taq ADN polymerase, nhiều ADN polymerase khác phát sử dụng Những ADN polymerase có đặc điểm khác biệt Pfu ADN polymerase tách chiết từ Pyrococcus furiosis có hoạt tính đọc sửa exonuclease 3’ – 5’ nên làm giảm tần số đột biến Cũng với tần số đột biến (1/10 4), với Pfu ADN polymerase, có 0,1% sản phẩm PCR chứa đột biến Một số ADN polymerase khác sinh sản phẩm PCR đầu Hoạt tính exonulease 5’ – 3’ Taq ADN polymerase có nghĩa enzym có khả phân hủy mồi oligonucleotit dùng phản ứng Điều đặc biệt có ý nghĩa bước gây biến tính chu kỳ 1, mà oligonucleotit không gắn vào khuôn ADN polymerase tự dung dịch Vào chu ky gia nhiệt đầu tiên, nhiệt độ hỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng (hoặc từ 4oC phản ứng thiết kế đá) đến 94 oC Điều có nghĩa là, thời điểm đó, nhiệt độ bên ông nghiệm 72oC – nhiệt độ tối ưu cho polymerase – enzym lại khơng có khả tái ADN khơng có oligonucleotit gắn vào khuôn Việc qua nhiệt độ mà khơng tái có xu dẫn đến phân hủy mồi làm cho thí nghiệm khơng hiệu Để giải khó khăn này, để ngăn ngừa sản phẩm PCR khơng đặc hiệu, bổ sung Taq ADN polymerase vào hỗn hợp 94oC Như vừa giúp làm tăng sản phẩm vừa tăng tính đặc hiệu phản ứng Cách khác là, Taq ADN polymerase trộn với kháng thể đặc hiệu gắn kết với enzym để ức chế hoạt tính Phức hệ kháng thể enzym ức chế tái ADN nhiệt độ thấp, lại tách nhiệt độ cao nên enzym hoạt động chức Có thể sử dụng hỗn hợp ADN polymerase với đặc tính khác phản ứng đặc biệt Ví dụ, Taq ADN polymerase sinh nhiều sản phẩm PCR với kích thước tối đa – 7kbp sản phẩm lại có nhiều sai sót; Pfu ADN polymerase sinh sản phẩm sai sót khơng tạo sản phẩm tới 7kbp Hỗn hợp ADN polymerase (15 phần Taq: 10 phần Pfu) hiệu để nhân xác đoạn ADN có kích thước đến 35kbp Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP) Các dNTP gồm loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP nguyên liệu tham gia tạo nên mạch ADN Nồng độ tối ưu dNTP thường dùng 100 – 200 µ M Tuy nhiên, nồng độ dNTP thấp (10 – 100 µ M) Taq ADN polymerase hoạt động xác Dung dịch đệm (buffer) Thành phần dung dịch phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzym ADN polymerase sử dụng PCR, quan trọng ion Mg 2+ Ví dụ, thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR sử dụng Taq ADN polymerase bao gồm; Tris-HCl 100 µ M với pH = 25oC KCl 500 µ M Gelatin 0,01% MgCl2 2mM Nồng độ ion magie có vai trị quan trọng thành công phản ứng PCR Magie cần cho ADN polymerase hoạt động chức phản ứng PCR cụ thể cần nồng độ ion magie khác Nếu nồng độ magie thấp, phản ứng khơng thành cơng polymerase khơng hoạt hóa thích hợp Nếu nồng độ magie cao, phản ứng tính đặc hiệu nhiều sản phẩm tạo Nồng độ magie tối ưu xác định dựa vào kinh nghiệm với mồi thường khoảng 0,5 – 5mM Đệm muối phản ứng (Tris KCl) thường giữ ổn định số protocol giảm bớt mức độ KCl để kích thích polymerase bám mạch khn lâu tăng số lượng sản phẩm IV Thiết bị dụng cụ cho PCR 11 Phản ứng PCR thực máy chu trình nhiệt Đây máy đun nóng làm nguội ống phản ứng nhiệt độ xác cho phản ứng Để ngăn ngừa bay hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy máy PCR đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng ít, người ta cho lớp dầu (natural oil) lên bề mặt hỗn hợp phản ứng Máy nhân gen PCR Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác, tránh tối đa bốc nước Có thể tiến hành PCR mơ tế bào Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuyếch đại riêng nên thí nghiệm nghiên cứu cần tiến hành loại Ống nghiệm dùng nghiên cứu phải kiểu đặc tính truyền nhiệt ống nhiệt độ tiếp xúc ống phận tỏa nhiệt thiết bị có ảnh hưởng lớn đến q trình khuyếch đại V Các giai đoạn PCR Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, chu kỳ gồm bước chính: Gây biến tính ADN Dùng để tách hai mạch ADN đích Nhiệt độ thường dùng khoảng 94oC Gắn mồi 12 Hai mạch ADN đích làm lạnh có mặt mồi Các mồi nhận biết gắn vào mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung Các mồi thiết kế cho đầu ’ định hướng đoạn trình tự cần nhân nên trình tổng hợp ADN diễn hai mạch, qua suốt vùng trình tự Nhiệt độ để gắn mồi phụ thuộc vào độ dài, trình tự mồi mức độ đặc hiệu cần thiết phản ứng PCR cụ thể Nhiệt độ gắn mồi thường dao động từ 45 – 60oC Kéo dài chuỗi ADN polymerase gắn vào đầu 3’ tự mồi sử dụng dNTP để tổng hợp mạch theo chiều ’ – 3’ Những thí nghiệm PCR thường dùng đoạn Klenow ADN polymerase I làm enzym tái bị phân hủy nhiệt độ giai đoạn biến tính nên thường phải bổ sung enzym Việc phát sử dụng Taq ADN polymerase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus bước đột phá Taq ADN polymerase giữ nguyên hoạt tính nhiệt độ đến 94oC Điều có nghĩa khơng phải bổ sung enzym q trình phản ứng xảy Taq ADN polymerase có hoạt tính tối ưu 72oC Sau chu kỳ đầu, hai phân tử ADN tạo Vị trí gắn kết mồi nơi khởi đầu q trình tổng hợp mạch theo nguyên tăc bổ sung với trình tự nucleotit mạch khn Q trình tổng hợp mạch kết thúc nào? Nếu nhìn kết phản ứng PCR gel agarose, thấy có băng nhất, nghĩa chúng bắt đầu kết thúc điểm Để tìm hiểu điều này, theo dõi vài chu kỳ phản ứng PCR Ở chu kỳ đầu, hai mạch ADN tách bắt đầu tái từ điểm gắn mồi Hai mạch có đầu 5’ xác định mồi đầu 3’ chưa xác định Q trình tổng hợp khơng kết thúc điểm xác định dừng lại giai đoạn biến tính chu kỳ Mỗi mạch tạo chu kỳ thành khn để gắn mồi q trình tổng hợp mạch 13 mạch khuôn giới hạn hai đầu 3’, 5’ Điều xảy trình tái dừng lại khơng cịn trình tự để tái tiếp Vậy là, chu kỳ tạo phân tử ADN có đầu ’ xác định đầu 3’ chưa xác định chắn Các phân tử tiếp tục làm khuôn để gắn mồi chu kỳ Ở chu kỳ 3, trình tổng hợp tạo phân tử ADN có trình tự hai đầu xác gen đích Các chu kỳ nhân gen đích theo cấp số nhân Sau 25 chu kỳ, thu khoảng 30 triệu gen đích Tất phản ứng PCR có chứa lượng khơng đáng kể phân tử ADN có đầu chưa thật Tuy nhiên, điều khơng ảnh hưởng đến kết phản ứng Các bước thực chu kỳ PCR Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR điển hình thường là: - 90oC, 30 giây – gây biến tính ADN - 60oC, 30 giây – gắn mồi - 72oC, phút – tổng hợp Giai đoạn biến tính gắn mồi thường ngắn phù hợp để phá hủy tái tạo liên kết hydro hai mạch ADN Các protocol trước thường có giai đoạn biến tính 94oC, phút để đảm bảo ADN khn hồn 14 tồn tách Hiện thường khơng việc xử lí nhiệt độ cao, lâu thường gây vết đứt ADN khuôn Chiều dài sản phẩm PCR xác định thời gian giai đoạn tổng hợp phản ứng Hầu hết polymerase sử dụng phản ứng PCR tái in vitro với tốc độ khoảng 500 – 1000 bp/ phút Thời gian giai đoạn tổng hợp thay đổi phụ thuộc vào độ dài sản phẩm PCR Sau hoàn thành, số protocol thêm giai đoạn cuối (72 oC, phút) để đảm bảo tất phân tử ADN phản ứng tái thành dạng mạch kép Giai đoạn làm tăng hiệu tách dòng sản phẩm PCR Số lượng chu kỳ phản ứng PCR Số chu kỳ phản ứng thí nghiệm PCR phụ thuộc vào lượng ADN khuôn ban đầu lượng ADN cần thu sau phản ứng Nói chung, thí nghiêm PCR thường thiết kế gồm từ 17 – 25 chu kỳ Nếu kéo dài 30 chu kỳ khả sai sót tăng theo phản ứng PCR diễn qua hai giai đoạn: - Giai đoạn đầu: Số lượng tăng theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu - Sau đó, hiệu khuyếch đại giảm dần do: + Phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng + Xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng + Các vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với Số lượng sau n chu kỳ a x 2n (a số đoạn khuôn) VI Thu nhận kết Thông thường sau thực phản ứng PCR, cần tiến hành điện di gel agarose để xác định chất lượng đoạn ADN Các bước tiến hành sau: 15 - Chuẩn bị gel để điện di: Lấy 0,8 gam bột agarose hòa tan 100ml đệm TAE lần (Tris – bazơ 48,8g/l; axit axetic 10,2ml/l; EDTA 0,5M 20ml/l có pH = 8,0) Đun nóng đến 50oC đổ dung dịch vào khn gel cài lược để tạo thành giếng nhỏ Độ dày gel tùy thuộc vào mục đích sử dụng Để gel đông ổn định 30 – 40 phút nhiệt độ phòng Rút lược khỏi khuôn Đặt khay gel vào bể điện di sau đổ TAE lần tới ngập mặt gel khoảng 2mm - Tra mẫu: Mẫu trộn theo tỷ lệ µ l ADN + µ l đệm tra mẫu 10X + µ l nước cất để tổng thể tích 10 µ l Thêm vài giọt Bromophenol Blue làm thị màu để quan sát chuyển động mẫu trình điện di - Chạy điện di: Đặt khay gel vào máy điện di Chạy điện di với điện 60 – 80V (10V/cm) Quan sát vạch màu đến cuối gel dừng lại - Nhuộm gel: Gel sau chạy điện di nhuộm Ethidium Bromid (5 µ g/ml) 15 phút Lắc nhẹ Rửa gel nước cất, sau soi gel để xem băng ADN ánh sáng đèn tử ngoại Nếu băng gọn rõ sản phẩm PCR tốt VI Ưu điểm hạn chế kỹ thuật PCR 1.Ưu điểm - Thời gian thực cực nhanh : Chỉ cần để khuyếch đại trình tự ADN quan tâm, so với phương pháp tạo dòng kỹ thuật tái tổ hợp ADN phải tuần lâu - Đơn giản tốn : Nó thực ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu sử dụng đồng thời Trong đó, phương pháp tạo dịng điển hình cần vật liệu đắt tiền màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng xạ việc thực cần thao tác khéo léo đặc biệt - Độ tinh mẫu không cần cao : PCR thực với mẫu nucleic acid thơ Ví dụ, mẫu hay dấu vết phân tích pháp y 16 Điều ngược với kỹ thuật tái tổ hợp ADN, đoạn gen vector cần tương đối tinh khiết - PCR giúp phân biệt gen đột biến đoạn, thêm đoạn hay đột biến điểm - Dùng để định lượng so sánh cách cho tiến hành khuyếch đại đồng thời trình tự đích trình tự chứng có nồng độ biết Nhờ ưu trên, PCR hấp dẫn nhà nghiên cứu từ lúc đời việc khyếch đại trình tự nucleic acid đặc hiệu chẩn đoán phân tử Giới hạn phương pháp phải biết trình tự nucleotit (hoặc phần) đoạn cần khuyếch đại Nó khơng thay kỹ thuật tái tổ hợp ADN mà góp phần đáng kể bổ sung cho kỹ thuật Hạn chế Do độ nhạy cao nên PCR vừa đơn giản, có khuynh hướng sử dụng rộng rãi lại gặp khơng khó khăn a Trong thực nghiệm kích thước trình tự cần khuyếch đại giới hạn Trừ vài trường hợp cá biệt, PCR không hoạt động với phân tử ADN có kích thước lớn 3kb PCR cho kết tốt độ dài ADN 1,5 kb b Sự ngoại nhiễm vấn đề lớn đặt PCR gắn liền với khả khuyếch đại phương pháp Vấn đề cấp thiết ứng dụng chẩn đoán, dự phịng hậu nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn sản phẩm khuyếch đại lần thao tác trước Người ta chứng minh việc mở nắp ống nghiệm sau lần khuyếch đại khoảng khơng gian kín phịng thí nghiệm khiến cho phân tử khuyếch đại ngồi bay lơ lửng khơng khí bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ thí 17 nghiệm,…rồi nhiễm vào phản ứng tiến hành sau Có thể khắc phục phần vấn đề số biện pháp sau - Các công đoạn thao tác khác thiết lập phản ứng PCR phân tích sản phẩm khuyếch đại phải tiến hành địa điểm cách xa - Dụng cụ để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào thao tác khác Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh nhiễm đầu micropipette phân tử khuyếch đại hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ phân tử lại từ lần khuyếch đại trước - Tất thành phần phản ứng chia thành lượng nhỏ, tính tốn cho đủ với 1, lần thao tác - Ngoài hãng sản xuất đưa thị trường nhiều hệ thống chép cho phép loại bỏ hồn tồn ngoại nhiễm Ví dụ: Perkin – Elmer – Cetus đề suất sử dụng dUTP thay dTTP, việc thay khơng ảnh hưởng đến phản ứng Trước lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracyglycosylase; enzyme phân hủy tất ADN có mang dUTP nhiễm từ lần trước Đồng thời, enzyme phân hủy nhiệt từ lần biến tính Các hệ thống gặp phải bất lợi lớn phổ biến giá thành cao c Các sai sót gây Taq polymerase Sự chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao (10 -4 nghĩa 10.000 nucleotit enzyme gắn sai nucleotit) Đặc tính khơng nghiêm trọng ta cần xem xét kích thước hay có mặt sản phẩm khuyếch đại, có ý nghĩa lớn cần xác định xác trình tự nucleotit ADN Ta khơng thể loại bỏ hồn tồn sai sót mà giảm bớt; Ví dụ cân nồng độ nucleotit phản ứng, xác định trình tự nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so 18 sánh trước đến trình tự thức sử dụng ADN polymera chịu nhiệt có tính trung thực cao như: VentTM, Pfu, Ultma ADN polymerase VII Ứng dụng kỹ thuật PCR PCR việc chẩn đoán bệnh di truyền Khả nhân bội trình tự ADN đặc hiệu giúp trở thành cơng cụ có giá trị việc chẩn đốn dị tật di truyền đột biến Vì cần phải biết trình tự ADN nhân bội trước tiến hành PCR nên vị trí đột biến phải biết trước Ưu trội PCR cần lượng nhỏ ADN để chẩn đoán Các tế bào máu, niêm mạc vật liệu thích hợp để chẩn đốn người lớn ; bào thai (gọi chẩn đoán in utero), cần lượng nhỏ lông tơ màng đệm PCR sử dụng để phát đột biến xen/mất đoạn đột biến điểm Nhiều kỹ thuật phát đột biến nhờ sử dụng PCR phát triển Ở đây, bàn đến vài kỹ thuật số 1.1 Đột biến xen/mất đoạn Hội chứng Waardenburg bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, đặc trưng tật điếc hình thành sắc tố khơng bình thường Khoảng 2% số người điếc bệnh Dấu hiệu kèm theo thường thấy túm tóc trắng trước trán lơng mi trắng Một số dang hội chứng Waardenburg đột biến gen PAX – gen quy định nhân tố phiên mã tham gia điều hòa phát triển phôi Một đột biến phát bệnh nhân mắc hội chứng Waardenburg đoạn 18bp vùng mã hóa nơi gắn kết nhân tố phiên mã Bằng PCR phát đoạn bệnh nhân mắc hội chứng Waardenburg khác PCR đoạn trình tự ADN bình thường gen cho sản phẩm đoạn ADN gồm 156bp cịn trình tự đột biến sinh đoạn ADN ngắn (138bp) Dễ dàng tách hai đoạn ADN gel poly Acrylamide agarose Như vậy, phát đột biến dựa vào kích thước sản phẩm PCR Trong trường hợp này, bệnh biểu trội nên hầu hết người mắc bệnh dị hợp tử, mang 19 gen bình thường gen đột biến Sản phẩm PCR thể dị hợp tử sinh hai đoạn ADN kích thước khác (156 138bp) 1.2 Đột biến điểm Phương pháp dùng để phát đột biến điểm Các mồi tạo đoạn ADN có kích thước nhau, người mang đột biến người bình thường Khi cần phải phân tích trình tự ADN tốn thời gian Vậy, cách sử dụng PCR để phát đột biến điểm? Phương pháp PCR alen đặc hiệu khai thác đặc tính là, để tổng hợp ADN hiệu nhờ ADN polymerase mồi phải ghép đơi xác đầu 3’ PCR alen đặc hiệu phát đột biến gen β - globin gây bệnh hồng cầu hình liềm Để phát đột biến điểm, phải thiết kế mồi tham gia vào hai phản ứng PCR Một mồi chung cho hai phản ứng, hai mồi lại (mồi mồi 2) dùng để phát trình tự bình thường trình tự đột biến PCR trình tự ADN bình thường diễn với mồi mồi Với mồi phản ứng khơng thành cơng ghép đơi sai trình tự bình thường đầu ’ mồi Tương tự, PCR với trình tự ADN đột biến thất bại với mồi và thành công với mồi Ở đây, so sánh trình tự ADN bình thường với cá thể đồng hợp tử đột biến Nếu cá thể dị hợp tử hai phản ứng PCR diễn bình thường Để đảm bảo phản ứng PCR thực xác, người ta thường đưa vào thí nghiệm mồi đối chứng – mồi nhân vùng gen khơng liên quan Vì vậy, ln có mặt băng điện di – băng PCR đối chứng Cơng việc cịn lại tìm xem có hay khơng có băng bổ sung Tách dịng sản phẩm PCR Chúng ta thấy, tách dòng sản phẩm PCR cách xen thêm trình tự cho enzym giới hạn nhận biết vào đầu ’ mồi Cũng tách dịng trực tiếp sản phẩm PCR cách lợi dụng ưu hoạt tính tranferase kết thúc chuỗi Taq ADN polymerase để bổ sung a vào đầu ’ 20 sản phẩm PCR Kết là, hầu hết phân tử ADN nhân bội nhờ Taq ADN polymerase có đầu 3’ – A so le Trong q trình gọi tách dịng TA, đầu so le gắn với vectơ mạch thẳng T mang đầu so le 3’ – T hai đầu nhằm tách dòng trực tiếp với hiệu cao sản phẩm PCR Điều không xảy với phân tử ADN đầu tù Polylinker Cắt R1 (ví dụ: EcoRV) R1 ADN ligase Taq ADN polymerase + dNTP T- ’ 3-T ’ Vectơ T Sản phẩm Plasmid + 3’–A– Sản phẩm PCR –A–3’ Sơ đồ tách dòng TA sản phẩm PCR Vectơ plasmit cắt enzym giới hạn tạo đầu (ví dụ cắt EcoRV) Sau vectơ xử lý Taq polymerase với có mặt dTTP Hoạt tính tranferase kết thúc chuỗi polymerase xúc tác bổ sung dT vào đầu 3’ – hydroxyl ADN Trộn vectơ T tạo với sản phẩm PCR Taq polymerase xúc tác tổng hợp, chúng kết hợp lại nhờ enzym ADN ligase Như sản phẩm PCR tách dòng vào vectơ T PCR hoàn thiện nhanh, nhiều biến dạng PCR đời : - RT – PCR (reverse transcriptase PCR) gọi RNA – PCR hay RT – PCR RT – PCR nhạy phương pháp khác dùng cho phân tích ARN - RT – PCR cạnh tranh (Competitive RT – PCR) kỹ that thường dùng định lượng loại mARN chuyên biệt 21 - Real – Time PCR đánh giá tích lũy sản phẩm định lượng qPCR (quantitative PCR – PCR định lượng) Ngoài số kỹ thuật PCR khác nữa… VIII RT – PCR Như biết, PCR kỹ thuật nhân bội ADN mạch kép Tuy nhiên, vật liệu khởi đầu cho PCR không thiết phải ADN Phản ứng chuỗi trùng hợp – phiên mã ngược hay gọi tắt RT – PCR phát minh sử dụng phương pháp nhân ARN phân tích sau chuyển thành ADN nhờ phiên mã ngược RT – PCR dùng để tách dòng, xây dựng thư viện cADN tổng hợp mẫu Kỹ thuật gồm hai phần : Tổng hợp ADN từ ARN nhờ phiên mã ngược (RT) nhân bội phân tử ADN đặc hiệu phản ứng PCR AAA – 5’ 3’ Mồi RT RT mARN 5’’ ’ 5’ AAA – 3’ 5’ ADN Mồi ’ 3’ ’ PCR: Chu kỳ 5’ Taq 3’’ 5’ ’ Mồi PCR: Chu kỳ 5’’ 5’ 3’ 3’ 5’’ 3’ Mồi Sản phẩm nhân bội Sơ đồ phản ứng RT – PCR 22 Phản ứng RT sử dụng khuôn ARN (ARN tổng số poly – A +ARN), mồi (ngẫu nhiên oligo dT), dNTP, dung môi enzym tái ngược để tổng hợp phân tử ADN mạch đơn bổ trợ với ARN (cADN) Sau cADN làm khn cho phản ưng PCR Ở chu kỳ đầu, ADN mạch kép tạo từ ADN mạch đơn thông qua gắn kết mồi bổ trợ khác Taq ADN polymerase Giống phương pháp phân tích mARN khác, RT – PCR dùng để định lượng mARN mẫu ban đầu Kiểu phân tích đặc biệt quan trọng để kiểm tra biến đổi biểu gen Tuy nhiên, sản phẩm PCR tăng theo cấp số nhân nên sai khác nhỏ tỷ lệ mẫu nhân lên vậy.Vì vậy, RT – PCR cần tối ưu hóa cẩn thận sử dụng để phân tích định lượng mARN Sự định lượng thường hai dạng: tương đối tuyệt đối IX REAL – TIME PCR Trong sinh học phân tử, real – time PCR (PCRđúng thời điểm) kỹ thuật phịng thí nghiệm dựa phản ứng PCR dùng để nhân bội định lượng đồng thời phân tử ADN đích Nó có khả vừa phát vừa định lượng trình tự đặc hiệu mẫu ADN Quy trình giống nguyên tắc chung kỹ thuật PCR; đặc điểm real – time PCR ADN nhân bội định lượng phổ biến dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang xen vào ADN mạch kép dùng mẫu dò ADN oligonucleotit biến đổi để phát huỳnh quang lai với ADN bổ trợ Thông thường, phản ứng PCR thời điểm kết hợp với RT – PCR để định lượng mARN có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu gen cách tương đối thời điểm cụ thể tế bào mơ cụ thể ADN định lượng thuốc nhuộm ADN mạch kép Thuốc nhuộm ADN mạch kép gắn vào tất phân tử ADN mạch kép tạo phản ứng PCR phát huỳnh quang hàm lượng ADN tăng lên 23 phản ứng dẫn đến tăng cường độ phát huỳnh quang đo sau chu kỳ phản ứng, nhờ định lượng nồng độ ADN Tuy nhiên, số loại thuốc nhuộm ADN mạch kép, SYRB Green gắn vào tất phân tử ADN mạch kép, kể mồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, làm cho việc định lượng xác Để định lượng phản ứng PCR chuẩn bị theo cách thông thường bổ sung thêm thuốc nhuộm Đo mức độ phát huỳnh quang sau chu kỳ phản ứng so sánh với thang nồng độ ADN pha loãng chuẩn để định lượng Ngồi ra, người ta sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang để định lương ADN xác hơn, giá thành lại cao Mẫu dò thường sử dụng TaqMan, loại mẫu dò dựa truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang lai Mẫu dị TaqMan oligonucleotit có chứa thuốc nhuộm phát huỳnh quang, thường gắn vào bazơ đầu 5’ thuốc nhuộm dập tắt, thường gắn vào đầu 3’ Mẫu dò thiết kế để lai với vùng sản phẩm PCR Khi phát xạ, thuốc nhuộm phát quang bị kích thích truyền lượng cho phân tử thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh không phát sáng, tạo nên chất không phát huỳnh quang Trong q trình PCR enzym polymerase tái khn có mẫu dị gắn vào, hoạt tính ’ - 3’ enzym cắt bỏ mẫu dị Động thái tách thuốc nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm dập tắt truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang không xảy Sự phát huỳnh quang tăng lên chu kỳ PCR, tỷ lệ với tốc độ mẫu dị bị cắt bỏ đo lường 24 KẾT LUẬN Việc đề suất phương pháp PCR tạo bước tiến mang tính cách mạng sinh học phân tử nói riêng sinh học nói chung nhờ việc cho phép phân lập, xác định gen, sâu nghiên cứu chức biểu gen trình phát triển phản ứng gen điều kiện mơi trường, cho phép tiến hành nghiên cứu mà trước thực Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử chuẩn đoán bệnh di truyền người, di truyền quần thể, phân tích pháp y an ninh hình sự,…cho kết cao 25 ... bản, phiên mã dịch mã Trong số tiến kỹ thuật góp phần tạo bùng nổ lĩnh vực sinh học phân tử phải kể tới kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR Kary Mullis đề suất vào năm 1985,... biệt 21 - Real – Time PCR đánh giá tích lũy sản phẩm định lượng qPCR (quantitative PCR – PCR định lượng) Ngồi cịn số kỹ thuật PCR khác nữa… VIII RT – PCR Như biết, PCR kỹ thuật nhân bội ADN mạch... RT – PCR (reverse transcriptase PCR) gọi RNA – PCR hay RT – PCR RT – PCR nhạy phương pháp khác dùng cho phân tích ARN - RT – PCR cạnh tranh (Competitive RT – PCR) kỹ that thường dùng định lượng