KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) ppt

KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. MỞ ĐẦU:  Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại in vitro có chọn lọc bằng tạo dòng in vitro mà không cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong bộ gien được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn đó đã biết. II. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN:  Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi này. Các sợi ADN khuôn mạch đơn có thể tạo ra theo cách đơn giản là đun nóng dung dịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi.  ADN polymerase cũng đòi hỏi phải có một đoạn ngắn ADN mạch đơn (đoạn mồi) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Do đó, để khởi đầu quá trình tổng hợp cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này gắn bổ sung vào ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.  Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia (Hình 1c). Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' Các đoạn mồi Các đoạn mong muốn … và cứ thế tiếp tục Hình 1. Sơ đồ nguyên lý ph ản ứng chuỗi trùng hợp PCR. (Để đơn giản hóa sơ đ ồ, từ phần (d) không vẽ hai sợi ADN khuôn ban đầu) b) Các sợi tách nhau ra khi gia nhiệt 94 o C, sau đó hạ xuống 30-65 o C, trong 30 giây để các đoạn mồi gắn vào hai vị trí tương hợp trên ADN c) Taq polymerase tổng hợp các sợi ADN mới tương hợp với sợi khuôn, bắt đầu từ đoạn mồi kéo dài về phía đoạn mồi nằm bên sợi kia. d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia nhiệt. Sợi ban đầu và sợi mới tổng hợp tách nhau ra. Trên hai sợi mới tổng hợp xuất hiện 2 điểm bám cho các đoạn mồi gắn vào. e) Taq polymerase tổng hợp các sợi ADN tương hợp mới, nhưng các chuỗi mới lần này chỉ tiến đến đúng vị trí đã được xác định bởi các cặp đoạn mồi đã lựa chọn. f) Quá trình được lặp lại, các đoạn mồi tiếp tục gắn vào các sợi mới tổng hợp. g) Taq polymerase tổng hợp các đoạn tương hợp sinh ra hai đoạn ADN mạch kép giống hệt đoạn cần tổng hợp. Quá trình cứ thế tiếp tục. a) Vật liệu khởi đầu là phân tử ADN mạch kép  Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2 n-2 bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi (Bảng1). Bảng 1. Hiệu quả nhân ADN của kỹ thuật PCR S ố chu kỳ (n) S ố phân tử ADN mạch kép sinh ra S ố chu kỳ (n) S ố phân tử ADN mạch kép sinh ra 1 0 17 32.768 2 0 18 65.536 3 2 19 131.072 4 4 20 262.144 5 8 21 524.288 6 16 22 1.048.567 7 32 23 2.097.152 8 64 24 4.194.304 9 128 25 8.388.608 10 256 26 16.777.216 11 512 27 33.544.432 12 1.024 28 67.108.864 13 2.048 29 134.217.728 14 4.096 30 268.435.456 15 8.192 31 536.870.912 16 19.384 32 1.073.741.824 III. CÁCH TIẾN HÀNH MỘT PHẢN ỨNG DÂY CHUYỀN TỔNG HỢP ADN:  PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tương đối dễ làm, rất đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi.  Vật liệu gồm trước hết là ADN có chứa đoạn cần nhân lên. Không cần thiết phải tách riêng đoạn cần nhân lên vì việc đó đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Hàm lượng ADN cần cho phản ứng rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần một microgram ADN hệ gien (chromosome) là đủ. Trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử riêng lẻ. Hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN, ADN polymerase, và hỗn hợp của tất cả bốn tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP) và dung dịch đệm có ion Mg 2+ cần được đưa vào ống nghiệm có chứa ADN khuôn. Dung tích tổng số thường là 50 ml hoặc 20 ml. Hỗn hợp phản ứng được cho vào ống nhựa nhỏ chịu nhiệt, có nắp đậy.  Bước 1: làm nóng hỗn hợp phản ứng đến khoảng 94 o C. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép tách nhau ra hoàn toàn, tạo nên các sợi đơn để dùng làm khuôn cho các đoạn mồi và ADN polymerase.  Bước 2: nhiệt độ được hạ xuống 30 – 65 o C để các đoạn mồi (số lượng rất lớn) gắn với các trình tự bổ sung trên các phân tử ADN khuôn (do số lượng mồi lớn nên liên kết giữa mồi và ADN khuôn xảy ra chủ yếu so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn). Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đây thay đổi tùy thuộc vào chiều dài của đoạn ADN cần nhân lên (từ 30 – 70 o C). Các điều kiện này sẽ tạo ra khuôn được mồi để cho ADN polymerase hoạt động.  Bước 3: nhiệt độ được nâng lên 72 o C trong khoảng 5 phút để ADN được tổng hợp. Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzyme Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa được nâng lên 94 o C, nhưng lần này chỉ trong vòng 30 giây để cho các mẩu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban đầu và sợi mới được tổng hợp) tách nhau ra. Các sợi đơn này trở thành khuôn cho một chu kỳ tổng hợp ADN khác. Tóm lại, một chu kỳ gồm: đun nóng để tách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi khuôn, và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, được lặp lại từ 30 đến 60 lần (Hình 1). IV. CÁC THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG: Một phản ứng PCR có thể gồm các thành phần hay các vật liệu ban đầu: mạch khuôn cho sự khuếch đại, các đoạn mồi oligonucleotide, dNTP, và ADN polymerase chịu nhiệt với dung dịch đệm phản ứng thích hợp và MgCl 2 . Nồng độ của mỗi thành phần này tùy yêu cầu. Trừ ADN khuôn và các đoạn mồi, các thành phần cho PCR đều có sẵn từ các nhà cung cấp. 1. Các polymerase chịu nhiệt:  Enzyme ADN polymerase được sử dụng đầu tiên trong PCR là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Đặc tính của đoạn này là xúc tác sự tổng hợp ADN theo chiều 5’- 3’ và có hoạt tính exonuclease (thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu phân tử ADN) theo chiều 3’-5’. Tuy nhiên enzyme này không chịu được nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại không đặc hiệu vv…).  Hiện nay thường dùng ADN polymerase là Taq polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một loài vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.  Taq polymerase có sẵn trên thị trường từ các công ty hàng đầu về công nghệ sinh học. Các polymerase chịu nhiệt khác có trên thị trường bao gồm Vent polymerase được phân lập từ Thermococcus litoralis, nó sẽ cho nhiều bản sao chính xác từ mạch khuôn hơn là Taq polymerase. Ngoài ra còn có Tth polymerase được phân lập từ Thermus thermophilus. Các polymerase chịu nhiệt là thành phần đắt nhất của PCR và thường được sử dụng ở nồng độ là 1 đơn vị cho một phản ứng. Nồng độ này đủ để xúc tác cho sự khuếch đại khoảng 40 chu kỳ bằng máy PCR.  Trước đây, việc lựa chọn polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm thì không mấy khó khăn vì chỉ có một loại ADN polymerase chịu nhiệt (Taq). Hiện nay có nhiều loại polymerase có nguồn gốc khác nhau, nhiều bản sao của các polymerase này được biến đổi di truyền và chúng có thể ưu việt hơn polymerase gốc trong phạm vi một vài ứng dụng (Bảng 2). Sự chọn lựa một polymerase chịu nhiệt cho một thử nghiệm PCR phụ thuộc vào yêu cầu của từng thử nghiệm. [...]... THUT PCR CI TIN: Phn ng PCR c ỏp dng rng rói v cú nhng bin i phự hp vi tng mc ớch nghiờn cu riờng Vỡ vy chỳng ta gp nhiu phng phỏp khỏc nh PCR t (Nested -PCR) , ADN nhỏnh (Branch-DNA), PCR a thnh phn (multiplex -PCR) , PCR ngc (Reverse -PCR) , RAPD -PCR vv nhng tt c u da trờn nguyờn tc ca phn ng PCR 1 PCR t: t c mc nhy cm cao trong PCR, ngi ta cú th thc hin 2 PCR liờn tip Trờn mt in di , cỏc on t c sau PCR. .. ca ADN ớch bi s lai húa khụng c hiu PCR th 2 c thc hin vi cỏc mi ging nhau, khuch i cỏc sn phm to thnh ca PCR th nht PCR t cú c hiu cao: trong k thut ny, s dng 2 cp mi khỏc nhau Cp mi ngoi: Cp mi ny to ra cỏc on ADN c khuch i ging vi PCR c in Chỳng c hiu cho 2 trỡnh t mỳt ca ADN cn khuch i Cỏc on ADN thu c (vớ d on thu c cú khong 258 cp base) lm khuụn mu cho PCR th 2 Cp mi ni: Cp mi ny b sung vi... cú ỏi lc mnh i vi biotin), v cui cựng ngi ta o hot tớnh phúng x kt lun mu l dng tớnh hay õm tớnh (hỡnh 2) PCR t cú nhy cao hn PCR tiờu chun l do lp li s khuch i sn phm t mt PCR th 1 vi mt PCR th 2 Tuy nhiờn vn ngoi nhim cng l vn hn ch ca nú 2 ADN nhỏnh: Nguyờn tc: ADN ớch c khuch i bng PCR, sau ú cho lai vi on dũ (l mt phn c hiu ca ADN ny), tớn hiu c lai húa c hiu vi on dũ theo cựng cỏch thc... cp bases) Thut ng PCR t l vỡ cỏc on mi c t, úng hp trong ln PCR u K thut ny cú nhy v chuyờn bit cao Ngi ta dựng k thut ny phỏt hin virus gõy bnh viờm gan C, mt loi virus cú vt liu di truyn l ARN ARN virus khụng th c phỏt hin bng s lai húa trc tip, mt s khuch i phi c thc hin Cn phi chuyn tt c ARN virus thnh cADN, õy chớnh l bc sao mó ngc nh s khuch i ca cADN bng k thut PCR t Trong PCR th 2, mt mi... s dng thng xuyờn trong cỏc xột nghim chn oỏn, s dng 2 b mi khỏc nhau: b th nht xỏc nh s ng nht ca PCR v b th hai nhm vo cỏc trỡnh t ADN d tha PCR a thnh phn cng cú th c s dng trong phũng thớ nghim vi sinh lõm sng vi cựng on dũ cho mt mu xột nghim cho vi sinh vt khỏc nhau trong mt ng PCR Khi tin hnh PCR a thnh phn cn phi xem xột mt s yu t trong thit k on mi Cỏc mi phi cú nhit lai tng t nhau S khỏc... Hn hp phn ng ca PCR ca ARN bao gm : Tth pol, 2 loi mi oligonucleotide (mt c s dng cho s tng hp cADN, v c 2 c s dng cho PCR ), ion mangan dng MnCl2, v tt c cỏc thnh phn khỏc cn cho s phiờn mó ngc v PCR Mỏy chu k nhit c un núng trc n 70oC, v nhng thnh phn phiờn mó ngc c trong 15 phỳt Sau phn ng nh reverse transcriptase, hn hp phn ng c nõng nhit lờn 95oC lm bin tớnh phc hp ARN-ADN PCR sau ú c bt u... phiờn mó ngc l 70oC do vy c hiu v nhy ca vic phỏt hin ARN ớch cao VIII CC LNH VC NG DNG CA K THUT PCR: Trong nghiờn cu khoa hc, k thut PCR giỳp ớch hu hiu cho vic xỏc nh trỡnh t nucleotid ca cỏc on ADN c nhõn; cú th s dng PCR tỏch dũng nhng on ADN c hiu, mc dự trong nhiu trng hp tỏch dũng khụng cn n PCR; nú giỳp phỏt hin t bin, nghiờn cu ARNm hoc to cỏc t bin gien, cho phộp phõn tớch liờn kt gien... GC? 3 Nờu ng dng ca phn ng chui PCR? 4 Túm tt cỏc k thut ci tin ca PCR? Ti liu tham kho 1 H Hunh Thựy Dng (1998), Sinh hc phõn t (Khỏi nim Phng phỏp ng dng), Nxb Giỏo dc 2 Nguyn Th Phng Lan (2001), Sinh hc phõn t, Nxb 3 Nguyn c Lng (2001), Nguyờn lý k thut di truyn, Nxb T bo VK DNA ớch 5' 3' 3' 5' on mi Taq polymerase Mỏy luõn nhit (Thermocycler) in di sn phm PCR Sn phm PCR Restriction enzyme DNA ct... k Vỡ vy, da vo cỏc phn ng ó c thc hin, nhit cú th thay i t 37oC n 65oC VI U IM V NHC IM CA PHNG PHP PCR: Vic ng dng rng rói k thut PCR cú nhiu lý do: Rt nhanh chúng Ch tn khong 3 gi l cú th khuch i mt trỡnh t mong mun ó bit so vi cỏc k thut cụng ngh di truyn c in phi mt mt tun hay hn na  n gin: PCR cú th c thc hin trong mt ng nh vi cỏc thnh phn ti thiu v ch vic trn chỳng li vi nhau Cỏc phng phỏp... triphosphate c ỏnh du phúng x v cỏc k thut c bit PCR cú th c thc hin trờn cỏc mu cú cha ADN tng i thụ, vớ d vt mỏu cha c x lý cho vic phõn tớch phỏp y iu ny ngc vi cỏc phng phỏp v thao tỏc gien l cn phi cú ADN c khuụn mu ln vector tng i tinh khit Cỏc yu t trờn cho thy rng PCR l mt s thay i ỏng k so vi cỏc phng phỏp c in cho vic khuch i cỏc trỡnh t c bit Nhy: Phn ng PCR cc nhy vỡ cú th ch cn dựng mt phõn t . KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) I. MỞ ĐẦU:  Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn. ñích A B a C Khueách ñaïi Hình 3 Kỹ thuật ADN “nhánh” sử dụng 5 đoạn dò 3. Kỹ thuật PCR đa thành phần:  Trong kỹ thuật này, 2 hay nhiều ADN đích được khuếch đại đồng thời. PCR đa thành phần có thể. không hẳn là thay thế các kỹ thuật này. Do vậy người ta không sử dụng kỹ thuật này trong các kỹ thuật tạo dòng gien thiết kế. Trong một vài trường hợp phương pháp PCR không áp dụng được với