ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction) pps

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction) Mycobacterium tuberculosis không thuộc nhóm Gram + hay Gram – vì phương pháp nhuộm Gram không nhuộm được nó mặc dầu vi trùng này cũng có 1 màng bọc peptydoglycan. Ngoài màng này còn có 1 màng sáp làm cho các thuốc nhuộm Gram không thấm vào được. Phương pháp thường dùng để tìm M. tuberculosis là phết đàm bệnh nhân lên kiếng (slide smear) và nhuộm bằng Ziehl-Neelsen Stain (Acid-fast Staining Method). Thuốc nhuộm carbon-fuchsin được đổ lên smear có vi trùng rối nung sôi để chất màu có thể thấm vào vi trùng, sau đó rửa bằng cồn acid (acid-alcohol). Vi trùng lao sẽ hiện ra với màu hồng rất dễ phân biệt với các vi trùng khác. Vi trùng M. tuberculosis rất khó nuôi và sinh trưởng rất chậm. Vì vậy muốn làm thử nghiệm để xem vi trùng nhạy cảm hay kháng thuốc thì cần phải có một thời gian tối thiểu 3-4 tháng mới có kết quả. Dùng phương pháp nuôi vi trùng bằng chất lỏng (liquid media) như BACTEC Systems (Becton Dickinson, Sparks, MD,USA) thì cũng phải 3-4 tuần và cần nhiều dụng cụ đặc biệt đắt giá. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu dùng PCR để định vi trùng lao (identify) và xét định xem vi trùng sẽ kháng loại thuốc nào. Phản ứng PCR sẽ cho kết quả nhanh chóng trong khoảng 3-4 tiếng đồng hồ. Bộ gen (genome) của Mycobacterium tuberculosis gồm 44,411,529 base pairs với 4000 gen trong đó có gen IS6110 được rải rác nhiều nơi trong bộ gen. IS6110 có sequence rất cố định (very conservative). Phương pháp PCR để tìm vi trùng Mycobacterium tuberculosis dựa trên amplification của gen IS6110 .DNA của Mycobacterium tuberculosis được trích tinh (purification) và dùng cho PCR với 2 dây mồi (primers). PCR sẽ amplify một đoạn DNA (fragment) khoảng 120bp chuyên biệt cho gen IS6110. Khi PCR hoàn tất, chất thử nghiệm (sample) sẽ dùng để điện di trên Agarose gel (agarose gel electrophoresis) để xác định kết quả. Sự hiện diện của đoạn DNA chứng minh là có DNA của M. tuberculosis. Nếu không thì kết quả là âm (negative). Để tìm xem M. tuberculosis sẽ đề kháng loại thuốc nào thì chúng ta sẽ dựa vào sequence của các gen ảnh hưởng cho loại thuốc đó để làm PCR. 1/ Đề kháng thuốc INH (isoniazid) Quan sát cho thấy là gen làm nhạy cảm thuốc loại INH là katG Codon 315 (katG315). Nếu có sự biến dạng hay đột biến (mutation) ở base thứ 2 của katG (AGC biến thành ACC hay ACA) thì vi trùng sẽ trở thành kháng thuốc INH. Dùng DNA của M. tuberculosis và 2 giây mồi (primers) có sequence: 5’AGCTCGTATGGCACCGGAACC3’ (20mer primer) và 5’AACGGGTCCGGGATGGTG3’ (18mer primer)(1) để làm phản ứng PCR sẽ cho ra 1 đoạn DNA dài 200bp. Khi cắt đoạn này với restriction enzyme HapII sẽ cho ra 1 đoạn DNA dài 153bp (chứng tỏ là vi trùng nhạy cảm với INH). Nếu vi trùng trở nên đề kháng thì mutation AGCà ACC sẽ làm cho đoạn DNA có thệm 1 gốc hapII mới (new HapII restriction site), như vậy enzyme hapII sẽ cắt đoạn DNA thành 2 khúc nhỏ 132bp và 21bp. Khi điện giải trện agarose gel ta sẽ thấy hiện ra 2 đoạn DNA. Như vậy là vi trùng đã kháng thuốc INH. 2/ Đề kháng thuốc rifampin: Gen cho nhạy cảm rifampin là rpoB. Khác với kháng INH, sự biến dạng (mutation) được thấy ở 3 nơi khác nhau trong gen rpoG (ở codon 516, 526 và 531) khi có đề kháng thuốc Rifampin. Vì vậy trong phản ứng PCR ta cần phải dùng ít nhất là 5 giây mồi (5 primers) mới xác định được các biến dạng của gen rpoG. Trở ngại khi dùng PCR Mặc dầu phản ứng PCR rất nhanh (3-4 giờ) nhưng phản ứng này cần dùng DNA tinh khiết trích từ vi trùng Mycobacterium tuberculosis. Muốn trích tinh chất DNA ta phải nuôi vi trùng M. tuberculosis cho thật nhiều mới đủ số lượng để trích tinh, như vậy cũng phải cần 1 thời gian khá lâu trước khi thực hiện PCR. Sau khi làm phản ứng PCR phải dùng điện di trên Agarose để xem kết quả (3-4 tiếng đồng hồ). Trước đây tôi đã có lần trình bày trên DDDK đề tài “Tạo DNA mà không cần phải nuôi vi trùng”. Ở các phòng thí nghiệm, việc nuôi vi trùng như E. coli rất là thông thường và dễ dàng. Chỉ cần cấy vi trùng trong 1 đêm là có thể có rất nhiều gram vi trùng để ly trích DNA. Trường hợp đặc biệt ở đây là khi gặp phải vi trùng khó nuôi (cần phải nuôi ở nhiệt độ thật cao, nhiệt độ thật thấp, không cần dưỡng khi anaerobic ) hoặc vi trùng sinh trưởng rất chậm như M. tuberculosis phải cần đến 3-4 tháng, hoặc khi ta chỉ có 1 số lượng DNA rất ít (như nước miếng, tóc, 1 giọt máu, 1 tinh trùng ) thì làm sao có thể có số lượng DNA cần thiết để làm PCR. Một diếu tố (enzyme) mà tôi đã đưa ra công thức để trích tinh và có hoạt tính rất mạnh được gọi là Phi29. Diếu tố này có khả năng amplify thật nhiều DNA trong khoảng thời gian ngắn (3-4 giờ) và ở nhiệt độ 30o C (gọi là Rolling Circle Amplification). Với 1 đơn vị vi trùng (1 bacteria colony), Phi29 có thể amplify DNA của vi trùng lên đến vài ug DNA để có thể làm sequencing hoặc PCR. Nếu dùng 1 ug DNA thì trong khoảng 4 tiếng đồng hồ chúng ta có thể có đến 5 mg DNA tinh khiết để dùng cho các thử nghiệm mà khỏi phải mất thời giờ nuôi cấy vi trùng và ly trích DNA. Hiện nay qPCR (quick PCR) còn gọi là RT-PCR (Real Time PCR) được thông dụng hơn PCR vì RT-PCR dùng rất ít DNA mẫu (DNA template) khoảng 1-10 pg cho phản ứng. Kết quả của phản ứng sẽ hiện lên trên màn ảnh (monitor) của máy vi tính và những chi tiết dữ kiện (data) sẽ được giữ lại ở ổ cứng (hard drive) của máy. Như vậy khi dùng RT-PCR chúng ta sẽ có kết quả sau 3-4 giờ phản ứng mà khỏi phải dùng Agarose gel. Ts Lâm-Kim-Cương . ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction) Mycobacterium tuberculosis không thuộc nhóm Gram + hay Gram – vì phương pháp nhuộm Gram không. có vi trùng rối nung sôi để chất màu có thể thấm vào vi trùng, sau đó rửa bằng cồn acid (acid-alcohol). Vi trùng lao sẽ hiện ra với màu hồng rất dễ phân biệt với các vi trùng khác. Vi trùng. tuần và cần nhiều dụng cụ đặc biệt đắt giá. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu dùng PCR để định vi trùng lao (identify) và xét định xem vi trùng sẽ kháng loại thuốc nào. Phản ứng PCR sẽ cho kết