ứng dụng phương pháp pcr phát hiện vi khuẩn aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (pangasianodon hypophthamus) bị bệnh xuất huyết

TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra Pangasianodon hypophthalmus bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LỜI CẢM ƠN

Được làm và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp là mong muốn của các sinh viên Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas

hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A

hydrophila Đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp

sinh hóa truyền thống và kit API 20E Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi

khuẩn A hydrophila phân lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ quan (gan, thận và tỳ tạng) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A

hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit

API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20oC Sau khi phục hồi trên môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng

sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiết tách bằng 2

cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý) Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala

et al (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và ctv (2008)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện diện

của vi khuẩn A hydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp

Điện di sản phẩm PCR của 7 chủng A hydrophila mà không qua bước chiết

tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được

DNA của A hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di Phản ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A

hydrophila là 1ng/µl (hàm lượng DNA) Phương pháp PCR với hàm lượng

thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép

phát hiện A hydrophila hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các chủng (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida,

Eschericchia coli)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam 3

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản 3

2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh 4

2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra 5

2.5 Sơ lược về vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá tra 7

2.6 Phương pháp PCR 9

2.6.1 Khái niệm về PCR 9

2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR 11

2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản 12

2.6.4 Đối chứng 13

2.6.5 Hạn chế của PCR 13

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.1.1 Thời gian 15

3.1.2 Địa điểm 15

3.1.3 Nội dung thực hiện 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 15

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 16

3.3.2 Nguồn vi khuẩn 16

3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn 17

3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 18

3.3.5 Phương pháp PCR 18

3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR 20

3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A hytrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22

4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn 23

4.3 Phát hiện vi khuẩn A hydrophila bằng phương pháp PCR 24

4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila 26

4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila 27

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề xuất 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC 1 34

PHỤ LỤC 2 35

PHỤ LỤC 3 37

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (Panangala et al.,

2007) 16 Bảng 3.2: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 17 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui

trình PCR phát hiện A hydrophila 19

Bảng 4.1: Bảng kết quả thu mẫu cá tra bị bệnh 22

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 10

Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục) 22

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A hydrophila trên môi trường Aeromonas agar + Ampicillin 23

Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A hydrophila trên môi trường NA……… 23

Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila 24

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A hydrophila 25

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A hydrophila 26

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A hydrophila xác định độ nhạy của phương pháp 27

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A hydrophila 28

Chương 1 GIỚI THIỆU

Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,… Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu

về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, khối lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007)

Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, do chi phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến (50-60 con/m2 ao), đã làm nẩy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quản lý tốt môi trường nước ao nuôi Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006) Cá tra là một loài cá kinh tế và khi có dịch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng

ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan, 2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng da (Phạm Thanh

Hương, 2006), nghiên cứu khả năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri và

Aeromonas hydrophila (Ngô Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang

(Phan Khắc Huy, 2008),…

Bệnh xảy ra trên cá tra do nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng,…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột, trắng gan trắng mang, trắng da trắng đuôi,… Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh

đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phổ biến và xuất

hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007)

Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A hydrophila nói

riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương

pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Cũng như Ngô Minh Dung (2007)

gây cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila và E ictaluri trên cá tra, sau đó tái

định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1 tuần để đọc kết quả, hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả Cụ thể Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả định danh vi khuẩn sau khi dùng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit

API 20E để định danh E ictaluri trên cá tra, đã kết luận phương pháp PCR

cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần 1 ngày, Nguyễn Hà

Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt Do đó để chẩn đoán nhanh

và chính xác vi khuẩn A hydrophila trên cá giúp cho người nuôi phát hiện kịp

thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng

phương pháp PCR Nên đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi

khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh xuất huyết” được thực hiện nhằm góp phần vào việc

chuẩn hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A hydrophila gây bệnh ở cá tra

Mục tiêu nghiên cứu

Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A hydrophila phân lập

từ cá tra bị bệnh xuất huyết

Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A hydrophila phân

lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết

- Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

- Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), cho biết

7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái Trong đó, sản phẩm tôm đông lạnh chiếm 32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,9%; còn lại là các loại thủy sản khác Theo Thứ trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm: Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới nhằm đẩy giá nguyên liệu tăng lên Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng cho các doanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008)

Tình hình nuôi thủy sản ở ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn 70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa diện tích nuôi toàn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn) Diện tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tấn; năm 2002

là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng 773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn Quy hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL (Phạm Đình Đôn, 2006) Song song với việc tăng diện tích và năng suất NTTS thì vấn đề dịch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa dạng do nhiều tác nhân

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản

Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước càng bị ô nhiễm do chất thải từ các ao nuôi Cùng với sự ô nhiễm do chất thải

từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn Đối với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào chăn nuôi (thông thường 1,5-2 kg thức ăn/1 kg sản phẩm), ngoài ra còn lượng thức ăn dư thừa lắng xuống tạo ra nguồn chất thải rất dễ phân hủy hữu cơ gây

ô nhiễm môi trường là nguy cơ phát sinh và lây lan dịch bệnh Cùng với tác

động môi trường do chất thải trong sản xuất chế biến công nghiệp, cũng góp phần tác động đến chất lượng môi trường nước ảnh hưởng đến cả kinh tế và môi trường sinh thái (Phạm Đình Đôn, 2006)

Mặt khác do nước ta nằm trong khu vực diễn biến thời tiết ngày càng phức tạp, ảnh hưởng đến môi trường nuôi thủy sản làm cho động vật thủy sản dễ bị sốc Cuối năm 2007, chương trình phát triển của Liên Hiệp Quốc đã xác định: Việt Nam là 1 trong 5 vùng bị tác hại của biến đổi khí hậu nặng nề nhất thế giới ĐBSCL là vùng đất thấp ven biển Đông của Việt Nam nên sẽ là khu vực

bị tác hại nặng nề nhất do biến đổi khí hậu (Lệ Thu, 2008)

Theo các nhà khoa học, 10 năm qua, diện tích NTTS ở ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần, sản lượng tăng vọt lên 3,68 lần nhưng cũng làm cho nguồn nước bị ô nhiễm nặng, đe dọa sự mất cân đối trong chiến lược qui hoạch thủy lợi hiện nay Ước tính mỗi năm, hoạt động NTTS đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 4 triệu tấn bùn ở dạng chất thải hữu cơ gần như chưa được xử lý Mầm bệnh từ các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn chất thải này ra hệ thống sông rạch làm chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề Thực tế cho thấy nuôi cá tra, cá ba

sa trong ao hầm, chỉ có khoảng 17% thức ăn được cá hấp thụ, phần còn lại khoảng 83% hòa lẫn, lắng đọng trong môi trường nước thành chất hữu cơ phân hủy đã làm cho môi trường bị suy thoái (Trần Khánh Linh, 2007)

2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2005)

Thời kỳ ủ bệnh: Đây là thời kỳ từ khi nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào

cơ thể đến lần thứ nhất xuất hiện triệu chứng bệnh, lúc này triệu chứng bệnh bình thường của cá bị thay đổi Trong thời kỳ ủ bệnh sinh vật ký sinh tìm cách tích lũy dinh dương để tăng cường độ sinh sản và hoạt động, ký chủ tạo ra

những yếu tố miễn dịch phòng vệ

Thời kỳ dự phát: Là thời kỳ chuyển tiếp từ lúc xuất hiện bệnh đầu tiên đến

bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá

Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ

ràng, quá trình trao đổi chất, hình thái cấu tạo, các tổ chức cơ quan bên trong

2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra

Theo nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam (2007)

Cá tra cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến Các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng hoặc do các vi sinh vật gây ra

Bệnh do giáp xác ký sinh

Bệnh trùng mỏ neo

Trùng gây bệnh có tên Lernaea, có dạng giống mỏ neo, cơ thể có chiều dài

8-16mm, giống như cái que, đầu có mấu cứng giống mỏ neo cắm sâu vào cơ thể

cá Trùng thường ký sinh ở da, mang, vây và mắt cá

Bệnh rận cá (Argulosis)

Trùng gây bệnh thuộc giống Argulus, có hình dạng giống con rệp nên còn gọi

là rận cá hay bọ cá, bọ ve, nhìn thấy được bằng mắt thường

Bệnh nấm thủy mi ( Saprolegiosis)

Do 2 giống nấm Saprolegnia và Achlya gây ra gồm có Saprolegnia

parasitica, S ferox, Achlya spp Cá bị bệnh có dấu hiệu trên da cá xuất hiện

những vùng trắng xám, giống đám bông mềm Nhiệt độ nước 18-25oC thích hợp cho nấm phát triển

Bệnh Ký Sinh Trùng

Bệnh trùng bánh xe ( Trichodinosis)

Dấu hiệu: thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt Cá thường nổi đầu và tập trung nơi có nước chảy, đôi khi nhô đầu lên mặt nước lắc mạnh đầu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuống đáy

rồi chết

Bệnh trùng quả dưa (Ichthyopthisiosis)

Trùng quả dưa ký sinh trên da, mang và vây Trùng bám thành các h ạt lấm tấm

rất nhỏ, có thể thấy được bằng mắt thường Biểu hiện là da và mang cá có

nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt Cá nổi đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ

do trùng bám nhiều ở mang, phá hoại biểu mô mang làm cá ngạt thở Ngoài ra

nghành trùng bào tử sợi Myxosporidia, sán 16 móc Dactylogyrus, sán 18 móc

Gyrodactylus,… cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho cá tra Trần Văn Tếch

(2008) đã phân tích mẫu cá tra bị bệnh vàng da phát hiện có (Dactylogyrus,

Trichodina, Myxobolus, Bucephalopsis,…) nhưng chưa xác định ký sinh trùng

là tác nhân gây bệnh vàng da trên cá tra

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromonas gồm có A

hyrophila, A caviae và A sobria Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều chất

hữu cơ Cá con dễ mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thể gây chết đến 80%

Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)

Tác nhân gây bệnh do Pseudomonas fluorescens, P anguilliseptica, P

Chlororaphis Cá bị bệnh này có dấu hiệu xuất huyết từng đốm nhỏ trên da,

xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn

Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella

Bệnh do vi khuẩn E tarda gây ra Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da

(phía mặt lưng) Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và da bị mất sắc tố Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị rách, gẫy Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng

cơ xung quanh Ngoài ra, Trần Thị Ngọc Hân (2006) thí nghiệm gây cảm

nhiễm trên cá tra bằng 2 phương pháp ngâm và tiêm E.ictaluri kết quả đến

ngày thứ 10 bên ngoài cá có hiện tượng xuất huyết vây đuôi, trên thận có đốm trắng

Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản

mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn gram âm, tác nhân vi khuẩn được coi là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy

sản (Inglish et al., 1993) Mặc khác theo Buler (2004) vi khuẩn không chỉ tồn

tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo

chất lượng nước (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008) Vi khuẩn A

hydrophila là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và thường

gặp trên cá tra hiện nay

2.5 Sơ lược về vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá tra

Tác nhân gây bệnh

Theo Bùi Quang Tề (2005) giống vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành

Proteobacteria Trong giống Aeromonas có 2 nhóm, (1) loài vi khuẩn không

di động (A salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi khuẩn di động bao gồm (A hydrophila, A caviae, A sobria), đặc tính chung

của 3 loài vi khuẩn này là di động nhờ có 1 tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, phản ứng oxidase dương tính, khử nitrat, không mẫn

cảm với thuốc thử O/129 Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A hydrophila (trích

dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008)

Theo Bergey (1957), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao gồm 3 loài A hydrophila, A caviae, A sobria Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi,… là bệnh do vi khuẩn A

hydrophila Vi khuẩn A hydrophila phát triển trên môi trường thạch có khuẩn

lạc tròn, màu vàng rất nhạt, rìa đều hơi lồi, ướt, nhẵn bóng Vi khuẩn di động (có 1 tiêm mao), gram âm, oxidase dương tính, kháng với O/129, hiếu khí và hiếm khí không bắt buộc, có khả năng lên men, hình que ngắn dài 2-3 µm, hai đầu hơi tròn Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28-30o

C, sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2008)

Theo Lewis & Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống

Aeromonas thì A hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt

quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi

và cá tự nhiên, theo Angka (1990) A hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá

tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Bên cạnh đó trong báo cáo của Saitanu et al., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A

hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không

có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên (thân, các gốc vây, quanh miệng), hậu môn xuất huyết, mắt lồi đục Ở cá tra và cá basa xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng

to, thận sưng, ruột dạ dày bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều

dịch nhờn có mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu (Bùi Quang Tề, 2006)

Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện từng mảng đỏ trên cơ thể, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng, mắt lồi mờ đục, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử

Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều

loài cá khác Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A hydrophila và

Pseudomonas fluorescens Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ trên mặt nước, trên

thân xuất hiện điểm xuất huyết nhỏ li ti, nếu bệnh nặng thì các gốc vây cũng xuất huyết Bụng cá trương to, thành ruột xuất huyết, cá ít ăn hoặc bỏ ăn Các tia vây lưng, hậu môn và vây đuôi bị rách xơ xác (Bộ thủy sản, 2008)

A hydrophila, A caviae và A sobria cả 3 loài phân lập được trên cá khi có

dấu hiệu bệnh nhiễm khuẩn huyết, mặt dù A hydrophila là loài thường gặp

nhất Thỉnh thoảng cũng phân lập được vi khuẩn gram âm khác như

Pseudomonas fluorescens (theo Roberts & Horne 1978, Schaperclaus 1926)

hoặc Proteus rettgeri trên cá bị nhiễm khuẩn huyết (theo Bejerano et al

1976), có thể phân lập được đĩa cấy thuần của một chủng, hoặc kết hợp nhiều

chủng thì gây ảnh hưởng cao hơn (trích dẫn bởi Inglis et al, 1993)

Phân bố và lan truyền bệnh

Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) bệnh nhiễm trùng do A hydrophila thường gặp ở

nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Úc,…Ở Việt Nam, các loài cá nuôi lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, tra, basa, trôi, chép, mè, trê,… Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70% Bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt và cá bố mẹ Ở Việt

Nam bệnh do A hydrophila có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập

trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuất hiện nhiều vào đầu mùa mưa, mùa có nhiệt độ 25-28oC

Ở Châu Âu, bệnh do A hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa

xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22oC, đây là khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn

này phát triển (Esteve et al., 1993 trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Chẩn đoán bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2008), chẩn đoán bệnh do Aeromonas là dựa vào các dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ xuất hiện bệnh, kết quả phân lập bằng phương pháp truyền thống Để phát hiện bệnh nhanh và ở giai đoạn sớm của bệnh cần áp

dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), hoặc ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Một số nghiên cứu về A hydrophila

Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận

tỷ lệ chết thường cao ở 20,5oC và 17oC, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, còn ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and Stevenson, 1988; trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A

hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật

độ vi khuẩn 3x104

-3x108 CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x104-8,5x108 CFU/ml), tiêm ở cơ (8x104-8x108 CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x104-4,6x108CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới

da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/ml (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng

đến 107

CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lược là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106đến 4,52x106

CFU/ml và 1,96x106 đến 1,45x107 CFU/ml

2.6 Phương pháp PCR 2.6.1 Khái niệm về PCR

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) do

Karl Mullis et al phát minh năm 1985 Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA invitro không cần có sự hiện diện của tế bào (trích dẫn bởi Đặng

Thị Hoàng Oanh, 2007) Nguyên tắc của phản ứng PCR (xem hình 2.1)

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2003)

PCR là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm từ một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA, các nucleotide tự do và dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chống, thậm chí với một tiểu phần virus Hiện nay PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ( 2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn là:

Giai đoạn 1 (biến tính – denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) cuả phân tử, thường là 94-

95oC trong 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn

Giai đoạn 2 (lai –hybridization): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn

Tm của các mồi cho phép mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC Tùy thuộc vào Tm của các đoạn mồi sử

dụng mà thời gian bắc cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase hoạt động Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân lên trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau (n) chu kỳ nhân bản sẽ tạo

ra 2 n bản DNA từ một khuôn ban đầu

PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản PCR cũng được dùng để phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh

vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng

ở trên tôm hiện nay được chẩn đoán bằng PCR như virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hội chứng Taura (TSV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Không chỉ đối với vi khuẩn mà cả virus, multiplex PCR (mPCR) đã có những bước phát triển mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả

chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm thời gian và công sức Yang et al

(2006) đã phát triển phương pháp m PCR phát hiện đồng thời hai loại virus IHHNV và WSSV trên tôm he

2.6.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR

DNA khuôn: Khuất Hữu Thanh (2003) khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn

Enzyme: DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau

Mồi và nhiệt độ gắn mồi: Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5oC và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72oC Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị

Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005) Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn PCR không thành công Tỷ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững Tuy nhiên trình tự G-C không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn 1 kb Sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi

đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do Do đó đầu 5’ của mồi có thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Thể tích mồi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM Thể tích mồi thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006)

Nồng độ các loại nucleotide tự do: Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20-200 µM/ mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp

sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Nồng độ Mg2+: Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) ion Mg2+ là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg2+ tối ưu để thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 µM Nước sử dụng cho phản ứng phải tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không chứa các enzyme cắt hạn chế

và các enzyme phân hủy acid nucleic Môi trường dung dịch đệm phải ổn định Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 29-50 µl

Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) số lượng chu kỳ PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, (3) các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau,…

2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản

Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì ứng dụng của PCR là: Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn, giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản

có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi như: (1) Giúp chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết (2) Phòng bệnh: kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống (3) Kiểm soát bệnh: theo dõi kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu

Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu - Sự nhiễm khuẩn

hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây bệnh, hay có thể là các loài đông vật thủy sản

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR

là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR bao gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV)

2.6.4 Đối chứng

Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau

- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm

- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ

2.6.5 Hạn chế của PCR

- Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn DNA có chiều dài lớn hơn 3kb ( kết quả tốt với những đoạn DNA có chiều dài nhỏ hơn 1,5 kb)

- Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước, dễ bị tạp nhiễm do tính nhạy cảm và lỗi thao tác

- Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzyme gắn sai một nucleotic)

- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết gây

ra Bên cạnh đó việc phát hiện mầm bệnh riêng lẽ bằng PCR thường gây tốn kém, do đó các nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chi phí bằng cách

sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR để phát hiện

cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Trần Linh Phước, 2003; trích dẫn bởi Phạm Thị Thu Trang, 2005)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2008 – 05/2009

3.1.2 Địa điểm

- Thu mẫu: Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp

- Nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần thơ

3.1.3 Nội dung thực hiện

- Thu mẫu cá tra bệnh

- Phân lập vi khuẩn ở các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) của cá tra bị bệnh xuất huyết

- Phục hồi vi khuẩn đã được định danh và trữ trong glycerol 50% Cấy vi khuẩn trực tiếp lên môi trường thạch đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin

- Tách vi khuẩn sang môi trường NA, nuôi tăng sinh vi khuẩn trong NB

- Dùng phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

- Xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của phương pháp PCR

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ

- Máy chu kỳ nhiệt, máy so màu quang phổ, máy ủ, máy li tâm, máy vortex, máy lắc, máy PCR, lò viba, bộ điện di, bàn đọc UV, bộ chụp ảnh gel, máy vi tính

- Cân điện tử, pipet tự động, tủ lạnh, tủ đông, tủ sấy, nồi autoclave

- Ống eppendorf 1,5 ml và 0,5 ml

- Đầu col pipet các loại

- Ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh, ống đong, chai nấu môi trường

- Đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, hộp quẹt

- Hộp đá lạnh, giấy vệ sinh, găng tay, bọc nylon và viết lông dầu