Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc (channa striata) bị bệnh xuất huyết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN TÍN TRỌNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC Channa striata BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TÍN TRỌNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC (Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TÍN TRỌNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN

Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC (Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts PHẠM MINH ĐỨC

LỜI CẢM TẠ

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với những người thân trong gia ñình,

Ba Mẹ ñã tạo mọi ñiều kiện ñể cho tôi học tập và thực hiện ñề tài tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với cán bộ hướng dẫn: Ts Phạm Minh Đức

ñã tận tâm chỉ dẫn, ñộng viên và cho tôi những khuyên quý báu trong quá trình tiến hành thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ ñã truyền ñạt kiến thức và quan tâm giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Đồng thời xin gởi lời cám ơn ñến các anh chị trong bộ môn, các bạn lớp bệnh học thủy sản khóa 33, ñặc biệt cám ơn bạn Phan Vĩnh Thịnh, bạn Đoàn Nhật Tân lớp bệnh học thủy sản khóa 33 ñã nhiệt tình, quan tâm, giúp ñỡ trong suốt thời gian thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tín Trọng

TÓT TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas

hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược

thực hiện nhằm xác ñịnh LD50 của Aeromonas hydrophyla gây bệnh trên cá lóc, làm tiền ñề cho những nghiên cứu sau này Chủng vi khuẩn Aeromonas

hydrophyla CĐ1012 dùng trong thí nghiệm ñược thu tại những ao cá bệnh có

biểu hiện bệnh xuất huyết như tách ñàn, bỏ ăn và bơi lội lờ ñờ trên mặt nước, mắt lồi và ñục, xuất huyết trên thân, ở các vi và xương nắp mang, cá bơi dạng xoắn, vẩy dễ bị rụng khi lấy ra, ở các vèo nuôi trong ao ñất ở huyện Cờ Đỏ, thành phố Cần Thơ Sau ñó, mẫu ñược phân lập, tách ròng và phân tích tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ Chủng vi khuẩn CĐ1012 thu ñược trong 3 lần thu mẫu, ñược ñịnh danh bằng phương pháp PCR và xác ñịnh là chủng

Aeromonas hydrophyla Sau ñó, thí nghiệm cảm nhiễm ñược thực hiện bằng

phương pháp tiêm chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla CĐ1012 lên cá lóc

giống cỡ 20-25 g/con với mật ñộ vi khuẩn 3,67x104, 3,67x105, 3,67x106, 3,67x107 CFU/ml Sau 14 ngày tiêm, kết quả cho thấy tỉ lệ cá chết 100% ở mật

ñộ 3,67x107 CFU/ml và thấp nhất 30% ở mật ñộ 3,67x104 CFU/ml Từ ñó xác ñịnh ñược giá trị LD50 là 1,16x106 CFU/ml Đa số những cá chết ñều có dấu hiệu bệnh lý giống nhau, giống với dấu hiệu cá bệnh ñược thu mẫu tại ao nuôi Hai chủng vi khuẩn CT1107 và CT1109 thu ñược sau khi gây cảm nhiễm và

tái ñịnh danh bằng phương pháp PCR chính là Aeromonas hydrophila

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ i

TÓT TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu ñề tài 2

1.3 Nội dung ñề tài 2

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cá lóc 3

2.2 Tình hình nuôi và một số bệnh thường gặp trên cá lóc ở ĐBSCL 4

2.3 Sơ lược kết quả nghiên cứu bệnh cá do vi khuẩn Aeromonas 5

2.4 Một số nghiên cứu ñộc lực về vi khuẩn Aeromonas hydrophila 8

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 9

3.2 Vật liệu nghiên cứu 9

3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị 9

3.2.2 Hóa chất và môi trường 9

3.3 Phương pháp nghiên cứu 9

3.3.1 Thu mẫu cá bệnh 9

3.3.2 Phân lập vi khuẩn 10

3.3.3 Định danh vi khuẩn 10

3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 10

3.4.1 Cá thí nghiệm 10

3.4.2 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 10

3.4.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 11

3.4.4 Quan sát và thu thập số liệu 12

3.5 Xử lý số liệu 13

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Dấu hiệu bệnh lý 14

4.2 Phân lập và ñịnh danh vi khuẩn 14

4.3 Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm 16

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 22

5.1 Kết luận 22

5.2 Đề xuất 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

PHỤ LỤC 27

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu cơ bản của vi khuẩn 15 Bảng 4.2: Thời gian cá bắt ñầu chết 18 Bảng 4.3: Các chủng vi khuẩn tái phân lập ñược trên cá gây cảm nhiễm 19 Bảng 4.4: Kết quả các chỉ tiêu cơ bản của 12 chủng vi khuẩn tái phân lập trên

cá gây cảm nhiễm 20

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen và cá chành dục 3

Hình 3.1: Hệ thống xô thí nghiệm gây cảm nhiễm 12

Hình 4.1: Cá lóc bệnh nuôi trong vèo ở Cờ Đỏ 14

Hình 4.2: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 phân lập trên cá lóc nuôi vèo trong ao ñất 15

Hình 4.3: Kết quả ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 15

Hình 4.4: Cá bị xuất huyết sau khi gây cảm nhiễm 16

Hình 4.5: Biểu ñồ tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm 17

Hình 4.6: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CT1107 phân lập trên cá gây cảm nhiễm 19

Hình 4.7: Kết quả tái ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 20

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và ñem lại hiệu quả kinh tế ñáng kể cho ñất nước Trong ñó nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng trong cả nước Theo báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sản lượng thủy sản năm 2010 ñạt 2.450,8 nghìn tấn, bằng 107,6% so với cùng kỳ năm 2009 Tính ñến quý ñầu tiên của năm nay sản lượng thủy sản với kim ngạch trên 1,1 tỉ USD, tăng 22% so với cùng kỳ Chỉ riêng trong tháng 3/2011, xuất khẩu thủy sản ước ñạt 400 triệu USD, sản lượng khai thác cũng ñạt trên 600.000 tấn, tăng 2% so với cùng kỳ (www.laodong.com.vn)

Bên cạnh, cá tra là ñối tượng có giá trị kinh tế cao thì cá lóc là ñối tượng tương ñối dễ nuôi, chất lượng thịt ngon, ñược nuôi với nhiều mô hình khác nhau (như nuôi trong ao ñất, ao nổi, mùng vèo và lồng bè) và có thể nuôi quy mô nhỏ ñể xóa ñói giảm nghèo hoặc nuôi thâm canh với mật ñộ cao (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2009) Theo kết quả ñiều tra của Dương Nhựt Long

và ctv (2003) cho biết sản lượng cá lóc nuôi trong năm 2002 toàn vùng

ĐBSCL ñạt 5.294 tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở các tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Kiên Giang Đến năm 2009 thì sản lượng cá lóc ñạt hơn 40.000 tấn, tăng gần 8 lần so với năm 2002 (Báo cáo của các tỉnh ở ĐBSCL, 2010) Sự tăng nhanh về sản lượng và ñạt ñược lợi nhuận cao nên người dân ñã mở rộng diện tích nuôi với mật ñộ cao hơn Điều ñáng quan tâm

là kinh nghiệm của người dân còn hạn chế, mà cụ thể là việc quản lý nguồn nước Người dân thường thải trực tiếp lượng nước từ ao nuôi ra sông mà không qua xử lý Chính nguyên nhân này ñã làm nguồn nước ngày càng ô nhiễm, tạo ñiều kiện thuận lợi cho các tác nhân gây bệnh phát triển

Trong thời gian gần ñây các loài thủy sản nuôi ở khu vực ĐBSCL nhiễm bệnh hầu như quanh năm như bệnh gan thận mủ, xuất huyết, bệnh ñẹn miệng, bệnh trắng da,… Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện trên ñộng vật thủy sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9% Theo ñiều tra của Nguyễn Thanh Phương và

ctv (2007) thì số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào

mùa lũ chiếm tới 88% Xuất phát từ nhu cầu phòng và trị bệnh của người nuôi,

ñề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas

hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược

1.2 Mục tiêu ñề tài

Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012

trên cá lóc bằng phương pháp gây cảm nhiễm nhằm góp phần cung cấp tài liệu cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh do vi khuẩn này gây ra trên cá

1.3 Nội dung ñề tài

- Phân lập và ñịnh danh vi khuẩn trên cá lóc bị xuất huyết

- Xác ñịnh LD50 của vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 trên cá lóc

trong ñiều kiện gây cảm nhiễm

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cá lóc

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), ở Đồng Bằng Sông

Cửu Long có 4 loài cá lóc: cá lóc ñen (Channa striata), cá lóc bông (Channa

micropletes), cá dầy (Channa lucius) và cá chành dục (Channa gachua)

Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen và cá chành dục

(Nguồn: Dương Nhựt Long, 2003)

Cá lóc phân bố rộng từ Trung Quốc ñến Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan, Mianma, Ấn Độ và Philippines Cá sống trong môi trường nước ngọt ở nhiều loại thủy vực khác nhau kể cả những vùng trũng ngập nước lâu ngày Chúng thích nghi nơi nước tĩnh có mực nước từ 0,5-1 m Đặc biệt, cá thích sống ven bờ nơi có nhiều cây cỏ thủy sinh ñể rình và bắt mồi Ngoài ra, cá có thể sống ở nơi có hàm lượng oxy thấp nhờ có cơ quan hô hấp phụ, pH thích hợp cho hoạt ñộng sống của cá lóc là từ 6,5-7,5 Cá có thể sống ở vùng nước

lợ (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993)

Ở Việt Nam, nghề nuôi cá lóc hình thành từ năm 1950 chủ yếu tại tỉnh An Giang và Đồng Tháp Trên thế giới nghề nuôi cá lóc ñã phát triển mạnh với nhiều mô hình nuôi khác nhau Phổ biển ở Thái Lan và Hồng Kông là mô hình nuôi bán thâm canh trong ao ñất với thời gian nuôi từ 6-7 tháng với các loại thức ăn như bột cá, tấm và cám Mô hình nuôi bè với mật ñộ 30-50 con/m3, sử dụng các loại thức ăn như cá tạp và tấm Sau 8 tháng nuôi cá ñạt khoảng 1,5-2,5 kg/con phổ biến ở Campuchia và Việt Nam Ở Đài Loan, cá lóc ñược nuôi chung với cá rô phi, cá chép,… (Dương Nhựt Long, 2003)

2.2 Tình hình nuôi và một số bệnh thường gặp trên cá lóc ở ĐBSCL

Hiện nay, ở ĐBSCL có 5 loại hình nuôi cá lóc phổ biến: Ao ñất, vèo ao, vèo

sông, lồng bè và bể bạt (Lê Xuân Sinh và ctv., 2009) Dương Nhựt Long và ctv

(2003) ước tính sản lượng nuôi cá lóc năm 2002 toàn vùng ĐBSCL ñạt 5.294 tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở các tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Kiên Giang Nhưng ñến năm 2009, sản lượng nuôi cá lóc ở các tỉnh trọng ñiểm thuộc vùng ĐBSCL tăng lên rất nhanh cụ thể như sau: An Giang ñạt 15.241 tấn cá lóc với 75,4 ha nuôi cá lóc ao hầm, 6,9 ha nuôi vèo và các

mô hình nuôi khác với 476 lồng bè (Sở NN và PTNT, Cục Thống kê tỉnh An Giang báo cáo kết quả về ñiều tra thủy sản thời ñiểm 01-10 hàng năm về diện tích và sản lượng cá lóc, 2009) Báo cáo kết quả ñiều tra thống kê kinh tế kỹ thuật thủy sản tỉnh Đồng Tháp, Quý 3 năm 2009 Hiện nay, trên ñịa bàn tỉnh Đồng Tháp tổng số hộ nuôi cá lóc là 3.299 hộ nuôi cá lóc (tăng 1.324 hộ so với cùng kỳ năm 2008) Trong ñó có huyện Cao Lãnh là ñịa phương có số hộ nuôi cá lóc nhiều nhất tỉnh với 672 hộ, tiếp theo là các huyện: Tân Hồng 587

hộ, Thanh Bình 461 hộ, thấp nhất là Sa Đéc chỉ có 36 hộ nuôi Hình thức nuôi

cá lóc chủ yếu là nuôi: ao, bè, mùng, vèo… trong ñó, nuôi lồng, mùng, vèo với quy mô nhỏ là ña số với 2.921 hộ nuôi chiếm ñến 88% số hộ nuôi cá lóc trong toàn tỉnh, trong khi ñó nuôi cá lóc trong ao có 396 hộ nuôi chiếm 22% với tổng diện tích la 28,15 ha Hình thức nuôi lồng bè nhiều nhất vẫn là huyện Cao Lãnh với 605 hộ nuôi, 594 lồng, vèo các loại Tổng sản lượng cá lóc toàn tỉnh

dự kiến là 6.558,6 tấn, năng suất ao bình quân là 9,8 kg/m2 và nuôi lồng, mùng

có năng suất bình quân là 23,8 kg/m3 Cần Thơ ñạt 6.600 tấn với diện tích nuôi

là 160 ha trong ñó có khoảng 2700 cái vèo ao và 207 lồng bè (Nguyễn Thị Diệp Thúy, 2010) và Hậu Giang với tổng sản lượng cá lóc toàn tỉnh là 308,4 tấn trong ñó có 634 hộ nuôi cá lóc, với 27 ha diện tích nuôi ao hầm và 12.680

m3 thể tích nuôi lồng vèo (Chi cục Thủy sản tỉnh Hậu Giang, 2009)

Sản lượng cá lóc nuôi ñang ñược phát triển rất nhanh chóng ở ĐBSCL, diện tích và sản lượng cá nuôi ñã không ngừng gia tăng Việc gia tăng sản lượng là vấn ñề không khó, ñiều ñáng lo ngại là kinh nghiệm của người nuôi còn thấp,

sự ñầu tư lớn về giống, thức ăn và ñòi hỏi năng suất cao luôn là ñiều kiện tiềm

ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh, gây nên tác hại rất lớn Bệnh xuất huyết do vi

khuẩn Aeromonas hydrophila và Pseudomonas sp gây ra là loại bệnh phổ

biến Cá bị bệnh thường bơi lờ ñờ trên mặt nước Trên thân xuất hiện những ñiểm xuất huyết nhỏ li ti, bệnh nặng các gốc vây xuất huyết, hoại tử ñuôi, xuất hiện những vết thương trên lưng Cá ăn ít hoặc bỏ ăn, mắt lồi, mờ ñục, xoang bụng chứa dịch (Từ Thanh Dung, 2005) Bệnh nấm thủy mi do các loài của 2

giống nấm Saprolegnia và Achlya gây ra Đây là loại nấm gây hại cho cá ở tất

cả các giai ñoạn từ trứng ñến cá thịt Khi mắc bệnh này, cá bơi lờ ñờ xung quanh ao và bị bệnh nặng sau một thời gian sẽ chết Nấm thủy mi bám trên mình cá như những túm bông màu trắng (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám,

2000) Bệnh sán lá ñơn chủ gây bệnh cá gồm 2 giống Dactylogyrus (sán 16 móc) và Gyrodactylus (sán 18 móc) Sán ký sinh ở da mang của cá, phá hoại

tế bào tổ chức mang và da làm cho mang và da tiết ra nhiều dịch nhờn Khi mắc bệnh này cá bơi lội chậm chạp và ñôi khi trên da cá bị phủ bởi một lớp trông giống như lông tơ có thể quan sát thấy những ñiểm xuất huyết nhỏ trên thân cá Cá gầy yếu ít hoạt ñộng và thường nằm dưới ñáy, thỉnh thoảng nổi lên mặt nước và bơi ngửa bụng (Nguyễn Thị Thu Hằng và Phạm Minh Đức,

2009) Theo kết quả khảo sát của Phạm Đăng Phương (2010) cho thấy có 7

loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi cá lóc: bệnh xuất huyết (50,7%), bệnh

ký sinh trùng (49,6%), bệnh ghẻ lở (hay còn gọi là bệnh lở loét) (19,5%), bệnh gan thận mủ (13,3%), bệnh ñẹn họng (ñỏ xoang miệng) (15%), bệnh chướng hơi sình bụng (8,8%) và bệnh nấm trên thân cá (3,5%)

2.3 Sơ lược kết quả nghiên cứu bệnh cá do vi khuẩn Aeromonas

Dấu hiệu bệnh lý

Đặc ñiểm do Aeromonas gây ra làm cho ñộng vật mắc bệnh xuất huyết, hình

thành các vết ñỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô Tùy vào ñối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai ñoạn bệnh mà có

những biểu hiện bệnh lý khác nhau (Inglis et al., 1993) Một số nghiên cứu

khác cho thấy da cá bắt ñầu bị sậm lại và lan dần ra phần bụng ñến các vùng khác trên cơ thể Vây và ñuôi bị xuất huyết, lở loét và hoại tử Những vùng lở loét thường không sâu Ngoài ra cá lóc bị tróc vẩy, mắt bị ñục và lồi ra Nội tạng bị sưng và xuất huyết Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường tập trung vào mùa Xuân và mùa Thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh thường xuất hiện nhiều vào ñầu mùa mưa Tỷ lệ chết sẽ rất cao trong trường hợp cá bị sốc và thiếu dinh dưỡng, thiếu oxy, ñặc biệt ở giai ñoạn cá còn nhỏ tỉ lệ chết lên ñến 70% (Từ Thanh Dung, 2005) Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Bùi

Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A hydrophila có biểu tượng chung là da thường

ñổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các ñốm xuất huyết ñỏ trên thân, các gốc vây, xuất huyết hậu môn, mắt lồi ñục Ở cá tra và

cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi ñều bị xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối Cá trê giống bị bệnh thường tách ñàn treo râu Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra

sau khi gây cảm nhiễm với A hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận,

hậu môn sưng ñỏ, các tia vây xuất huyết,… nhưng không chết hàng loạt trong thời gian 7 ngày thí nghiệm Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một loài duy

nhất là A hydrophila Theo Phạm Thanh Liêm và ctv (2008) khi nghiên cứu

về khả năng kháng bệnh của cá trê lai Khi cá chết có dấu hiệu ñặc trưng như: xuất huyết vì mạch máu bị tổn thưởng mang, ruột nhất là phần ruột sau Xuất huyết ở vùng tiêm vi khuẩn, các vết lở loét trên da và râu cũng quan sát ñược Ngoài ra, trong nghiên cứu này còn có kết luân rằng tất cả các nhóm cá trê lai

ñều có sức chống chịu lại A hydrophila cao hơn hẳn so với loài cá bản ñịa và

cá trê vàng

Một số loài vi khuẩn Aeromonas gây bệnh phổ biến

Barrow và Feltham (1993) cho rằng A hydrophila thuộc giống Aeromonas, họ

Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành

Proteobacteria Nhóm vi khuẩn di ñộng gồm có 3 loài A hydrophila, A caviae

và A sobria Đặc tính chung của 3 loài vi khuẩn này là di ñộng nhờ có một

tiên mao, hai ñầu hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,5x1,0-1,5

µm, hiếu khí không bắt buộc, phát triển ñược ở 37°C Theo kết quả nghiên cứu

của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì vi khuẩn Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên nhiều loài cá, trong ñó A hydrophila phổ biến gây bệnh cho cá nước ngọt Theo Từ Thanh Dung (2005) cho rằng vi khuẩn Aeromonas thuộc

họ Aeromonadaceae, bao gồm 3 loài A hydrophila, A caviae và A sobria

Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di ñộng, hình que, hiếu khí và yếm khí

không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính, kháng

với O/129 Trong ñó A hydrophila ñược xem là loài gây bệnh cho cá nước

ngọt phổ biến, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu trên các loài cá nuôi

và cá tự nhiên Vi khuẩn này có mặt trong nước có nhiều chất hữu cơ Cá con

dễ bị mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thể gây chết ñến 80% Theo Nguyễn

Thị Thu Hằng (2005) Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường

Tryptone soya agar (TSA) thì khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt Cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên men các môi trường ñường nhưng không có khả năng tạo khí H2S, cho phản ứng dương tính với MR - VP, lysine, arginine và ornithine Đặc biệt chúng có khả năng phát triển ñược ở nồng ñộ muối 6%, nên ñã thể hiện ñược ñặc tính phân bố rộng muối Bergey (1957) cho rằng bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh

ñốm ñỏ, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi,… là bệnh do vi khuẩn A hydrophila

gây ra (Trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005)

Phân bố và lan truyền bệnh

Kết quả nghiên cứu của Austin và Austin (1986), cho rằng A hydrophila là tác

nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh ñốm ñỏ và

thường liên kết với mầm bệnh khác như A salmonisida Bệnh ñốm ñỏ là biểu

hiện sự có mặt của những vết thương trên da, ñặc biệt xuất huyết ở mang và hậu môn, loét, ung mủ, lồi mắt, phình bụng Bên trong xoang bụng tích tụ dịch loãng, gây thiếu máu và tổn thương các cơ quan như gan, thận Ventura và

Grizzle (1987) cho rằng vi khuẩn A hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu trên cá nheo (Ictalurus punctatus) và A hydrophila làm cho cơ quan nội tạng

và da bị xuất huyết trong ñiều kiện nuôi ở mật ñộ cao và nhiệt ñộ là 24°C Cá

không bị nhiễm khi nuôi ở mật ñộ thấp hơn và nhiệt ñộ là 18°C A hydrophila

cũng gây bệnh lở loét cho các tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết cao lên ñến

80-90% (Angka, 1990) Ở Châu Âu, bệnh do A hydrophila trên cá chình (Anguilla australis) thường xuất hiện vào mùa xuân-hè, nhiệt ñộ nước khoảng

17-22°C, khoảng nhiệt ñộ này cũng ñược cho là khoảng nhiệt ñộ thích hợp cho

vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993) Một số loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp là A hydrophila, A sobria và A caviae, ñược phát hiện ñầu tiên

trên cá chình trong báo cáo bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) (Trích dẫn

của Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997) Ngoài ra, A hydrophila còn là tác nhân thứ

cấp gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng và gây chết cao vào mùa nước ñổ ở

ĐBSCL (Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997) Bên cạnh ñó thì Aeromonas sp còn

ñược phân lập cả trên tôm càng xanh với những biểu hiện cụt râu và mòn phụ

bộ (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005) Vi khuẩn Aeromonas sp di ñộng gây bệnh

trên nhiều loài thủy sản nước ngọt Ở Việt Nam, các loài cá nuôi lồng, bè và

ao nước ngọt thường gặp bệnh ñốm ñỏ như cá lóc, cá trắm cỏ, cá trôi, cá chép,

cá basa,… bệnh ñỏ chân ở ếch, ñốm nâu ở tôm càng xanh (Bùi Quang Tề, 2006) Theo kết quả nghiên cứu của Lư Trí Tài (2010) cho thấy vi khuẩn

Aeromonas phân lập trên cá lóc nuôi ao ở An Giang và Đồng Tháp bị bệnh

xuất huyết chiếm tỉ lệ cao nhất (38,3%) trong tổng số 81 chủng vi khuẩn phân

lập ñược, còn lại là nhóm vi khuẩn khác như Pseudomonas, Edwardsiella,

Streptococcus Một nghiên cứu khác về bệnh trên tôm càng của Nguyễn Tấn

Đạt (2002) ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ cũng cho kết quả phân lập ñược 50 dòng vi khuẩn từ tôm bị cụt râu và mòn phụ bộ Trong ñó,

có 18 chủng ñược ñịnh danh là vi khuẩn A hydrophila Ngoài ra, trong nghiên

cứu này cũng chứng minh rằng có sự hiện diện của loài vi khuẩn này trong môi trường nước và gây hiện tượng cụt râu, mòn phụ bộ ở giai ñoạn hậu ấu trùng khi gây cảm nhiễm chủng 1.081514 ở mật ñộ 2,1x104 CFU/ml và khả năng gây bệnh tăng lên khi mật ñộ tăng ñến 2,1x107 CFU/ml

2.4 Một số nghiên cứu ñộc lực về vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Groberg (1978) cho rằng khi gây nhiễm A hydrophila trên cá hồi giống ñã kết

luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5°C và 17°C, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15°C và 12°C, còn ở 9°C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết

(Trích dẫn bởi Roselynn và Stevenson, 1988) Rahman et al (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4

cách khác nhau: tiêm vào xoang bụng (mật ñộ vi khuẩn 3x104-3x108 CFU/ml), tiêm ở cơ (mật ñộ vi khuẩn 8x104-8x108 CFU/ml), tiêm dưới da cơ (mật ñộ vi khuẩn 8,5x104-8,5x108 CFU/ml) và ngâm vi khuẩn (mật ñộ vi khuẩn 4,6x 104-4,6x108 CFU/ml) và ñã ñưa kết luận gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da thì ñộc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/ml

Bên cạnh ñó, Azad et al (2001) gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá rô phi (Oreochromis niloticus), ở mật ñộ vi khuẩn 107 CFU/ml ñã gây chết 80%

Majumdar et al (2007) cũng tiến hành gây cảm nhiễm trên cá trê có khối

lượng từ 100-120 g, kết quả xác ñịnh ñược LD50 = 3,96x107 CFU/ml Gần ñây

Citarasu et al (2011) ñã tiến hành gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius

auratus) có trọng lượng 5±1 g bằng cách tiêm và theo dõi trong vòng 7 ngày

ñã xác ñịnh ñược LD50 = 107 CFU/ml Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) thí

nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A hydrophila trên cá chép (Cyprinus carpio)

bằng phương pháp tiêm với mật ñộ vi khuẩn từ 103 CFU/ml ñến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn ñộc lực mạnh có giá trị LD50 lần lượt là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106 CFU/ml ñến 4,52x106 CFU/ml và 1,96x106 CFU/ml ñến 1,45x107 CFU/ml

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng 11/2010 ñến tháng 05/2011

Địa ñiểm: Mẫu cá bệnh ñược thu ở ao nuôi tại Tam Nông, Đồng Tháp và nuôi

vèo tại Cờ Đỏ, Cần Thơ Phân lập vi khuẩn và thí nghiệm gây cảm nhiễm tại

Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản-Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị

Dụng cụ cơ bản trong phân lập vi khuẩn: Bộ tiểu phẫu, tâm bông tiệt trùng, lame, lamelle, ñèn cồn, cốc ñốt, găng tay, giấy nhôm, tủ sấy, nồi tiệt trùng áp suất, que cấy, ống nghiệm, pipet, ñĩa petri, cân ñiện tử, bút lông dầu, sổ ghi chép,…

Dụng cụ và trang thiết bị gây cảm nhiễm: Bể composite 250 L, xô nhựa (60 L), máy sục khí, vợt, ñèn pin, máy chụp ảnh, thức ăn công nghiệp, ống chích, máy so màu quang phổ, máy ly tâm,…

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất gồm: Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất, cồn 70%, cồn 96%, bộ hóa chất nhuộm Gram, dung dịch H2O2, que thử Oxidase, môi trường O/F, glucose, paraffin, O/129, ñĩa thuốc kháng sinh, ống McFarland

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Tryptone soya agar (TSA): (40 g TSA, 1000 ml nước cất), Brain heart broth (BHB): (37 g, 1000 ml nước cất)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2 Phân lập vi khuẩn

Mẫu cá có dấu hiệu xuất huyết còn sống ñược quan sát và ghi nhận các biểu hiện bên ngoài và nội quan bên trong Lấy mẫu vi sinh trong ñiều kiện vô trùng ở 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng cấy trên môi trường TSA, ủ ở 28°C sau

24 giờ ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc Tiếp tục tách ròng 3 lần ñể có

ñược chủng vi khuẩn thuần cho thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 Định danh vi khuẩn

Sau khi ñược ñĩa vi khuẩn thuần thì tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của các chủng vi khuẩn trên như: nhuộm Gram, tính di ñộng, phản ứng oxidase, phản ứng catalase và khả năng lên men và oxy hóa ñường glucose (O-F), căn

cứ vào ñặc ñiểm hình thái và khóa phân loại của Barrow và Feltham (1993) ñể

xác ñịnh chủng vi khuẩn thu ñược là vi khuẩn Aeromonas (Phụ lục 2), chi tiết

thực hiện ñược trình bày ở phụ lục 3 Sau ñó gửi 2 chủng vi khuẩn (CĐ1012

và ĐT1001) ñến phòng xét nghiệm bệnh thủy sản tại Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ ñịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR vi khuẩn ñể xác ñịnh chính xác ñược chủng vi khuẩn thu

ñược là Aeromonas hydrophila (Phụ lục 4) và trữ vi khuẩn trong môi trường

thạch nghiêng ñể tiến hành bố trí thí nghiệm

3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm

3.4.1 Cá thí nghiệm

Cá lóc có khối lượng trung bình 20±5 g/con ñược mua từ hộ nông dân nuôi cá

ở Cần Thơ Cá ñược nuôi trong bể composit (250 L) một tuần trước khi bố trí thí nghiệm và cho cá ăn thức ăn công nghiệp (Hi-Pro) theo nhu cầu Sau ñó chọn những con cá khỏe có màu sắc sáng bóng, bơi lội nhanh nhẹn ñem bố trí thí nghiệm

3.4.2 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 ñược trữ trong môi trường

thạch nghiêng và ñược cấy truyền trên môi trường TSA, ủ ở 28°C sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy 2 khuẩn lạc cho vào 2 ống nghiệm chứa 5 ml môi trường BHB tiệt trùng, ñặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ, ở nhiệt ñộ 28°C Sau ñó chuyển vi khuẩn sang ống eppendof 1,5

ml tiệt trùng, ñem ly tâm 13000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng ñể rửa vi

khuẩn, quá trình này ñược lặp lại từ 3 lần Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25 ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau ñó trộn ñều mẫu bằng máy vortex Tiến hành xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và ñiều chỉnh OD tương ứng ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn OD = 1±0,02 tương ñương với mật ñộ

vi khuẩn là 109 CFU/ml Pha loãng mật số vi khuẩn ñể ñược các mật ñộ vi khuẩn: 104,105,106 và 107 CFU/ml và tiến hành bố trí thí nghiệm

Sau ñó xác ñịnh lại mật số vi khuẩn bằng cách dùng pipet lấy 20 µl dung dịch

vi khuẩn trãi ñều trên ñĩa petri có môi trường TSA ủ ở 28°C sau 24 giờ, ñếm

số lượng khuẩn lạc xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng công thức:

Số tế bào vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc trên ñĩa x Hệ số pha loãng x 50

3.4.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm

Nguồn nước dùng trong thí nghiệm là nước máy ñược trữ trong bể chứa có sục khí mạnh trong 3 ngày trước khi bố trí thí nghiệm Dụng cụ dùng cho thí nghiệm ñược khử trùng bằng chlorine Cá ñược bố trí ngẫu nhiên vào xô thí nghiệm ở mật ñộ 15 con/xô nhựa (60 L) chứa 30 L nước, có sục khí (Hình 3.1) Thí nghiệm ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức ñược lặp lại 2 lần với các nghiệm thức sau:

Nghiệm thức 1: Không tiêm (cá + môi trường)

Nghiệm thức 2: Đối chứng (cá + tiêm nước muối sinh lý)

Nghiệm thức 3: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x104 CFU/ml

Nghiệm thức 4: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x105 CFU/ml

Nghiệm thức 5: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x106 CFU/ml

Nghiệm thức 6: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x107 CFU/ml

Mỗi con cá ñược tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn, vị trí tiêm ở xoang bụng (gốc vi ngực)

Hình 3.1: Hệ thống xô thí nghiệm gây cảm nhiễm

3.4.4 Quan sát và thu thập số liệu

Quan sát

Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý, số cá chết trong suốt 14 ngày gây cảm nhiễm Tiến hành thu mẫu cá lờ ñờ và ghi nhận lại dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể mẫu cá Phân lập vi khuẩn

Phương pháp xác ñịnh LD 50

(Lethal dose: Nồng ñộ vi khuẩn gây chết cá 50%)

Xác ñịnh LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938) Xác ñịnh LD50

ñể biết ñược ñộc lực của vi khuẩn

Log LD50 = Log A + x Log 10

Trong ñó: Log A: nồng ñộ nhỏ và cận 50%

Log 10: ñộ pha loãng

%d: % số cá chết nhỏ và cận 50%

%t: % số cá chết lớn và cận 50%

Tái ñịnh danh vi khuẩn

12 chủng vi khuẩn ñược phân lập từ cá gây cảm nhiễm sẽ tiến hành tách ròng

và nuôi cấy ñể ñược ñĩa cấy thuần, sau ñó kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của các chủng vi khuẩn trên như: nhuộm Gram, tính di ñộng, phản ứng oxidase, phản ứng catalase và khả năng lên men và oxy hóa ñường glucose (O-F), căn cứ vào

%t - %d 50% - %d

ñặc ñiểm hình thái và khóa phân loại của Barrow và Feltham (1993) ñể xác

ñịnh chủng vi khuẩn phân lập ñược là vi khuẩn Aeromonas và tiến hành ñịnh

danh vi khuẩn bằng cách phương pháp PCR vi khuẩn

3.5 Xử lý số liệu

Số liệu tỉ lệ chết tích lũy của cá ñược thu thập và xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2003 Luận văn ñược trình bày bằng phần mềm Microsoft word 2003