Luận văn tốt nghiệp: Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hydrophthamus) bị bệnh xuất huyết - ĐH Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp: Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hydrophthamus) bị bệnh xuất huyết nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila, đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống,...Mời bạn đọc cùng tham khảo.

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HOC CAN THO KHOA THUY SAN

BO MON SINH HOC VA BENH THUY SAN

LUONG MY THUAN

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

VI KHUAN Aeromonas hydrophila

PHAN LAP TU CA TRA (Pangasianodon hypophthamus)

BI BENH XUAT HUYET

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HOC CAN THO KHOA THUY SAN

BO MON SINH HOC VA BENH THUY SAN

LUONG MY THUAN

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

VI KHUAN Aeromonas hydrophila

PHAN LAP TU CA TRA (Pangasianodon hypophthamus)

BI BENH XUAT HUYET

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Trang 3

LOI CAM ON

Được làm và hoàn thành tốt luận văn tết nghiệp là mong muốn của các sinh

viên Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu

cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh

Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cơ Đặng Thị Hồng Oanh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện để tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tinh quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cé van học tập

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu

Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan

lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời

Trang 4

TOM TAT

Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khudn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthabmus) bị bệnh xuất huyết? được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A

hydrophila Đồng thời cũng so sánh với kết quá định đanh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E, Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi khuan A hydrophila phan lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ quan (gan, thận và tỳ tang) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit

API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20°C Sau khi phục hồi trên môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng

sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiét tach bằng 2 cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý) Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala er ai (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và c¡y (2008)

Kết quả điện đi sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện điện của vi khuẩn A bydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp

Điện di sản phẩm PCR cia 7 ching A hydrophila ma khong qua bước chiết tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được DNA của A hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di Phán ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A

hydrophila la Ing/ul (hàm lượng DNA) Phương pháp PCR với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép phát hiện A zydrophiia hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các

chung (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli)

Trang 5

MUC LUC 9809.) 00 08a i ¡"v2 ii 18/959 01157 o iii DANH SACH BANG D920) \0:8.in/ 0n i Churong 1: GIGI THIBU cccccssessssessscsssesssecsnesssesessessseessecsvecssecsusssseesaeessnesase 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 52-55 525<2xtvzxvrvrrrreerre 3

2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam ó- 6 HH ngư, 3

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản -555-+- 3 2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh + 5s+ 22+ 22121112121 12112cz.xee 4 2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra + sx2 v2 2112111211112 111121121111.111 1211 tr 5 2.5 Sơ lược về vi khuẩn A ydrophila gây bệnh trên cá tra 7

2.6 Phương pháp PC - 2H HH HH HH nành 9

2.6.1 Khái niệm về PCR -t 2h ưn0 201110111201111021121112211 9 2.6.2 Các nhân tô ảnh hướng tới phản ứng PCR - - 11

2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản c55c5Sc 12

2.6.4 Đối chứng 2< St ke 2 1102111110711 T11 11 TH 1g giết 13 2.6.5 Hạn chế của PCR - s2 t2 2 1112171121111202111111120111 0211 1111 re 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - se c2xcverreecrxrrrreerxee 15

kh) na 15

3.1.2 Dia GIS nh ẽố ẽ 15

3.1.3 Nội dung thực hiện . cà HH HH HH Hàng ng ket 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu s 25+¿ 2x22 2E111212111271121111 17112111221 0, 15

khu 6 nẽ ẽ Ặ.Aaa Ả 15

3.2.2 Hoa chat thi nghiQm .scecssesssesssesesvesssessvecssessnesssceseessseessecseesssecssees 16

3.3 Phương pháp nghiên CỨU - 2s SH HH HH Hà hy 16

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 5 55-5+c2c<czeevrrrrrreee 16 iii

Trang 6

3.3.2 Ngudm vi KWAN o cccssessssesssssseeessesssecssscssessosssavsessecavecssscsuesssecsnssesseease 16

3.3.3 Phương pháp phân lập vi Kwan .ceeccsccsesssessssssssessessscessessseessessaseense 17

3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuân 18

3.3.5 Phương pháp PC -ó HH HH Hàng tt 18

3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR ‹ 20

3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21 Chương 4: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN - 5-52 cccccxrerceecre 22 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A hy/rophiia trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22 4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn - + 5c 25Sccrxecrxeckxerrkrrxrrrreeree 23 4.3 Phát hiện vi khuẩn A byđrophiia bằng phương pháp PCR 24

4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila 26 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hyđrophila 27

Trang 7

DANH SACH BANG

Bang 3.1: Trinh tự 2 doan mdi sit dung trong qui trinh PCR (Panangala et al., 2007) HH“ HH kh TT Tà TH ng TH TH T101 12 16 Bang 3.2: Nguén géc cdc ching vi khuẩn sử đụng cho đề tài 17

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện A ñydroplil4 SH re 19

Trang 8

DANH SACH HINH

Hình 2.1 Nguyên lý kY thudt PCRou sccccsssccssssecsssssessesssesessseesesssecssssecesssneess 10

Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục) 5s s22 c2 2111 1111011 T1 Tra ngà tre rey 22

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A hyẩrophila trên môi trường Aeromonas ägar + AImpiCiÌÏÌT sọ HT TH HH cuc TH Hàn Tà 23 Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A byđrophila trên môi trường NA 23 Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila cccccccc 24 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A hyẩrophila 25 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A byđrophiÏAd ch HH HH ng TH nh ch ng 26 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A hydrophila x4c định độ nhạy của phương phấp sa cà nh HH TH TH HH cư gi 27 Hình 4.8 Kết quá điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A #ydrophild HH HH HH ng ng cư 28

Trang 9

Chuong 1 GIOI THIEU

Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

(ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị

trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể Năm 2006, sản

lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tan, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy

sản của cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra

dat 380.489 tan, khối lượng cá tra xuất khâu được 173.100 tắn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007)

Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, đo chỉ

phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến (50-60 con/m” ao), đã làm nẫy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quán ly tốt môi trường nước ao nuôi Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường

Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006) Cá tra là một

loài cá kinh tế và khi có địch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng

ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan,

2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng đa (Phạm Thanh

Hương, 2006), nghiên cứu khá năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri va Aeromonas hydrophila (Ngé Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang

(Phan Khắc Huy, 2008),

Bệnh xảy ra trên cá tra đo nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm,

dinh đưỡng, Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh

nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra Các loại bệnh do

tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột,

trắng gan trắng mang, trắng đa trắng đuôi, Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh

đốm đỏ) đo vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phô biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007)

Trang 10

pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát

hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Cũng như Ngô Minh Dung (2007) gây cảm nhiễm vi khuẩn A hyđrophila và E ictaluri trên cá tra, sau đó tái

định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1

tuần để đọc kết quả, hàng loạt các để tài nghiên cứu của Lương Trần Thục

Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng

kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả Cụ thể

Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả

định danh vi khuẩn sau khi đùng phương pháp sinh hóa truyền thống va kit API 20E để định danh EÈ ictaluri trén cá tra, đã kết luận phương pháp PCR cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần l ngày, Nguyễn Hà

Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt Do đó để chân đoán nhanh

va chinh xdc vi khuan A hydrophila trén cd giúp cho người nuôi phát hiện kip

thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng

phương pháp PCR Nén dé tai “Ung dụng phương pháp PCR phát hiện vỉ khuẩn Acromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthaimus) bị bệnh xuất huyết" được thực hiện nhằm góp phần vào việc chuân hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A hydrophila gây bệnh ở cá tra Mục tiêu nghiên cứu

Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hién A hydrophila phan lap

từ cá tra bị bệnh xuất huyết

Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hién A hydrophila phan

lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết

- Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phat hién A hydrophila - Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

Trang 11

Chuong 2

LUQC KHAO TAI LIEU

2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), cho biết 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD,

tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái Trong đó, sán phẩm tôm đông lạnh chiếm

32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,0%; còn lại là các loại thủy sản khác Theo Thứ

trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm:

Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới nhằm đây giá nguyên liệu tăng lên Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng

cho các đoanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008)

Tình hình nuôi thủy sản ¿ ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi

thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn 70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa điện tích ni

tồn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn) Diện

tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tần; năm 2002

là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng

773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn Quy

hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước

mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL (Pham Đình Đôn, 2006) Song song với việc tăng điện tích và năng suất NTTS

thì vấn đề địch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa đạng do

nhiều tác nhân

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản

Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước

càng bị ô nhiễm đo chất thải từ các ao nuôi Cùng với sự ô nhiễm do chất thải

từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn Đối

với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào

Trang 12

động môi trường do chất thải trong sản xuất chế biến công nghiệp, cũng góp phần tác động đến chất lượng môi trường nước ảnh hưởng đến cả kinh tế và môi trường sinh thái (Phạm Đình Đôn, 2006)

Mặt khác do nước ta nằm trong khu vực diễn biến thời tiết ngày càng phức tạp, ánh hưởng đến môi trường nuôi thủy sản làm cho động vật thủy sản dễ bị

sốc Cuối năm 2007, chương trình phát triển của Liên Hiệp Quốc đã xác định: Việt Nam là 1 trong 5 vùng bị tác hại của biến đổi khí hậu nặng nề nhất thế giới ĐBSCL là vùng đất thấp ven biển Đông của Việt Nam nên sẽ là khu vực bị tác hại nặng nề nhất đo biến đổi khí hậu (Lệ Thu, 2008)

Theo các nhà khoa học, 10 năm qua, diện tích NTTS ở ĐBSCL đã tăng hơn

2,37 lần, sản lượng tăng vọt lên 3,68 lần nhưng cũng làm cho nguồn nước bị ô

nhiễm nặng, đe dọa sự mắt cân đối trong chiến lược qui hoạch thủy lợi hiện

nay Ước tính mỗi năm, hoạt động NTTS đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 4

triệu tấn bùn ở đạng chất thai hữu cơ gần như chưa được xử lý Mầm bệnh từ

các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn chat thai nay ra hệ thống sông rạch làm chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề Thực tế cho thấy nuôi cá tra, cá ba sa trong ao hầm, chỉ có khoảng 17% thức ăn được cá hấp thụ, phần còn lại khoáng 83% hòa lẫn, lắng đọng trong môi trường nước thành chất hữu cơ phân hủy đã làm cho mơi trường bị suy thối (Trần Khánh Linh, 2007)

2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh Theo Từ Thanh Dung (2005)

Thời kỳ ủ bệnh: Đây là thời kỳ từ khi nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào

cơ thê đến lần thứ nhất xuất hiện triệu chứng bệnh, lúc này triệu chứng bệnh

bình thường của cá bị thay đổi Trong thời kỳ ủ bệnh sinh vật ký sinh tìm cách tích lũy dinh dương để tăng cường độ sinh sản và hoạt động, ký chủ tạo ra

những yếu tố miễn dịch phòng vệ

Thời kỳ dự phát: Là thời kỳ chuyển tiếp từ lúc xuất hiện bệnh đầu tiên đến

bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá

Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ

Trang 13

2.4 Sơ lược về bệnh ớ cá tra

Theo nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam (2007)

Cá tra cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, đễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến Các tác nhân gây bệnh cho cá gềm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuân và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi

trường, dinh dưỡng hoặc do các vi sinh vật gây ra Bệnh do giáp xác ký sinh

Bệnh trùng mô reo

Trùng gây bệnh có tên Lernaea, có dạng giống Thỏ neo, cơ thể có chiều dai 8- 16mm, giống như cái que, đầu có mẫu cứng giống mỏ neo cắm sâu vào cơ thé cá Trùng thường ký sinh ở đa, mang, vây và mắt cá

Bệnh rận cá (Argulosis)

Trùng gây bệnh thuộc giống Arguius, có hình dạng giống con rệp nên còn gọi là rận cá hay bọ cá, bọ ve, nhìn thấy được bằng mắt thường

Bệnh nắm thúy mi ( Saprolegiosis)

Do 2 giống nấm $aprolegnia và Achiya gây ra gồm có Saprolegnia

parasitica, S ferox, Achlya spp Cá bị bệnh có dấu hiệu trên đa cá xuất hiện những vùng trắng xám, giống đám bông mềm Nhiệt độ nước 18-25°C thích

hợp cho nắm phát triển Bệnh Ký Sinh Trùng

Bệnh trùng bánh xe ( Tríchodinosis)

Dấu hiệu: thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt Cá

thường nôi đầu và tập trung nơi có nước chảy, đôi khi nhô đầu lên mặt nước lắc mạnh đâu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuông đáy roi chét

Bénh tring qua dua (Ichthyopthisiosis)

Trùng quả đưa ký sinh trên da, mang và vây Trùng bám thành các hạt lắm tắm

rất nhỏ, có thể thấy được bằng mắt thường Biểu hiện là da và mang cá có nhiều nhớt, màn sắc nhợt nhạt Cá nổi đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ

Trang 14

Gyrodactylus, cũng có thê là tác nhân gây bệnh cho cá tra Trần Văn Tếch

(2008) đã phân tích mẫu cá tra bị bệnh vàng da phát hiện có (2ac?ylogyrus, Trichodina, Myxobolus, Bucephalopsis, ) nhưng chưa xác định ký sinh trùng là tác nhân gây bệnh vàng da trên cá tra

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromonas gồm có A

hyrophila, A caviae và A sobria Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều chất

hữu cơ Cá con đễ mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thê gây chết đến 80%

Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)

Tác nhân gây bénh do Pseudomonas fluorescens, P anguilliseptica, P

Chiororaphis Cá bị bệnh này có đấu hiệu xuất huyết từng đốm nhỏ trên đa,

xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thê chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn

Nhiễm khuẩn huyết do Eđwardsiella

Bệnh do vi khuẩn E /zrda gây ra Xuất hiện những vết thương nhỏ trên đa

(phía mặt lưng) Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng

bên trong cơ và đa bị mất sắc tế Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do

vây đuôi bị rách, gay Có thé xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi Ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng

cơ xung quanh Ngoài ra, Trần Thị Ngọc Hân (2006) thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá tra bằng 2 phương pháp ngâm và tiêm E.ictaluri két quả đến

ngày thứ 10 bên ngoài cá có hiện tượng xuất huyết vây đuôi, trên thận có đốm

trắng

Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản

mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vỉ khuân gram âm, tác nhân vi khuẩn

được coi là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy

san (Inglish et al., 1993) Mặc khác theo Buler (2004) vi khuẩn không chỉ tồn

tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo

chất lượng nước (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008) Vi khuẩn 4 hydrophila là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và thường

gặp trên cá tra hiện nay

Trang 15

2.5 Sơ lược về vi khuẩn A hydrophila gay bénh trén cé tra Tac nhan gay bénh

Theo Bùi Quang Té (2005) giédng vi khudn Aeromonas thudc ho

Aeromonadaceae, b6 Aeromonadales, \6p Gammaproteobacteria, nganh

Proteobacteria Trong giéng Aeromonas cé 2 nhém, (1) loài vi khudn không

đi động (A salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi

khuẩn di động bao gồm (A hydrophila, A caviae, A sobria), đặc tính chung

của 3 loài vi khuẩn này là đi động nhờ có Í tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình

que ngắn, hai đầu tròn, phản ứng oxidase dương tính, khử nitrat, không mẫn

cảm với thuốc thử O/129 Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được

phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A hydrophila (trích

dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008)

Theo Bergey (1957), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao

gồm 3 loài A hydrophila, A caviae, A sobria Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi, là bệnh do vi khuẩn A hydrophila Vi khuẩn A hydrophila phát triển trên môi trường thạch có khuẩn lạc tròn, mầu vàng rất nhạt, rìa đều hơi lồi, ướt, nhẫn bóng Vi khuẩn đi động

(có 1 tiêm mao), gram âm, oxidase đương tính, kháng với O/129, hiếu khí và

hiếm khí không bắt buộc, có khả năng lên men, hình que ngắn đài 2-3 ym, hai

đầu hơi tròn Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28-30°C, sinh

trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 (trích dẫn bởi Từ Thanh

Dung, 2008)

Theo Lewis & Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thi A hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt

quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những lồi cá ni

và cá tự nhiên, theo Angka (1990) A hyđrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung,

2007)

Bên cạnh đó trong báo cáo của Saitanu e/ zi., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A hyảrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là đa thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên (thân, các gốc vây, quanh miệng), hậu môn xuất huyết, mắt lồi đục Ở cá tra và cá

Trang 16

địch nhờn có mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu

(Bui Quang Té, 2006)

Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sam mau từng vùng ở bụng, xuất hiện

từng máng đỏ trên co thé, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên

lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vay dé roi rung, mắt lồi mờ đục, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử

Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều loài cá khác Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A #yđrophila và

Pseudomonas fluorescens Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ trên mặt nước, trên

thân xuất hiện điểm xuất huyết nhỏ li tỉ, nếu bệnh nặng thì các gốc vây cũng

xuất huyết Bụng cá trương to, thành ruột xuất huyết, cá ít ăn hoặc bỏ ăn Các

tia vây lưng, hậu môn và vây đuôi bị rách xơ xác (Bộ thủy sản, 2008)

A hydrophila, A caviae va A sobria cả 3 loài phân lập được trên cá khi có

dấu hiệu bệnh nhiễm khuẩn huyết, mặt dù A hydrophilz là loài thường gặp

nhất Thỉnh thoảng cũng phân lập được vi khuẩn gram âm khác như

Pseudomonas fluorescens (theo Roberts & Horne 1978, Schaperclaus 1926)

hoặc Profeus refigeri trên cá bị nhiễm khuẩn huyết (theo Bejerano et al

1976), có thể phân lập được đĩa cấy thuần của một chủng, hoặc kết hợp nhiều

chúng thì gây anh hưởng cao hơn (trích dẫn bởi Inglis et al, 1993) Phân bố và lan truyền bệnh

Đỗ Thị Hoda va ctv (2004) bénh nhiém tring do A hydrophila thuéng gặp ở nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung

Quốc, Nhật Bán, Đài Loan, Thái Lan, Úc, Ở Việt Nam, các lồi cá ni

lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, tra, basa, trôi,

chép, mè, trê, Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70% Bệnh có

thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt và cá bố mẹ Ở Việt Nam bệnh do A byđrophila có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuắt hiện nhiều

vào đầu mùa mưa, mùa có nhiệt độ 25-28°C

Ở Châu Âu, bệnh do A hyđrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa

xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22°C, đây là khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993 trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Chẵn đoán bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2008), chan đoán bệnh do Aeromonas là dựa vào các

dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ xuất hiện bệnh, kết quả phân lập bằng phương pháp truyền thống Để phát hiện bệnh nhanh và ở giai đoạn sớm của bệnh cần áp

Trang 17

dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), hodc ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Một số nghiên cứu về A hydrophila

Groberg (1978) khi gay cam nhiém A hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận tỷ lệ chết thường cao ở 20,5°C va 17°C, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15°C và 12°C,

còn ở 9°C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and

Stevenson, 1988; trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thf nghiém gây cảm nhiễm A

hydrophila trén c4 vang (Carassius auratus) bang 4 cach: tiém 6 bung (mat

a6 vi khudn 3x10*-3x10® CFU/ml), tiêm dudi da (8,5x10*-8,5x10° CFU/ml), tiêm ở co (8x10*-8x10® CFU/ml), va ngim vi khuẩn (4,6x10!-4,6x10”

CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới

da độc lực của vi khuân mạnh nhất với giá trị LDsạ là 105“ CFU/ml (trích dẫn

bởi Ngơ Minh Dung, 2007)

Ngồi ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng

A hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 107 đến 10” CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LDạo lần luge 1a 3,68x10° CFU/ml, 2,64x10° đến 4,52x10° CFU/ml và 1,96x10° dén 1,45x10’ CFU/ml

2.6 Phương pháp PCR

2.6.1 Khái niệm về PCR

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) do Karl Mullis e? ai phát mỉnh năm 1985 Thực chất đây là một phương pháp tạo

dong DNA invitro khéng can có sự hiện điện của tế bào (trích dẫn bởi Đặng

Trang 18

PCR : Polymerase Chain Reaction

30 - 40 cycles of 3 steps :

/74000404⁄ Step 1: den

mhmrm mm " 1 minut 94 °C

Uy ey J A

SMM TTT TTT TT tte TTT TT TT TT ; Step 2 : annealHỆNN Š ,

3 Woy HHU dụ # » $y 3 ry 45 seconds 54 °C Ỷ H : , x Ty LACE wy J Wty 3 $' primers !!! forward and reverse ÝTmMTTTTTT Kế Mà Z1 n Hạ ll, Ạh 3 Step 3: bo Ị 2 - mm, ` N DỤ LỤ ‘ys 2 minutes 72 °C mnt Tí yer | 4+ ` only dNTP's Hy wu » any Via 9

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2003)

PCR là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm từ

một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn môi

(oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA, các nucleotide tự đo và dung dịch

đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chống, thậm chí với một tiểu phần virus Hiện nay PCR được ứng dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để chân đoán và phát hiện mầm bệnh

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ( 2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn là:

Giai đoạn 1 (bién tinh — denaturation): Trong một đung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, phân tử DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) cuả phân tử, thường là 94-

95°C trong 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn

Giai đoạn 2 (lai -hybridization): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn

Tm của các mỗi cho phép mỗi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này đao động trong khoảng 40-70°C Tùy thuộc vào Tm của các đoạn mỗi sử

Trang 19

dụng mà thời gian bắc cặp khác nhau và kéo đài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Giai đoạn 3 (tổng hợp —extension): Nhiệt độ được tăng lên 72°C, đó là điều

kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bố sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase

hoạt động Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tứ DNA khuôn được

nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân lên trong chu kỳ lại làm

khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó san mỗi chu kỳ số lượng DNA

được tông hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau (n) chu kỳ nhân bản sẽ tao

ra 2" bản DNA từ một khuôn ban đầu

PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen

của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản PCR cũng được dùng để

phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng đi truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quan thể PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và nắm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở trên tôm hiện nay được chân đoán bằng PCR như virus đốm trắng (WSSV),

virus đầu vàng (YHV), virus gây hội chứng Taura (TSV), virus gây hoại tử cơ

quan tạo máu và cơ quan tạo lập biểu mô (THHNV) (Đặng Thị Hồng Oanh,

2007)

Khơng chỉ đối với vi khuẩn mà cả virus, multiplex PCR (mPCR) đã có những bước phát triển mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả

chân đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm thời gian và công sức Yang et al (2006) đã phát triển phương pháp m PCR phát hiện đồng thời hai loại virus THHNV và WSSV trên tôm he

2.6.2 Các nhân tố ảnh hướng tới phản ứng PCR

DNA khuôn: Khuất Hữu Thanh (2003) khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng tối ưu với các đoạn khn hồn

tồn tính sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tỉnh sạch của DNA khuôn

Trang 20

Mỗi và nhiệt độ gắn mỗi: Môi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản img PCR Chọn mỗi cần tính toán để bảo đảm Tm của mỗi xuôi và mỗi ngược

không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5°C và nhiệt độ

nóng chảy của mỗi khoảng 72°C Độ dài mỗi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, néu mdi nhé hon 10 nucleotide mỗi bám không đặc hiệu Còn mỗi đài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005) Các mỗi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể

bat cặp bé sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mỗi bắt cặp ở giữa khuôn

PCR không thành công Tỷ lệ G-C giữa các mỗi thường chiếm khoảng 40- 75% để đảm bảo liên kết gắn mỗi với khuôn bền vững Tuy nhiên trình tự G-C

không lặp lại quá nhiều lần trong một mỗi Các mỗi chọn phải đặc trưng cho

trình tự DNA cần khuếch đại Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự nằm giữa hai mỗi không quá lớn 1 kb Sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3° của mỗi đã liên kết với khuôn mặc đầu đầu 5° có thé tự đo Do đó đầu 5° của mỗi có

thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Thể

tích mỗi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM Thể tích mỗi thường được xác định đựa

vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006)

Nong độ các loại nucleotide tự đo: Nong độ các loại nucleotide (dATP, dGTP,

dCTP, dTTP) khoang 20-200 uM/ mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp

sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao đễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Nong 46 Mg”*: Theo Tran Thi X6 va Nguyén Thi Lan (2005) ion Mg”* 1a thành phần không thé thiéu duge cia phan ing PCR, ndng d6 Mg”* t6i ưu dé

thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 HM Nước sử dụng cho phản ứng phải

tỉnh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không chứa các enzyme cắt hạn chế

và các enzyme phân hủy acid nucleic Môi trường dung dịch đệm phải én

định Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 29-50 pl

Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) số lượng chu kỳ PCR

thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng

theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của

phản ứng, (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, (3) các bản sao

vừa được tông hợp không kết hợp với mỗi mà bắt cặp với nhan, 2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản

Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì ứng đụng của PCR là: Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở đạng tiềm ấn, giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản

Trang 21

có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi như: (1) Giúp chân đoán

bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nỗ bệnh và cách giải quyết (2) Phòng bệnh:

kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống (3) Kiểm soát bệnh: theo đối kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu

Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu - Sự nhiễm khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây

bệnh, hay có thể là các lồi đơng vật thủy sản

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR

là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mằm bệnh vi khuẩn, virus, ký

sinh trùng và nắm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chân đoán bằng PCR bao gồm: virus đếm trắng (WSSV), virus đầu vàng

(YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV),

virus gây hội chứng Taura (TSV) 2.6.4 Đối chứng

Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau

- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để

kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm

- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được

khuếch đại và mỗi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ 2.6.5 Hạn chế của PCR

Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn DNA có

chiều đài lớn hơn 3kb ( kết quả tốt với những đoạn DNA có chiều đài nhỏ hơn 1,5 kb)

Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước, dé bị tạp nhiễm do tính nhạy cảm và lỗi thao tác

Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzyme gắn sai một nucleotic)

Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giá do DNA từ tế bào chết gây ra Bên cạnh đó việc phát hiện mầm bệnh riêng lẽ bằng PCR thường gây tốn kém, do đó các nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chỉ phí bằng cách

Trang 22

cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Trần Linh Phước, 2003; trích dẫn bởi Phạm Thị Thu Trang, 2005)

Trang 23

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2008 — 05/2009

3.1.2 Địa điểm

- Thu mâu: Cân Thơ, Vĩnh Long và Đông Tháp

- Nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản —

Khoa Thủy sản, trường Đại học Cân thơ

3.1.3 Nội dung thực hiện

- Thu mẫu cá tra bệnh

Phân lập vi khuẩn ở các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) của cá tra bị bệnh

xuất huyết

Phục hồi vi khuẩn đã được định đanh và trữ trong glycerol 50% Cấy vi

khuẩn trực tiếp lên môi trường thạch đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin

Tách vi khuẩn sang môi trường NA, nuôi tăng sinh vi khuẩn trong NB Dùng phương pháp PCR phat hién A hydrophila

Xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của phương pháp PCR 3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ

- Máy chu kỳ nhiệt, máy so màu quang phổ, máy ủ, máy li tâm, máy

vortex, may lắc, máy PCR, lò viba, bộ điện di, bàn đọc UV, bộ chụp ảnh

gel, máy vi tính

-_ Cân điện tử, pipet tự động, tủ lạnh, tủ đông, tú sấy, nồi autoclave - Ống eppendorf 1,5 ml và 0,5 ml

Đầu col pipet các loại

Ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tính, ống đong, chai nấu môi trường

Đèn côn, bình xịt cồn, que cấy, hộp quet

Trang 24

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm

- _ Môi trường nuôi cấy phục hồi vi khuẩn: Nutrient Agar (NA), Aeromonas agar + Ampicillin (18,35g agar + l lọ trong 500ml nước), Nutrient Broth (NB) - Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dich chay dién di TAE - NB (8g Nutrient Broth, trong 1 lit nuéc cAt) - TE (pH 8.0) gồm 10 mM Tris HCl va mM EDTA

- Hoa chat ding trong khuéch dai DNA: Buffer 10X, MgCl, dNTPs (10

mM), Taq DNA polymerase (5U), mi, nước cất 2 lần

Côn tuyệt đối, nước cất, NaCl

Bang 3.1 Trình tự 2 đoạn môi sử dụng trong qui trinh PCR (Panangala et al., 2007)

Tên mỗi Trinh ty

AeroEd (mỗi xuôi) 5CCAAGGGGTCTGTGGCGACA3” AeroRs (mỗi ngược) |5 TTTCACCGGTAACAGGATTG3'

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển

-_ Dự kiến thu khoáng 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khóe (mẫu được thu từ tháng 12/2008 đến tháng 2/2009)

-_ Cá thu có đấu hiệu bệnh lý và còn sống

- Mẫu được vận chuyên về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và được phân tích ngay Chỉ sử đụng những mẫu còn sống

3.3.2 Nguồn vi khuẩn

Các chúng vi khuẩn A hydrophila duge phân lập trên cá tra bị bệnh xuất huyết ở các tĩnh Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp

Trang 25

Bảng 3.2 Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài

STT Địa điểm Cơ quan phân lập Ký hiệu

1 Sa Đéc - Đông Tháp Tỳ tạng SD(tt)

2 |Sa Đéc - Đồng Tháp Thận SD)

3 Mang Thích — Vĩnh Long Tỳ tạng CA(Đ

4 Mang Thích - Vinh Long Thận CA()

5 | Thết Nốt—- Cần Thơ Tỳ tạng TN(tt)

6 | Thét Nét - Can Tho Than TN(t)

7 | Thết Nốt- Cần Thơ Gan TN(g)

3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Mẫu cá bệnh thụ về phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản, được giữ sống

bằng cách bó vào thùng mướp có sục khí Mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và

2 cá khỏe

Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của cá: màu sắc, vết thương, điểm xuất

huyết

Mỗ cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng: điểm xuất huyết, mii,

mau sac cdc co quan ndi tang

Cấy vi sinh từ các co quan (gan, thận, tỳ tạng) lên môi trường NA (Nutrient agar) và môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin

Các thao tác được thực hiện bên ngọn đèn cồn và các dụng cụ được vô

trùng, để trách tạp nhiễm

Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30°C Sau 18-24 giờ quan sát va ghi

nhận hình dạng của khuẩn lạc, nếu đĩa cây chưa thuần tiếp tục tách ròng

sang đĩa NA để đạt đĩa cấy thuần

Sau đó nhuộm gram, xem tính di động, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bán Nếu vi

khuẩn di động, gram âm, Oxidase dương tính, Catalase dương tính thì đem nuôi trong môi trường lỏng NB (5ml) sau 18-24 giờ ở 28-30°C

Định đanh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống, các chỉ tiêu sinh hoá

được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993) Sau đó định

danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E

Kết quả định danh được 8 chủng A hydrophila, sau đó trữ vi khuẩn trong ống

Trang 26

3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

- Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicilin, ghi nhận kết quá phục hồi vi khuẩn sau

18-24 giờ ở 28-30°C

- Chọn một khuẩn lạc thuần từ đĩa Aeromonas agar tách sang đĩa NA ủ ở 28-30°C, sau 18-24 giờ

- Chon một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB ủ

trong tủ ấm 28-30°C, sau 18-24 giờ kiểm tra kết quả

3.3.5 Phương pháp PCR

Chiét tach Acid nucleic (Bartie va ctv, 2006 trích dẫn bởi Nguyễn Trúc

Phương, 2008)

Chiét tach Acid nucleic tir vi khudn nudi trong NB

-_ Nuôi tăng sinh vi khuẩn (18-24 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường NB

- Chuyén 1,5 ml dung dich vi khuẩn sang ống eppendorf

- Tiép tue cho vao 100 yl dung dich TE (10 mM Tris HCl va 1 mM

EDTA)

- U6 95°C trong ving 15 phút

-_ Làm lạnh nhanh ống eppendorf trong nước đá -_ Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút

- Rut phan dung dich bên trên sang ống eppendorf mới

- Do hàm lượng DNA bằng máy so màu quang phổ (Biomate) ở 260 nm -_ Xác định hàm lượng DNA

Đầu tiên, sử dụng nước cất 2 lần dé tao mau blank, ri do mau DNA đã được pha loãng 10 lần (50 1 DNA + 450 1 nước cắt 2 lần) Hàm lượng DNA được

tính theo công thức

Ham Iwong DNA (ng/ul) = A2r6onm X 50 x d6 pha loãng

Chiét tach Acid nucleic tir khudn lac vỉ khuẩn pha loãng trong dung địch 0,85% NaCl

- Cho 1,5 ml nước muối sinh lý (0,85% NaC]) vào ống eppendorf, tiếp tục

dùng que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa NA cho vào ống eppendorf

Trang 27

- Cho thêm 100 pl dung dich TE vao éng eppendorf va tiép cdc bude giéng như chiết tách vi khuẩn trong môi trường NB

Mẫu lấy trực tiếp từ đĩa cấy NA đem khuch đại

Sau khi chuẩn bị các chất tham gia phản ứng khuếch đại trong ống eppendorf, 24 ul/mẫu (PCR Buffer, MgCl;, dNTPs, Taq DNA polymerase, doan méi

AeroEd, đoạn mỗi AeroRs, nước cất), dùng đầu col lay một ít vi khuẩn trên

đĩa nuôi cấy (NA) cọ vào thành eppendorf có chứa các thành phần tham gia

phản ứng khuếch đại

Khuếch đại DNA: (theo Panangala cív, 2007 có chỉnh sữa bởi Đặng Thị Hoang Oanh va crv, 2008)

Thanh phan cho phan tng

Bang 3.3 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui

trình PCR phat hién A hydrophila STT Thành phần tham gia phan img Hàm lượng Thể tích 1 |PCR Buffer 1X 2,5 wl 2 |MgCh 1,5 mM 1,5 pl 3 | dNTPs 200 ¡M 0,5 wl

4 Taq DNA polymerase 2,5 U 0,5 pl

5 | Đoạn mỗi (AeroFd) 0,4 uM II

6 | Đoạn mỗi (AeroRs) 0,4 uM 1ul

7 |DNA mẫu 20 ng 1ml

8 Nước cất - 17 ml

Tổng cộng | 25 pl

Chu kỳ nhiệt

1 Giai đoạn tiền biến tính: 95 °C trong 4 phút 2 Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm

Giai đoạn biến tính: 95 °C trong 30 giây

Giai đoạn gắn mỗi: 60 °C trong 45 giây

Giai đoạn kéo đài chuỗi: 72 °C trong 30 giây

3 Giai đoạn kéo đài chuỗi cuối cùng: 72 °C trong 10 phút Chạy điện di

Chuẩn bị bản thạch (gel )

Trang 28

60 °C cho ethidium bromide (10 mg/ml) vao réi lắc nhẹ dé ethidium bromide

tan đều, tiến hành đỗ agarose vào khay đựng gel Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel Thường bề dày của gel không quá 0,8 cm Khi gel

đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel và keo dán 2 bên ra khỏi khay đựng gel Cho gel

vào bồn điện đi Thêm dung dịch điện đi cho vừa bao phủ gel Dùng thang

DNA cho từng gel để xác đình khối lượng phân tử của sản phẩm PCR Dùng pipette hút 10 n1 cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt dung dịch nạp mẫu

(loađing Dye 6X) cho vào từng giếng một Điện đi

Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nỗi bền điện đi với nguồn

điện để chạy Sử dụng dòng điện 100-150 V (không vượt quá 150 V) để chạy

gel Ngừng điện đi khi màu xanh đậm đi chuyên khoảng 1/2 đến 2/3 gel Sau

đó tiến hành đọc kết quả

Doc két qua

Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy

đọc gel Vilber Lourmat Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus để xác định trọng lượng phân tử Trọng lượng phân tử đoạn DNA của vi khuan A hydrophila

cần phát hiện là 209 bp

3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR

Tương tự Panangala e a/., (2007) xác định tính nhạy và tính chuyên biệt của

của phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời F columnare, E ictaluri va A hydrophila Ö đây cũng thực hiện phản ứng với các hàm lượng DNA khác

nhau của vi khuẩn để xác định hàm lượng thấp nhất có thể phát hiện 4 hydrophila Thí nghiệm được thực hiện với DNA được chiết tách từ vi khuẩn

A hydrophiia nuôi trong NB

Thí nghiệm: Từ đĩa cấy thuần của môi trường NA, lấy vi khuẩn nuôi tăng sinh trong môi trường NB sau 18-20 giờ, sau đó pha loãng 10 lần với 10 nồng độ khác nhau, nồng độ từ 10° đến 107 với (10° = 100 ng/ul) Thẻ tích mỗi mẫu

DNA sử dụng là Ipl/phản ứng Thực hiện phản ứng PCR và chạy điện di để

tìm ra nồng độ thấp nhất có thé phát hiện được A hyárophiia (như mục 3.3.5)

Trang 29

3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR

Tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện A hyđrophiia sẽ được xác định

bằng cách sử dụng DNA chiết tách từ các chủng vi khuẩn phổ biến trong thủy sản như sau: 1, Vibrio harveyi 2 Vibrio alginolyticus 3 Pseudomonas putida 4 Eschericchia coli 3 Edwardsiella ictaluri

Trang 30

Chương 4

KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quá phân lập vi khuẩn 4A hyfrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết

Kết quả thu mẫu và phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản-Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ đã thu mẫu được

tổng số 17 ao (5 ao cá bị bệnh xuất huyết và 12 ao cá bị bệnh mũ gan) ở 3 tỉnh

Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ (xem bảng 4.1) Bảng 4.1 Bảng kết quả thu mẫu cá tra bị bệnh STT| Địađim | Tổng số | Số ao bệnh | Số ao bệnh | Số chủng ao thu xuất huyết mu gan Aeromonas 1 | Đông Tháp 10 1 9 6 Vinh Long 4 1 3 4 3 | Cần Thơ 3 3 0 18 Tong cong 17 5 12 28

Số ao thu được ở Đồng Tháp là 10 ao (1 ao bị bệnh xuất huyết), Vĩnh Long thu 4 ao (1 ao bệnh xuất huyết) và ở Cần Thơ thu 3 ao tất cả đều bị bệnh xuất

huyết Cá tra bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu thường gặp nhất là xuất huyết ở

góc các vi, da, nắp mang, quanh miệng hay xuất huyết quanh mắt và phù mắt, mồ cá thấy thành bụng xuất huyết xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn có mùi

hôi thối (Hình 4 )

Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất

huyệt và mắt lôi đục)

Kết quả phân tích mẫu vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 6 chủng; Vĩnh Long: 4 chủng;

Cần Thơ: 18 chủng) Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và hình 22

Trang 31

thái khuẩn lạc đã chọn ra 8 chủng vi khuẩn đại điện (Đồng Tháp: 2 chủng;

Vĩnh Long: 2 chủng; Cần Thơ: 4 chủng) (xem bảng phụ lục 1) Sau đó 8 chủng vi khuẩn phân lập được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền

thống (xem bảng phụ lục 2) và bộ kit API 20E (xen bảng phụ lục 3) đã cho kết

quả định danh là vi khuẩn A hydrophila (kết quả từ đề tài của Trần Thanh

Phú, 2009) Vi khuẩn sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường NB sau 24 giờ và trữ trong glycerol (50%) giữ ở (-20°C)

4.2 Kết quá phục hồi vi khuẩn

Kết quả có 7 chủng A hyđrophila đã được phục hồi cấy lên môi trường

Aeromonas agar + Ampicillin (hinh 4.2), sau đó tách sang môi trường NA

(hình 4.3), ủ ở 28-30°C sau 18-24 giờ cho khuẩn lạc thuần, hình dạng khuẩn lạc tròn, hơi lồi, nhấn và có màu vàng nhạt

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A hydrophila trên môi trường Aeromonas agar + Ampicillin

Hình 4.3 Hình khuẩn lạc của A hydrophila trén moi trường NA

Vi khuẩn A hyđrophila được phân lập từ các cơ quan (gan, thận và tỳ tạng)

của cá tra bị bệnh xuất huyết ở Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ Sau đó vi

23

Trang 32

khuẩn đã được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kít API

20E sau đó trữ trong glycerol (50%) Kết quá phục hồi vi khuẩn trên môi

trường đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin, quan sát hình dạng khuẩn lạc

và nhuộm gram thấy phù hợp với kết quả đã được định danh Định danh 4 hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống hay bộ kít API 20E là 2

phương pháp phổ biến, đùng phương pháp nào cũng cho ra kết quả, tuy nhiên

đối với phương pháp sinh hóa truyền thống mắt nhiễu thời gian hơn ding kit

API chi can vai ngày

Vi khuẩn sau khi phục hồi tiến hành kiểm tra, thay kết quả vi khudn gram 4m, di động, có dạng hình que ngắn (hình 4.4) Kết quá này cũng phù hợp với kết

quả ghi nhận của Ngô Minh Dung (2007) phân lập A hydrophila sau khi gây

cảm nhiễm trên cá tra

Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuan A hydrophila 4.3 Phát hiện vi khuẩn A hydrophila bang phương pháp PCR

PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác mầm bệnh vi sinh vật trên tôm, cá Với phương pháp PCR chỉ cần khoảng 1 ngày đã nhanh chóng phát hiện A hyđrophila, mà kết quá lại chính xác, vì khi đúng là DNA của A

hydrophila mới bắt cặp với mỗi đặc trưng và hiện vạch tại vị trí 209 bp Cũng

tương tự đề tài của Nguyễn Trúc Phương (2008) đã dùng phương pháp PCR

để xác định kết quả dinh danh E ictaluri, cho két quả nhanh và chính xác Đề tài ứng dụng phương pháp PCR dé phat hién A hydrophila nhim kiém tra tính chính xác của kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn A

hydrophila gay ra trên cá tra Nghiên cứu được thực hiện phán ứng PCR bang

2 cách chiết tách mẫu và lấy mẫu từ khuẩn lạc thuần

24

Trang 33

Kết quả phan tng PCR mau DNA chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong môi trường NB sau 18-24 giờ, ở 28-30°C được trình bày ở (hình 4.5) Từ kết quả ở (hình 4.5) cho thấy cả 14 mẫu chiết tách và đối chứng đương đều hiện vạch tại vị trí 209 bp, đối chứng âm không hiện vạch Theo kết quá nghiên cứu của

Panangala et al., (2007) đã ứng dụng phương pháp multiplex-PCR để phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn quan trọng (E icfaluri, Flavobacterium columnare va A hydrophila), cho kết quả phát hiện A hydrophila 6 (209 bp)

1 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 1415 16 M

209 bp

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR cac chung A hydrophila - Giéng M: thang do DNA

- Giéng 1: d6i ching 4m (nuée cat) - _ Giếng 2: đối chứng đương

- 7 giéng DNA được chiết tách từ NB (giếng 3-9)

+ Giéng 3: ching CA (1); Giéng 4: ching SD (1); Giéng 5: chủng

CA (tt); Giéng 6: ching TN (tt); Giéng 7: ching TN (g); Giêng 8:

chung TN (t); Giéng 9: chung SD (tt)

- 7 giếng DNA được chiết tách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (giêng 10-16)

+ Giéng 10: ching CA (1); Giéng 11: chủng SD (0; Giéng 12:

chủng CA (Ð; Giêng 13: chủng TN (1Ð; Giêng 14: chủng TN (g); Giêng 15: ching TN (t); Giéng 16: chủng SD ()

Chứng tỏ có sự hiện diện của A hyẩrophiia và trên tất cả 14 mẫu không có sản

phẩm phụ, tuy nhiên ở giếng số 7, 8, 12, 13 và số 14 mẫu hiện vạch chưa rõ

như các giếng còn lại, có thể do hàm lượng DNA chiết tách không đủ Nồng

Trang 34

có điều kiện nên tiến hành thử giảm các thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR, để có thê tiết kiệm chỉ phí mà vẫn mang lại kết quả tốt

Kết quá PCR mẫu lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của 7 chủng vi khuẩn, không qua

bước chiết tách được trình bày ở (hình 4.6) Qua kết quá ở (hình 4.6) cho thấy cả 7 mẫu đều không hiện vạch ở 209 bp, có thể do mẫu vi khuẩn không qua bước chiết tách DNA nên kết quả điện đi sản phẩm PCR không hiện vạch 1 2 3 4 56 7M 209 bp Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chung A hydrophila Giếng 1: chúng CA (9; Giếng 2: chúng SD (Ð; Giéng 3: ching CA (tt); Giéng 4: ching TN (tt); Giéng 5: ching TN (g); Giéng 6: chung TN (t); Giéng 7: ching SD (tt)

4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phat hién A hydrophila

Để xác định giới hạn thấp nhất hàm lượng DNA của vi khuẩn mà phương

pháp PCR có thê phát hiện được Xác định bởi sự pha loãng của acid nucleic được làm tỉnh sạch Kết quả PCR xác định độ nhạy của phương pháp được thể

hiện qua (hình 4.7)

Dựa vào kết quả ở (hình 4.7) cho thấy chỉ có 3 mẫu cho kết quả là (10, 10” và 10”) đều hiện vạch ở 209 bp, 7 mẫu còn lại có thể do hàm lương DNA quá

Trang 35

lượng DNA thấp nhất cho phản ứng PCR để có thể phát hiện A hydrophila 1a (10? = 1 ng/ul)

M1234 567 89 1011

209 bp

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A ñydrophiia xác định độ nhạy của phương pháp

Giếng M: thang đo DNA

Giếng 1: đối chứng âm (mẫu nước)

Giếng 2: hàm lượng DNA 10°ng/ul (10° = 100 ng/ul)

Giéng 3: 107; Giéng 4: 10°; Giéng 5: 10°; Giéng 6: 10%, Giéng 7: 10°; Giéng 8: 10°; Giéng 9: 10°; Giéng 10: 10°; Giéng 11: 107

4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A bydrophila

Tính đặc hiệu của phương pháp là với các hàm lượng của thành phần hóa chất

tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng thì phương pháp PCR chỉ phát hiện

A hydrophila, không cho kết quả đương tính với các loài vi khuẩn khác Kết

quả được thể hiện ở (hình 4.8) Ở nghiên cứu cua Panangala et al., (2007) da ghi nhận kết quả xác định tính đặc hiệu của phương pháp m-PCR, 10 ching vi khuẩn phân lập trong 3 loài vi khuan (E ictaluri, Flavobacterium columnare va A hydrophiia) thử với 11 chủng gram âm khác và 2 chủng gram dương có

mặt khắp nơi từ môi trường nuôi thủy sản

Hình 4.8 cho thấy với hàm lượng các thành phần hóa chất tham gia và đoạn

mỗi của phan img PCR chi cho phép phát hiện DNA cia A hydrophila khi thir

với 5 loài vi khuẩn khác (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri,

Pseudomonas putida, Eschericchia coli) Két qua chi c6 giéng 2 (d6i ching 27

Trang 36

dwong) 14 mau cé DNA cia A hydrophila hiện vạch ở 209 bp, còn 5 giếng thử

các chủng vi khuẩn khác không hiện vạch Giếng 1 (đối chứng âm) không hiện vạch chứng tỏ kết quả chiết tách DNA không nhiễm tạp

209 bp

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của

phương pháp phát hiện A hydrophila Giéng M: thang do DNA

Giéng 1: đối chứng âm (nước cất)

Giéng 2: đối chứng dương (mẫu DAN cia ching A hydrophila)

Giéng 3: DNA ctia ching Vibrio alginolyticus

Giếng 4:DNA của E ictaluri

Giếng 5: DNA của Eschericchia coli Giếng 6: DNA của Pseudomonas putida

Giếng 7: DNA của Vibrio harveyi

Từ kết quả điện di sản phẩm PCR xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của

phương pháp PCR phat hiện A hydrophila, cho phép phát hiện nhanh và sớm

các mầm bệnh ở dạng tiềm ấn Nên có thé kịp thời xử lý ao nuôi hạn chế rũi ro xây ra Đây sẽ là hướng đi mới trong việc chân đoán bệnh xuất huyết đo A

hydrophila gây ra trên cá tra nuôi Tuy nhiên phương pháp PCR tốn kém và

cần thiết phải có máy móc hiện đại hơn phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E

28

Trang 37

Phương pháp m-PCR là phương pháp đầy hứa hẹn cho việc phát hiện nhanh,

nhạy và phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn (E ictaluri, Flavobacterium

Trang 38

Chương 5

KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT

5.1 Kết luận

Đã thực hiện thành công các phản ứng PCR

1 Có 7 ching A hydrophila được chiết tách acid nucleic (Bartie et al., 2006)

bằng 2 cách: (1) chiết tach tir vi khudn dugc nudi trong NB, (2) chiét tách bằng cách pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lý (0,85% NaCl) Khuéch

dai DNA (Panangala et al., 2007 c6 chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và

ctv, 2008), kết quả PCR khẳng định 14 mẫu DNA (từ 2 cách chiết tách) của 7

chủng vi khuẩn đã được định danh là A hydrophila đều hiện vạch ở 209 bp

Với các thành phần phản ứng PCR: 1X Buffer, 1,5 mM MgCl, 200 »M

dNTPs, 2,5U Taq DNA polymerase, 0,4 1M mdi AeroFd, 0,4 1M mdi

AeroRs, 1 ul DNA khuôn, nước cat Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng 95°C

trong 4 phút; tiếp 30 chu kỳ 95°C trong 30 giây, 60°C trong 45 giây, 72°C trong 30 giây; cuối cùng 72°C trong 10 phút

Kết quả điện đi sản phẩm PCR của 7 mẫu vi khuẩn trên, được lấy trực tiếp từ đĩa NA không hiện vạch Do mẫu vi khuân không qua bước chiết tách DNA, nên kết quả điện đi sản phẩm PCR không hiện vạch

2 PCR xác định độ nhạy của phương pháp, phản ứng PCR từ một chủng A

hydrophila pha loãng ra 10 mẫu với hàm lượng DNA giảm dần cho kết quả

điện đi có 3 mẫu (với hàm lượng DNA 100 ng/ul, 10 ng/ul và 1 ng/ụ]) hiện

vạch ở (209 bp) Vậy hàm lượng DNA thấp nhất có thể phát hiện được là 1 ng/ul mẫu

3 PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp thử phản ứng PCR chủng A hydrophila với các chủng Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictali, Pseudomonas putida, Eschericchia coli Kết quả chỉ có mẫu DNA của A hydrophila hién vach & vi tri 209 bp, còn lại các mẫu không hiện vạch Vậy phương pháp PCR này với các thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mỗi đặc trưng chỉ để phát hiện DNA của A hydrophila

5.2 Đề xuất

- Nên ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện sớm mầm bệnh 4 hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra, để hạn chế rủi ro có thể xảy ra

-_ Thực hiện m-PCR phát hiện đồng thời 2 loại vi khuẩn A hyđrophila (209

bp) va E ictaluri (407 bp)

Trang 39

TAI LIEU THAM KHAO

1 Báo Cần Thơ 2007 Để sản phẩm cá tra Việt Nam luôn được tín nhiệm

http://www.fisteneft.gov.vn/detail.asp (Cập nhật 09/08/2007)

2 Bộ Thủy sản, 2008 Phòng trị một số bệnh thường gặp của cá tra và basa

Cập nhật 7/1 1/2008

3 Bùi Quang Tẻ 2006 Bệnh học thủy sản

4 Đặng Thị Hoàng Oanh 2007 Nguyên lý và Kỹ thuật Chẩn đoán Bệnh

Thủy sản Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ

5 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tẻ, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội

2004 Bệnh Học Thủy Sản NXB nơng nghiệp, 6:218-223

6 Đồn Nhật Phương 2001 Xác đính LDao và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio) Luận văn tốt nghiệp khoa Thủy sản, ĐHCT

7 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học phân tử NXB giáo dục 301 trang

8 Huỳnh Phú Trọng 2008 Xuất khẩu thủy sản chạy đua cán đích 4,25 tỷ

USD http://www.vietlinh.com.vn ( truy cập 22/8/2008)

9, Huynh Thị Phượng Quyên 2008.Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định

nồng độ ức chế tối thiêu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn E, ic/aluri

& A hydrophila tại khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

10.Inglis, V., R J Roberts and N R Bromage 1993 Bacterial Disease Of Eish Institute of Aquaculture 312pp

11.Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen NXB

khoa học và kỹ thuật

12.Lê Minh Đương 2007 So sánh khả năng xâm nhập của hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn tốt

nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

13.Lê Thành Đen 2006 Sử dụng một số hóa chất trị bệnh trùng quả dưa

(Uchthyophthyrius multifiliis) trén cd tra (Pangasius hypophthalmus) giống Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

14.Lê Thị Bé Năm 2002 Xác định tác nhân vi khuân gây bệnh đốm trắng ở

Trang 40

15.Lệ Thu 2008 Tác động của biến đổi khí hậu đối với ĐBSCL Báo Cần

Thơ http://www.cres.edu.vn ( Cập nhật 9/10/2008)

16 Lương Trần Thục Đoan 2006 Khảo sát sự xuất hiện của vi khuẩn gây

bệnh mt gan ( Edwardsiella ictaluri) trén các cơ quan khác nhau của ca tra (Pangasius hypophthamus) Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần

Thơ 51 trang

17 Ngô Minh Dung 2007 nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri va Aeromonas hydrophia trên cá tra(Pangasius

hypophthalmus) Luận văn đại học Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

18 Nguyễn Hà Giang 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila tai khoa thủy sản Luận văn

tốt nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

19 Nguyễn Trúc Phương 2008 Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xác định bằng

phương pháp sinh hóa truyền thống và API 20E Luận văn tốt nghiệp Khoa

Thủy Sản-Đại học Cần Thơ 42 trang

20 Nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam 2007 Một số bệnh thường gặp trên cá tra htp://agriviet.com/news_ detail420-c46-s67-p0-một số bệnh thường gặp trên cá tra.html Cập nhật 1/5/2007

21 Panangala, S.V., C.A Shoemaker, V.L.V Santen, K Dybvig and P.H

Klesius 2007 Multipex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish

pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas

hydrophila Dieases of aquatic organisms, 74: 199-208 (2007)

22.Phạm Đình Đôn 2006 Bảo vệ môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long http://www.vietlinh.com.vn (Cập nhật 26/11/2006)

23.Phạm Thanh Hương 2006 xác định một số yếu tổ huyết học trên cá tra

(Pangasius hypophfhaimus) bệnh vàng da ở tỉnh Cần Thơ Luận văn tốt

nghiệp Khoa Thủy Sản-Đại học Cần Thơ

24, Pham Thi Thu Trang 2005 Ung dung kỹ thuật PCR chuẩn đoán bệnh đốm

trang trén t6m sti (Penaus monodon) va t6m chan trang (Penaus vannamie)

Luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy San-Dai hoc Can Thơ 39 trang

25.Saitatu, K.S., Wongsawang and K Poonsuk 1982 Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J Aquat Animal Dis 3: 79-86 (In Thai) In Asian