ứng dụng phương pháp pcr phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN MAI THỊ LOAN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - i - LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân có phần đóng góp rất lớn của Cha Mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng; Thầy Cô đã có công dạy bảo và tất cả bạn bè luôn bên cạnh tôi giúp đỡ và động viên tôi. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Trúc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Mai Thị Loan PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - ii - TÓM TẮT Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri. Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5µl (40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5µl (2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút. Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2 ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E. ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA polymerase từ 5U/µl xuống còn 3U/µl. Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị trí 407bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - iii - MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii PHẦN I: GIỚI THIỆU 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3 2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4 2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam 4 2.2.1.1 Trên thế giới 4 2.2.1.2 Ở Việt Nam 4 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri 5 2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm 6 2.3 Chiết tách acid nucleic 6 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 7 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian và địa điểm 13 3.2 Dụng cụ và hoa chất 13 3.2.1 Dụng cụ 13 3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn 13 3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR 13 3.2.2 Hóa chất 14 3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn 14 3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - iv - 3.3.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 3.3.1.1 Chuẩn bị hệ thống bể 15 3.3.1.2 Cá thí nghiệm 15 3.3.1.3 Vi khuẩn gây cảm nhiễm 15 3.3.1.4 Bố trí thí nghiệm 16 3.3.2 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 17 3.3.3 Phương pháp PCR 19 3.3.3.1 Vật liệu cho phản ứng PCR 19 3.3.3.2 Chiết tách acid nucleic: phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 19 3.3.3.3 Thí nghiệm xác định độ nhạy 20 3.3.3.2.1 Chiết tách acid nuleic (Bartie và ctv, 2006) 20 3.3.3.2.2 Khuếch đại ADN: (Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) 21 3.3.3.2.3 Điện di 22 3.3.3.4 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu 22 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết quả phân tích vi sinh 24 4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý 24 4.1.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 24 4.2 Kết quả chuẩn hóa qui trình chiết tách acid nucleic – phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) (chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh)25 4.2.1 Thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 25 4.2.2 Tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26 4.2.3 Điều chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase 27 4.2.4 Tối ưu qui trình chiết tách với hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút. 27 4.3 Kết quả chuẩn hóa phương pháp PCR 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - v - 4.3.1 Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy 28 4.3.2 Kết quả xác định tính đặc hiệu 30 4.3.3 Kết quả chuẩn hóa qui trình khuếch đại phát hiện E. ictaluri (Panangala và ctv, 2007) 31 4.4 Kết quả phản ứng PCR 33 4.4.1 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện qui trình chiết tách acid nucleic bằng phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992) 33 4.4.2 Kết quả phản ứng PCR với ADN mẫu thực hiện bằng qui trình chiết tách được tối ưu 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - vi - DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng PCR 20 Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa 25 Bảng 4.2 Hàm lượng DNA chiết tách (theo Taggart et al., 1992) 25 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), tăng hàm lượng Proteinase K, giảm thời gian ủ bước 1 26 Bảng 4.4 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), chỉnh hàm lượng Proteinase K, thời gian ủ và hàm lượng RNase 27 Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách theo phương pháp Phenol chloroform (Taggart et al, 1992), hàm lượng Proteinase K 2.5µl, thời gian ủ bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase 2.5µl, thời gian ủ bước 2 là 30 phút 28 Bảng 4.6 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 5U/µl) 31 Bảng 4.7 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 4U/µl) 31 Bảng 4.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR (hàm lượng Tag DNA polymerase 3U/µl) 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - vii - DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 24 Hình 4.2 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ thận 29 Hình 4.3 Kết quả điện di thí nghiệm xác định độ nhạy với ADN chiết tách từ vi khuẩn 29 Hình 4.4 Kết quả điện di thí nghiệm xác định tính đặc hiệu. 30 Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra hiệu quả của các hàm lượng Tag DNA polymerase khác nhau 32 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR phát hiện E. ictaluri, qui trình chiết tách acid nucleic theo phương pháp Phenol-chloroform (Taggart et al, 1992) 33 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR, chuẩn hóa qui trình chiết tách lần 1 34 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với qui trình tối ưu 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - 1 - PHẦN I GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đang phát triển không ngừng mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nước nhà đặc biệt là cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon. Cá tra được nuôi nhiều ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ với nhiều mô hình khác nhau cả trong lồng bè, ao đất. Mặc dù năm 2008 ngành thủy sản nước ta gặp nhiều khó khăn nhưng giá trị xuất khẩu vẫn không ngừng gia tăng. Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đã đạt 4 tỷ USD. 10 tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30% về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007. Trong đó, cá tra, basa chiếm 32,4%, với 550.070 tấn, đạt mức tăng trưởng cao nhất, tăng 74,5% về lượng và 53,3% về giá trị so với cùng kỳ (http://www.fistenet.gov.vn/). Để có sản lượng cao như thế, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng người nuôi còn tăng cả mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết và một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL gồm đốm trắng trên gan, thận (52,80%), xuất huyết (42,50%), phù mắt (20,70%) và vàng da (21,60%). Như vậy tần số xuất hiện của bệnh đốm trắng nội tạng là cao nhất (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv, 2001) và trở nên trầm trọng vào 1999. Bệnh xuất hiện suốt chu kỳ nuôi, thường vào mùa lũ và cao điểm là vào tháng 7 và 8. Cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, tuy nhiên đa số cá bệnh không có những biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi, trong giai đoạn này nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và môi trường nuôi quá bẩn bệnh sẽ trở nên trầm trọng và rất khó khăn trong việc điều trị. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung, 2004). Từ thực tế tình hình dịch bệnh đòi hỏi phải có một phương pháp giúp sớm tìm ra tác nhân gây bệnh từ đó có hướng xử lý và điều trị kịp thời. Hiện nay PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E ictaluri nhanh, nhạy làm cơ sở cho việc điều trị có hiệu quả sau này Mục tiêu Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E ictaluri từ mô cá bệnh Nội dung 1 Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh 2 Tối ưu phương pháp PCR phát hiện E ictaluri 3 Xác định độ nhạy và tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện E ictaluri. .. lần so với phương pháp định danh truyền thống Tuy nhiên phương pháp này vẫn phải trải qua một bước nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp để được chủng vi khuẩn thuần Nếu phương pháp này được thực hiện trực tiếp từ mô cá bệnh thì thời gian chẩn đoán sẽ được rút ngắn hơn nữa (chỉ mất khoảng 1 ngày) Do đó đề tài Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh được.. .phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API20E Tuy nhiên cả 2 phương pháp này cho kết quả chậm, mất nhiều thời gian nên chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán bệnh trong tình hình hiện nay Gần đây Nguyễn Trúc Phương (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán nhanh vi khuẩn E .ictaluri, thời... được thực hiện với DNA chiết tách từ vi khuẩn đã được cấy trên môi trường tổng hợp sau đó được nuôi tăng sinh trong môi trường NB (Nutrient broth) và DNA chiết tách trực tiếp từ thận cá Thí nghiệm 1: DNA của các chủng vi khuẩn đã được chiết tách từ thận cá được pha loãng 10 lần, nồng độ từ 100 đến 10-9 với 100 là 500ng/µl Thực hiện phản ứng PCR để tìm ra nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được E ictaluri. .. và dụng cụ khuếch đại riêng Ứng dụng của phương pháp PCR Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm: virus đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng... đã ứng dụng và tối ưu hóa qui trình PCRgenotyping với các thay đổi về thành phần hóa chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt của phản ứng thu được qui trình tối ưu phát hiện tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú Lê Hữu Thôi (2008) thực hiện qui trình mRT -PCR phát hiện đồng thời YHV, GAV và β-actin YHV và GAV là hai bệnh do virus trên tôm sú gây thiệt hại nặng đến nghề nuôi tôm của nước ta Phương pháp. .. nhiễm bệnh (Thạch Thảo, 2008) Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh xuất hiện từ cuối 1998 và trở nên trầm trọng vào 1999 Ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ Tuy nhiên bệnh bộc phát cao điểm vào tháng 7 và 8 Bệnh đốm trắng trên gan xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá giống và cá thịt, ở cả cá nuôi ao và nuôi bè 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E ictaluri Vi khuẩn E ictaluri. .. 97% mẫu cá bệnh đều có dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng với sự hiện diện của vi khuẩn E ictaluri Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm ngược, vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ các mẫu cá bệnh Kết quả nghiên cứu đã xác định, vi khuẩn E ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên gan, thận và lách cá tra Kết quả thí nghiệm cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí... phẩm PCR cho hiện vạch ở vị trí 1441 bp (WSSV) và 216 bp (β-actin) ở bước 1 và 941 bp (WSSV), 441 bp (HPV), 216 bp (β-actin) ở bước 2 Victor và ctv (2007) phát triển phương pháp m -PCR phát hiện cùng lúc ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá : Flavobacterium Columnare (504bp), E Ictaluri (407bp), Aeromonas Hydrophyla (209bp) Gần đây nhất, Nguyễn Trúc Phương (2008) đã định danh E ictaluri bằng phương pháp. .. chứng của bệnh Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng Khi giải phẩu để tránh các tạp khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân lập vi khuẩn Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn và để nguội trước khi lấy mẫu ở các cơ quan Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá Phương pháp xác . tài Phát triển phương pháp PCR phát hiện Edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri từ mô cá bệnh Nội dung 1. Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô cá bệnh