ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RTLAMP PHÁT HIỆN VIRÚT PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC HIHI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP PHÁT HIỆN VI-RÚT PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐINH QUỐC THƯỢNG Niên khóa : 2007 - 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC HIHI KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP PHÁT HIỆN VI-RÚT PRRS (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI ĐINH QUỐC THƯỢNG KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải KS Võ Khánh Hưng hết lòng hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn: ¾ Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, tất quý thầy cô dạy kiến thức hay tác phong làm việc tốt cho tơi suốt năm học ¾ Tập thể cán quý Thầy - Cô viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực tập ¾ Cô chủ nhiệm Biện Thị Lan Thanh cô Lê Hồng Thủy Tiên cung cấp thông tin suốt q trình thực tập tơi Tơi xin gửi lời cảm ơn đến: ¾ Anh Nguyễn Phan Thành chị Ngô Thị Tú Trinh hỗ trợ tạo điều kiện cho tơi q trình thực tập phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh ¾ Các bạn nhóm nghiên cứu chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực đề tài ¾ Tập thể lớp DH07SH học tập suốt năm học qua Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình anh trai em yêu thương, quan tâm, động viên tạo điều kiện để học tập, nghiên cứu Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 07, năm 2011 Đinh Quốc Thượng i TÓM TẮT Bệnh rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) vi-rút PRRS gây bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế lớn Tại Việt Nam, việc chẩn đoán phương pháp tốn nhiều thời gian, chi phí khơng đáp ứng nhu cầu phịng chống bệnh Gần phương pháp RT-LAMP với ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian lẫn chi phí so với kỹ thuật gene khác ứng dụng giới chẩn đốn bệnh Do đó, việc triển khai kỹ thuật đơn giản để chẩn đoán bệnh nguy hiểm heo quan trọng cần thiết ngành chăn ni heo Mục đích đề tài nhằm chuẩn hóa quy trình kỹ thuật RT-LAMP, xác định tính đặc hiệu độ nhạy phương pháp RT-LAMP chẩn đoán vi-rút PRRS để đưa phương pháp vào thực tế chẩn đoán bệnh PRRS heo Những kết đạt sau thời gian nghiên cứu: Thực phản ứng RT-LAMP với primer theo nghiên cứu Chen Qin (2007) chẩn đoán vi-rút PRRS từ mẫu vi-rút vaccine PRRS đặc hiệu cho hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Phương pháp RT-LAMP có độ nhạy cao với ngưỡng phát 10-1 copies/µl Ngưỡng nhạy phương pháp RT-PCR 100 lần (RT-PCR có ngưỡng phát 101 copies/µl Khảo sát mẫu vi-rút PRRS thực địa, phương pháp RT-LAMP cho kết nhạy RT-PCR phát 19/23 mẫu dương tính (so với 18/23) ii   SUMMARY Recently, the Vietnamese pig livestock industry has been influenced by infection diseases Especially, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) which caused by PRRS virus is detrimental for economy There are some current methods are expensive and spend long times for reactions RT-LAMP is quicker, more economic and simple than previous methods Therefore, the study “Using RT-LAMP method for detecting PRRS virus” was carried out to help control PRRS more efficiently The thesis indicated the optimum condition for RT-LAMP reactions, confirmed the specificity and sensibility of RT-LAMP in PRRS virus detection These results were achieved: RT-LAMP detected PRRS virus in serums that were positive in RT-PCR The optimum temperature was 650C in 40 minutes RT-LAMP with primer set based on research of Chen Qin et al (2007) is specific for PRRS RT-LAMP could detect both strains of PRRS virus (European and North American PRRS virus strains) The sensibility of RT-LAMP method was very high The limit range of the detection was 10-1 copies/µl The RT-LAMP was as much higher sensible 100 times as RT-PCR (the limit range of detection was 101 copies/µl) RT-LAMP was sensible as much as RT-PCR in detection PRRS virus RTLAMP detected 19/23 possitive samples while 18/23 were positive with RT-PCR Key words: RT-LAMP method, PRRS virus detection iii   MỤC LỤC                               Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích-yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) 2.2 Vi-rút PRRS: đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại 2.2.1 Đặc điểm hình thái vi-rút PRRS 2.2.2 Tổ chức gene vi-rút PRRS 2.2.3 Chủng loại phân bố vi-rút PRRS 2.3 Một số phương pháp chẩn đoán vi-rút PRRS 2.4 Phương pháp RT-LAMP 2.4.1 Khái niệm phương pháp RT-LAMP 2.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP 2.4.3 Thiết kế primer RT-LAMP phát vi-rút PRRS 2.4.4.Nguyên tắc hoạt động phản ứng RT-LAMP 2.4.5 Sản phẩm tính đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 11 2.4.6 Nhận biết kết phản ứng RT-LAMP 11 2.5 Một số nghiên cứu liên quan 11 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 iv   2.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm 14 3.2 Nội dung nghiên cứu 14 3.3 Vật liệu hóa chất 14 3.3.1 Vật liệu 14 3.3.2 Hóa chất 14 3.4 Phương pháp tiến hành 16 3.4.1 Thu nhận mẫu 16 3.4.2 Ly trích RNA vi-rút 16 3.4.3 Thực phản ứng RT-PCR 17 3.4.4 Thực phản ứng RT-LAMP mẫu vi-rút vaccine PRRS 19 3.4.4.1 Thực phản ứng RT-LAMP 19 3.4.4.2 Điện di sản phẩm RT-LAMP 21 3.4.4.3.Sản phẩm phản ứng RT-LAMP với thuốc thử SYBR Green 21 3.4.5 Xác định độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp RT-LAMP 21 3.4.5.1 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 21 3.4.5.2 Xác định độ nhạy phương pháp RT-LAMP so sánh với RT-PCR 23 3.4.6 Khảo sát phương pháp RT-LAMP mẫu vi-rút PRRS thực địa 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Xác định mẫu vaccine nhiễm vi-rút PRRS RT-PCR 26 4.2 Thực phản ứng RT-LAMP với mẫu vi-rút vaccine PRRS 27 4.3 Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 29 4.4 Xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP 32 4.5 Khảo sát phương pháp RT-LAMP mẫu vi-rút PRRS thực địa 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC v   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5’NTR AMV BIP cDNA Ctv DNA ELISA EU F primer FA FIP FMDV GP IFA kD M protein N protein Nsp ORF PCR PCV PPV PRRS PRRSV PRV R primer RNA RT-LAMP RT-PCR SFV TGEV Tp.HCM US UTR : 5’Nontranslated Region : Avian Myeloblastosis Virus : Backward Inner Primer : complementary Deoxyribonucleotide Acid : cộng tác viên : Deoxyribonucleotide Acid : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay : European (Châu Âu) : Forward primer : Fluorescent Antibody Staining : Forward Inner Primer : Foot Mouth Disease Virus : Glycoprotein : Indirect Immunoflourescence Assay : kilo Dalton : Membrain protein : Nuclecapside protein : non-structural protein : Open Reading Frame : Polymerase Chain Reaction : Porcine Circovirus : Porcine Parvovirus : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus : Pseudorabies Virus : Reverse Primer : Ribonucleotide acid : Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction : Swine Flu Virus : Replication of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus : thành phố Hồ Chí Minh : United States (châu Mỹ) : Untranslate Region UV : UltraViolet vi   DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Vai trò protein cấu trúc vi-rút PRRS Bảng 2.2 Tỷ lệ tương đồng trình tự gene dịng vi-rút PRRS Bảng 3.1 Thành phần nồng độ hóa chất phản ứng RT-PCR 18 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR đoạn ORF7 18 Bảng 3.3 Thành phần nồng độ phản ứng RT-LAMP 20 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme HeaIII 22 Bảng 3.5 Trình tự nucleotide cặp primer dùng cho phản ứng RT-PCR 24 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng RT-PCR theo kit QIAGEN OneStep RT-PCR 24 Bảng 3.7 Quy trình nhiệt theo kit QIAGEN OneStep RT-PCR 24 Bảng 4.1 Kết phát RNA vi-rút PRRS RT-PCR với primer ORF7 35 Bảng 4.2 Kết khảo sát mẫu vi-rút PRRS thực địa RT-LAMP 35   vii   DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Cấu trúc vi-rút PRRS Hình 2.2 Tổ chức gene vi-rút PRRS Hình 2.3 Sơ đồ phân bố vi-rút PRRS giới Hình 2.4 Primer phương pháp RT-LAMP Hình 2.5 Nguyên tắc hoạt động phản ứng RT-LAMP 10 Hình 2.6 Sản phẩm RT-LAMP 11 Hình 3.1 Trình tự ORF6 vi-rút PRRS 19 Hình 3.2 Vị trí cắt enzyme HeaIII ORF6 22 Hình 4.1 Kết phản ứng RT-PCR realtime RT-PCR 26 Hình 4.2 Kết thực phản ứng RT-LAMP 28 Hình 4.3 Tính đặc hiệu phương pháp RT-LAMP 29 Hình 4.4 Kết align trình tự acid amin dịch mã ORF6 30 Hình 4.5 Vị trí cắt enzyme ORF6 hai vaccine 32 Hình 4.6 Vị trí cắt enzyme HeaIII vi-rút PRRS 32 Hình 4.7 Độ nhạy phản ứng RT-LAMP 33 Hình 4.8 Độ nhạy phản ứng RT-PCR 34  viii   Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.1 Xác định mẫu vi-rút PRRS với RT-PCR làm nguyên liệu cho nghiên cứu Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với cặp primer thiết kế vùng gene ORF7 vi-rút PRRS (Martínez E ctv, 2007) để kiểm tra ly trích RNA từ hai mẫu vi-rút vaccine PRRS với thành phần bảng 3.1 chu trình nhiệt bảng 3.2 Kết xác định mẫu nhiễm vi-rút PRRS chủng châu Âu Bắc Mỹ ly trích từ mẫu vaccine Amervac Ingelvac (hình 4.1A) Kết định lượng mẫu vaccine Amervac (do hãng Hipra-Tây Ban Nha sản xuất) phương pháp realtime RT-PCR sử dụng EvaGreen với cặp primer Martínez E ctv (2007) xác định mẫu vaccine có nồng độ ban đầu 107 copies/µl (hình 4.1B) 500bp A B Hình 4.1 Kết phản ứng RT-PCR realtime RT-PCR với primer thiết kế khung đọc mở ORF7 A: kết phản ứng RT-PCR; B: kết phản ứng định lượng realtime RTPCR.Am (mẫu vaccine Amervac), In (mẫu vaccine Ingelvac), lad: thang DNA chuẩn Hình 4.1A cho thấy, điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với mẫu vaccine Amervac Ingelvac xuất band có kích thước tương ứng 300 bp Kết phù hợp với kết Martínez E (2007) Các mẫu vaccine Amervac (hãng Hipra-Tây Ban Nha sản xuất) Ingelvac (do hãng Boehringer Ingelheim Vet - Đức sản xuất) chứa vi-rút PRRS dòng châu Âu Bắc Mỹ biết rõ nguồn gốc trình tự genome nên nguồn nguyên liệu tốt cho nghiên cứu 26   Kết định lượng mẫu vaccine Amervac xác tin cậy phương pháp realtime RT-PCR sử dụng EvaGreen (một loại thuốc nhuộm huỳnh quang dạng hoạt động có khả liên kết với mạch đôi DNA phát huỳnh quang màu xanh λ = 520 nm nhận ánh sáng kích thích thích hợp) với đường chuẩn có hệ số tương quan R = 0,990 CV = 2% (nhỏ 10%) Mẫu vaccine nguyên liệu thí nghiệm xác định độ nhạy phương pháp RT-LAMP Như vậy, việc ly trích RNA vi-rút PRRS từ mẫu vaccine Amervac Ingelvac kit ly trích QIAamp Viral RNA Mini Kit hiệu thu nhận RNA vi-rút PRRS Phản ứng RT-PCR với cặp primer khung đọc mở ORF7 (Martínez E ctv, 2007) xác định mẫu chứa vi-rút PRRS dòng châu Âu Bắc Mỹ làm nguyên liệu cho nghiên cứu 4.2 Thực phản ứng RT-LAMP với mẫu vi-rút vaccine PRRS Các mẫu vi-rút vaccine PRRS (vaccine Amervac chứa vi-rút PRRS dòng châu Âu vaccine Ingelvac chứa chủng Băc Mỹ) đưa vào thực phản ứng RTLAMP Phản ứng RT-LAMP với primer sử dụng (Chen Qin ctv, 2007) thực với đầy đủ thành phần phản ứng, nhiệt độ 650C 40 phút Kết điện di sản phẩm RT-LAMP với kết quan sát đổi màu thuốc nhuộm SYBR Green thêm vào dung dịch sau phản ứng RT-LAMP cho thấy phản ứng RT-LAMP xảy Trên gel điện di, sản phẩm phản ứng RT-LAMP cho tập hợp gồm nhiều band DNA có kích thước khác Và màu thuốc nhuộm SYBR Green chuyển từ cam sang xanh sản phẩm phản ứng RT-LAMP với hai mẫu vi-rút vaccine PRRS (hình 4.1) Phản ứng RT-LAMP với primer Chen Qin (2007) có khả phát hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ có sản phẩm phản ứng RTLAMP với hai mẫu vaccine Amervac Ingelvac Như vậy, phản ứng RT-LAMP có khả tương tự phản ứng RT-PCR chẩn đoán vi-rút PRRS Tuy nhiên phản ứng RT-LAMP thực thời gian ngằn không cần sử dụng đến thiết bị đại máy nhiệt phản ứng PCR Đồng thời, việc sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green để đọc kết phản ứng RT-LAMP đơn giản tiết kiệm so với cách điện di PCR Điều cho thấy khả ứng dụng thực RT-LAMP cao 27   3000bp B A B Hình 4.2 Kết thực phản ứng RT-LAMP (A) sản phẩm phản ứng RT-LAMP gel điện di; (B) sản phẩm phản ứng RT-LAMP với thuốc thử SYBR Green; US: mẫu dương tính với vi-rút PRRS dịng Bắc Mỹ (vaccine Ingelvac); EU: mẫu dương tính với vi-rút PRRS dịng châu Âu (vaccine Amervac); (-): đối chứng âm; lad: thang DNA chuẩn Hình 4.2A cho thấy, với mẫu vi-rút vaccine PRRS, gel xuất band DNA với hình ảnh đặc trưng cho phản ứng RT-LAMP Đó band DNA với nhiều đoạn DNA có kích thước khác tạo thành dải DNA có độ sáng tăng dần kích thước đoạn DNA lớn Điều chứng tỏ primer hoạt động tốt bắt cặp vào vị trí mong muốn Hai primer inner (FIB BIP) bổ sung vào vị trí F2 B2 vùng gene ORF6 vi-rút PRRS Hai primer outer (F3 B3) tách sợi cDNA tổng hợp từ primer inner để tạo sợi DNA có cấu trúc vịng vị trí F2 - F2c B2 - B2c (F2, F3, B2, B3 vùng gene ORF6 vi-rút PRRS dùng để thiết kế primer) Khi quan sát kết phản ứng RT-LAMP mắt thường với thuốc thử SYBR Green, với hai mẫu vaccine màu thuốc thử chuyển từ cam sang xanh (hình 4.2B) Điều cho thấy, phản ứng RT-LAMP khuếch đại gene vi-rút PRRS tạo lượng lớn DNA mạch đôi Các sợi DNA mạch đôi kết hợp với thuốc nhuộm làm thuốc nhuộm chuyển màu từ cam sang xanh Phương pháp RT-LAMP có ưu hẳn so với phương pháp RT-PCR thời gian thực phản ứng RT-LAMP thực đơn giản nhanh chóng (khoảng – kể thời gian ly trích RNA), với chi phí thấp so với phương pháp RT-PCR Phương pháp RT-LAMP đáp ứng yêu cầu phương pháp xét nghiệm nhu cầu chẩn đoán bệnh kỹ thuật gene ngày tăng 28   4.3 Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Tính đặc hiệu phương pháp RT-LAMP kiểm tra với nhiều loại mẫu RNA DNA khác nhau: RNA vi-rút PRRS dòng châu Âu (vaccine Amervac hãng Hipra-Tây Ban Nha sản xuất), dòng Bắc Mỹ (vaccine Ingelvac hãng Boehringer Ingelheim Vet-Đức sản xuất); DNA ly trích từ máu heo âm tính với vi-rút PRRS; DNA PCV âm tính với vi-rút PRRS; đối chứng âm1: RNase free water thay RNA mẫu; đối chứng âm 2: RNA vi-rút ly trích từ vaccine Amervac thành phần phản ứng (bảng 3.3) đặt nhiệt độ phòng (25 - 300C) Kết cho thấy phản ứng RTLAMP với primer theo Chen Qin (2007) xảy nhiệt độ 650C với mẫu nhiễm vi-rút PRRS cịn mẫu cịn lại khơng có phản ứng (hình 4.3A) 3000bp 500pb A B 116bp 67bp Hình 4.3 Tính đặc hiệu phương pháp RT-LAMP A: sản phẩm phản ứng RTLAMP gel điện di; B: sản phẩm phản ứng RT-LAMP trước sau cắt với enzyme HeaIII; US: mẫu nhiễm vi-rút PRRS dòng Bắc Mỹ; EU: mẫu nhiễm vi-rút PRRS dòng châu Âu; DNA: mẫu DNA ly trích từ máu heo âm tính với vi-rút PRRS; P(+): mẫu dương tính với PCV;USBD, USAD: sản phẩm phản ứng RT-LAMP dòng châu Âu trước sau phản ứng cắt enzyme; EUBD, EUAD: sản phẩm phản ứng RT-LAMP dòng Bắc Mỹ trước sau phản ứng cắt enzyme; Lad: thang DNA chuẩn;(-): đối chứng âm (RNase free water thay RNA mẫu);(-)1: đối chứng âm (RNase free water thay RNA mẫu); (-)2: đối chứng âm (mẫu RNA vi-rút PRRS (vaccine Amervac)) đặt nhiệt độ phòng 25 - 300C) Hình 4.3A cho thấy, gel điện di xuất band DNA phản ứng RT-LAMP với primer Chen Qin (2007) cho kết dương tính với mẫu nhiễm vi-rút PRRS kiểu gene châu Âu Bắc Mỹ (vaccine Amervac Ingelvac) Ở giếng số đối chứng âm (RNA vi-rút PRRS ly trích từ vaccine Amervac đầy đủ thành phần phản ứng bảng 3.3 đặt nhiệt độ phịng 25 - 300C) khơng cho band DNA Điều chứng tỏ phản ứng RT-LAMP xảy nhiệt độ thích hợp 650C 29   band DNA với nhiều kích thước khác (giếng 3) gel điện di (hình 4.3A) xuất phản ứng RT-LAMP cho kết dương tính với vi-rút PRRS Qua cho thấy, phản ứng RT-LAMP với primer đặc hiệu hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Phản ứng RT-LAMP có khả phát dịng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Vì primer thiết kế khung đọc mở ORF6 vùng gene bảo tồn vi-rút PRRS Khi align trình tự acid amin dịch mã vùng gene ORF6 hai dịng vi-rút PRRS vaccine (Amervac Ingelvac) cơng cụ ClustalW2 cho thấy có tương đồng đến 98% mặt di truyền hai dòng vi-rút PRRS (hình 4.4) Hình 4.4 Kết align trình tự acid amin dịch mã ORF6 vi-rút PRRS vaccine Amervac Ingelvac công cụ ClustalW2 Các dấu * tương đồng Kết align trình tự amino acid dịch mã từ hai khung đọc mở ORF6 hai dòng vi-rút PRRS vaccine Amervac (vi-rút PRRS chủng châu Âu hãng HipraTây Ban Nha sản xuất) Ingelvac (vi-rút PRRS dòng Bắc Mỹ hãng Boehringer Ingelheim Vet-Đức sản xuất) phần mềm Clustalw2 cho thấy, hai dịng vi-rút có tương đồng lớn mặt di truyền khung đọc mở ORF6 - vùng gene mã hóa cho protein màng (M protein) Trình tự gene vùng bảo tồn vi-rút PRRS, có biến đổi di truyền dịng vi-rút PRRS giới Kết phù hợp với nghiên cứu Chen Qin (2007) tác giả báo cáo có tương đồng đến 96% ORF6 32 dòng vi-rút PRRS phân lập nhiều nơi giới Do đó, phản ứng RT-LAMP với primer Chen Qin ctv (2007) cho kết dương tính với hai mẫu vaccine hồn tồn phù hợp Tính đặc hiệu phản ứng RT-LAMP với primer theo Chen Qin (2007) với virút PRRS khẳng định phản ứng sản phẩm RT-LAMP với enzyme cắt giới hạn HeaIII Kết thể qua điện di gel (hình 4.3B) Vị trí cắt enzyme HeaIII vùng gene ORF6 hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ 30   giống vị trí cặp base thứ 90 107 (hình 4.5) Sản phẩm phản ứng RTLAMP cắt enzyme HeaIII cho đoạn DNA có kích thước tương ứng 67 bp 116 bp Như vậy, nhận thấy phản ứng RT-LAMP với primer xảy đặc hiệu cho hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Hình 4.5 Vị trí cắt enzyme vùng gene ORF6 vi-rút PRRS vaccine Amervac Ingelvac HeaIII: vị trí cắt enzyme HeaIII Sản phẩm phản ứng RT-LAMP đoạn DNA có kích thước khác chúng lặp lại trình tự vùng gene ORF6 Do đó, cắt sản phẩm phản ứng RT-LAMP với enzyme cắt cho đoạn DNA có kích thước xác định Trên vùng gene ORF6 vi-rút PRRS, enzyme HeaIII có hai vị trí cắt cặp base thứ 90 107 nằm vùng gene F1 - B1 (vùng tơ màu vàng-hình 4.6) Trình tự gene F1 - B1 nằm vùng gene dùng thiết kế primer Vùng gene F1 - B1 vi-rút PRRS khuếch đại phản ứng RT-LAMP nhờ primer Khi cắt sản phẩm phản ứng RT-LAMP enzyme HeaIII cho đoạn DNA có kích thước 17 bp, 49 bp, 67 bp 116 bp Tuy nhiên gel điện di cho thấy có band 67 bp 116 bp Lý band 17 bp nhỏ nên chạy khỏi gel, band 49 bp 67 bp chênh lệch 18 nucleotide nên không tách rõ gel Điều chứng minh enzyme HeaIII cắt vào vùng F1 - B1 Từ cho thấy phản ứng RT-LAMP với primer xảy khuếch đại vùng gene F1 - B1 ORF6 vi-rút PRRS 31   Hình 4.6 Vị trí cắt enzyme HeaIII vùng gene ORF6 vi-rút PRRS B1, B2, B3, F1, F2, F3: vị trí vùng gene dùng thiết kế primer; HeaIII: vị trí cắt enzyme HeaIII, vùng tô màu vàng vùng gene vi-rút PRRS Phản ứng RT-LAMP xảy nhiệt độ tối ưu 650C primer dùng phản ứng RT-LAMP theo Chen Qin ctv (2007) đặc hiệu với hai dòng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Kết cho thấy phương pháp RT-LAMP với primer sử dụng có khả ứng dụng để chẩn đoán vi-rút PRRS Phương pháp RT-LAMP thực đơn giản, hữu ích quy mơ lớn nơi khơng có điều kiện thực kỹ thuật phức tạp, đắt tiền RT-PCR 4.4 Xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP Thí nghiệm xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP tiến hành dung dịch RNA vi-rút PRRS có nồng độ 10-3, 10-2, 10-1, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 107 copies/µl Các dung dịch pha loãng theo thang bậc 10 từ mẫu vaccine Amervac (nồng độ 107 copies/µl) định lượng phương pháp realtime RTPCR sử dụng thuốc nhuộm EvaGreen (Biorad sản xuất) Ngưỡng phát phản ứng xác định cách đọc kết phản ứng: điện di gel agarose 1,75% cho thấy ngưỡng phát thực 10-1 copies/µl; quan sát mắt thường với thuốc nhuộm SYBR Green, mẫu có nồng độ 102 copies/µl thuốc thử khơng cịn chuyển màu rõ ràng; quan sát đèn UV với thuốc nhuộm SYBR Green cho thấy, ngưỡng phát phản ứng RT-LAMP 10-1 copies/µl (hình 4.7) 32   A B C Hình 4.7 Độ nhạy phản ứng RT-LAMP A: điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP; BD sản phẩm phản ứng RT-LAMP với thuốc thử SYBR Green; C: sản phẩm phản ứng RT-LAMP với thuốc thử SYBR Green đèn UV 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 10-1,10-2, 10-3: mẫu vaccine Amervac với nồng độ từ 107 - 10-3 (copies/µl); (-): đối chứng âm Hình 4.7A cho thấy, với cách điện di, ngưỡng phát phản ứng RT-LAMP 10-1 copies/µl Kỹ thuật điện di cho phép xác định phản ứng RT-LAMP có tạo đoạn DNA mạch đôi từ khuôn mẫu RNA ban đầu hay không Thuốc nhuộm ethidium bromide sử dụng điện di liên kết với mạch đôi DNA nên kết điện di cho biết xác kết phản ứng RT-LAMP Do đó, đọc kết phản ứng RTLAMP điện di xác tin cậy, cho biết ngưỡng phát thực phản ứng RT-LAMP 10-1 copies/µl Đọc kết phản ứng mắt thường với thuốc nhuộm SYBR Green, mẫu có nồng độ 102 copies/µl khơng cịn làm thuốc nhuộm đổi màu (hình 4.7B) Hay nói ngưỡng phát RT-LAMP với cách đọc 102 copies/µl Ngưỡng phát khơng xác ngưỡng thực 10-1 copies/µl Có sai lệch 33   nồng độ thấp, phản ứng RT-LAMP tạo lượng nhỏ DNA mạch đôi Lượng DNA liên kết thuốc nhuộm nên khó quan sát xác mắt thường điều kiện mơi trường có mật độ tia UV thấp Với cách đọc kết phản ứng đèn UV sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green, ngưỡng phát phương pháp RT-LAM P 10-1 copies/µl (hình 4.7B) Kết xác phù hợp với kết điện di Phản ứng RT-LAMP tạo DNA mạch đôi liên kết với thuốc nhuộm SYBR Green Khi đặt mơi trường có mật độ tia UV cao, giúp tăng cường kích thích phần tử thuốc nhuộm liên kết với mạch đôi DNA phát huỳnh quang Do đó, kết đọc xác với phản ứng nồng độ RNA vi-rút thấp Khi so sánh độ nhạy phương pháp RT-LAMP RT-PCR, kết điện di cho thấy phương pháp RT-PCR có độ nhạy phương pháp RT-LAMP 100 lần ngưỡng phát phương pháp RT-PCR 101 copies/µl (hình 4.8) Kết phù hợp với nghiên cứu Chen Qin (2007) 500bp Hình 4.8 Độ nhạy phản ứng RT-PCR 100 - 107: mẫu có nồng độ từ 100 - 107 copies/µl; lad: thang DNA chuẩn 100 pb Như vậy, ngưỡng phát phản ứng RT-LAMP 10-1 copies/µl Đọc kết phản ứng đèn UV với thuốc nhuộm SYBR Green cho kết xác so với quan sát mắt thường Thêm vào đó, cách đọc thực đơn giản, nhanh chóng tiết kiệm so với cách điện di Do đó, đọc kết phản ứng RTLAMP đèn UV khuyến cáo Phương pháp RT-LAMP có độ nhạy cao phương pháp RT-PCR 100 lần Điều cho thấy, sử dụng phương pháp RTLAMP với primer Chen Qin (2007) để chẩn đoán vi-rút PRRS thay cho phương pháp RT-PCR 34   4.5 Khảo sát phương pháp RT-LAMP mẫu vi-rút PRRS thực địa Tiến hành thực phản ứng RT-LAMP 23 mẫu vi-rút PRRS thực địa thu thập tỉnh Đồng Nai, Bình Dương Tp.HCM xét nghiệm phương pháp RT-PCR Trong có 18/23 (78%) mẫu xác định nhiễm vi-rút PRRS (bảng 4.1) Bảng 4.1 Kết phát RNA vi-rút PRRS phương pháp RT-PCR với cặp primer thiết kế ORF7 Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Dương tính 18 78 Âm tính Tổng 23 22 100 Kiểm tra lại phản ứng RT-LAMP 18 mẫu nhiễm vi-rút PRRS xét nghiệm phương pháp RT-PCR Kết phương pháp RT-LAMP xác định tất 18 mẫu dương tính với vi-rút PRRS Đồng thời, kiểm tra lại mẫu âm tính với virút PRRS phản ứng RT-LAMP cho kết 1/5 mẫu nhiễm vi-rút PRRS Như phản ứng RT-LAMP xác định 19/23 (83%) mẫu dương tính với vi-rút PRRS (bảng 4.2) Bảng 4.2 Kết khảo sát mẫu thực địa RT-LAMP Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Dương tính 19 83 Âm tính 17 Tổng 23 100 Từ số liệu bảng 4.1 4.2 cho thấy, phương pháp RT-LAMP nhạy phương pháp RT-PCR chẩn đoán vi-rút PRRS (19/23 mẫu dương tính so với 18/23) Kết cho thấy, ứng dụng phương pháp RT-LAMP chẩn đoán vi-rút PRRS cần thiết, cho phép phát mẫu âm tính giả xét nghiệm kỹ thuật RT-PCR Phương pháp RT-LAMP có nhiều ưu điểm như: thực đơn giản, nhanh, độ nhạy cao tiết kiệm chi phí nên hữu dụng chẩn đốn vi-rút PRRS Phương pháp RT-LAMP chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều Việt Nam Những kết đạt đề tài với số nghiên cứu khác giới cho thấy khả to lớn phương pháp RT-LAMP chẩn đoán vi-rút PRRS nước ta 35   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phương pháp RT-LAMP với primer theo nghiên cứu Chen Qin ctv (2007) có khả chẩn đốn hai dịng vi-rút PRRS châu Âu Bắc Mỹ Phương pháp RT-LAMP có ngưỡng phát 10-1 copies/µl Phương pháp RT-LAMP nhạy RT-PCR 100 lần, có khả phát mẫu âm tính giả với phản ứng RT-PCR Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng đèn UV với thuốc nhuộm SYBR Green xác, thực đơn giản, tiết kiệm chi phí, thời gian Ngoài ra, sử dụng SYBR Green rẻ tiền bớt độc hại điện di sử dụng ethidium bromide Phương pháp RT-LAMP thực đơn giản, nhanh chóng, hiệu quả, tiết kiệm thời gian chi phí so với phương pháp chẩn đoán RT-PCR hay nested RT-PCR 5.2 Đề nghị Tiến hành thiết kế primer khác có khả phân biệt chủng vi-rút PRRS khác Đặc biệt thiết kế primer có khả phát vi-rút PRRS chủng Trung Quốc-Bắc Mỹ độc lực cao dòng vi-rút gây bệnh PRRS Việt Nam Xây dựng phát triển phương pháp thành kit, ứng dụng vào thực tế chăn ni tỉnh thành phía Nam sau mở rộng tỉnh thành nước Đặc biệt nơi khơng có điều kiện thực kỹ thuật chẩn đốn phức tạp, địi hỏi nhiều thời gian, tiền máy móc đại 36   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lăng Văn Đức 2009 Chẩn đoán virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật nested RT – PCR Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công nghệ Sinh học trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tồn 2007 Chẩn đốn vi-rut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT – PCR Tạp chí KHKT tập XIV, Số 5, - 12 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ 2007 Một số hiểu biết vi-rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRSV) Tài liệu hội thảo PRRS, Hà Nội, 10/2007, - 12 Võ Khánh Hưng 2009 Phân tích trình tự gen ORF5 ORF7 vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công nghệ Sinh học trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan 2007 Hội chứng rối loạn hô hấp rối loạn sinh sản Tài liệu hội thảo PRRS, Hà Nội, tháng 10/2007, 17 - 18 Tiếng Anh Albert Rovira 2008 Development of a simple on-site diagnostic test to detect PRRSV acute infection in boar studies Porkcheckoff NPB 06: 06 - 154 Albert Rovira, Juan Abrahante, Michael Murtaugh and Claudia Munoz-Zanzi 2008 Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Vet Diagn Invest 21: 350 – 354 Changmu Chen, Shangjin Cui, Chaofan Zhang, Jun Li and Jinbao Wang 2009 Development and validation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of PRRSV Virus genes 40: 76 – 83 10 Chen Qin, Li Jian, Fang Xue-En and Xiong Wei 2007 Rapid Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Intervirology 52: 86 – 91 11 Dal Young Kim 2007 The applications of a PRRSV reverse genetic system for the study of nonstructural protein (nsp) function Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree doctor of philosophy department of Diagnostic Medicine/Pathobiology College of Veterinary Medicine 2007 12 Danny N.P Doan and Terje Dokland 2003 Structure of the Nucleocapsid Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.  Structure vol 11, pp 1445 – 1451 37   13 Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, Pirzadeh B and Rogan D 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659 – 688 14 Fei Xue, Yuna Sun, Liming Yan, Cong Zhao, Ji Chen, Mark Bartlam, Xuemei Li, Zhiyong Lou and Zihe Rao 2010 The Crystal Structure of the PRRSV Nonstructural Protein Nsp1β Reveals a Novel Metal-dependent Nuclease.  J Virol Doi 10.1128/JVI, 00301 - 00310 15 Calvert, Pearce, Siao-Kun and Wan Welch 2003 A reverse genetics approach to PRRS virus gene function 4th International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases – Rome June 29th – July 2nd, pp 51 - 52 16 Zimmerman 2003 2003 PRRS compendium producer edition chapter Historical Overview of PRRS Virus, pp - 17 Hill H.1990 Overview and history of Mystery Swine Disease (Swine infertility/respiratory syndrome) Proc Mystery Swine Disease Committee Meeting, Livestock Conservation Institute, Denver, Colorado, pp 29 - 31 18 M de Lima, Ansari, Das, B J Ku, F J Martinez-Lobo, A K Pattnaik and F.A 2009 OsorioGP3 is a structural component of the PRRSV type II (US) virion.  Virology 390, pp 31 - 36 19 Martínez E, Riera P, Sitjà M, Fang Y, Oliveira S and Maldonado J 2007 Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green Res Vet Sci 85: 184 - 93 20 M P Murtaugh, M R Elam, and L T Kakach 1995 Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus ArchVirol 140: 1451 - 1460 21 Meulenberg JJ, de Meijer EJ and Moormann RJ 1993 Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence J Gen Virol 74: 1697 - 1701 22 Meulenberg JJ, Petersen den Besten A, de Kluyver E, van Nieuwstadt A and Wensvoort G, Moormann RJ 1997 Molecular characterization of Lelystad virus Vet Microbiol 55: 197 - 202 23 Meulenberg, J.J, van Nieuwstadt, A.P., van Essen Zandbergenl, A., Bos de Ruijter, J.N., Langeveld, J.P., Meloen and R.H 1998 Localization andfine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies Virology 252: 106 – 114 24 Yuna Sun, Fei Xue, Yu Guo, Ming Ma, Ning Hao, Xuejun C Zhang, Zhiyong Lou, Xuemei Li and Zihe Rao 2009 Crystal Structure of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Leader Protease Nsp1α Journal of virology, pp 10931 – 10940 25 Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken nui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam NguyenDi Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong 38   Tian and George F Gao 2007 Porcine Respiratoryand ReproductiveSyndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007. Emerging Infectious Disease vol 14: 1774 - 1776 26 William T Christianson and HanSoo Joo 1994.  Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review Swine Health and Production, pp - 28 Tài liệu internet http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-virus PRRS-strains.asp http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-virus PRRS-strains.asp http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-virus PRRS-structure.asp http://www.roche-applied-science.com http://tools.neb.com/NEBcutter2/ 39     PHỤ LỤC Bảng Kết khảo sát mẫu thực địa phương pháp RT-LAMP RT-PCR STT Kí hiệu mẫu Nơi lấy mẫu (+)PCR (-)PCR (+)LAMP (-)LAMP ST1 Đồng Nai X X ST2 Đồng Nai X X ST3 Đồng Nai X X R2 Bình Dương X X R4 Bình Dương X X R10 Bình Dương X X R12 Bình Dương X X AMER Vaccine X X ING Vaccine X X 10 MB11 TP.HCM X X 11 MB33 TP.HCM X X 12 MA32 TP.HCM X X 13 MA62 TP.HCM X X 14 NA13S TP.HCM X X 15 NA13T TP.HCM X X 16 NB11 TP.HCM X X 17 NB13 TP.HCM X 18 Đồng Nai X X 19 Đồng Nai X X 20 Đồng Nai X X 21 28 Đồng Nai X X 22 31 Đồng Nai 23 15 Đồng Nai X X X X X (+)PCR, (-) PCR: dương tính âm với vi-rút PRRS phản ứng RT-PCR; (+) LAMP, (-)LAMP: dương tính âm tính với vi-rút PRRS phản ứng RT-LAMP     ... 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reductive and Respiratory Syndrome -PRRS) ghi nhận lần đầu Mỹ năm 1987 Và nhanh chóng, bệnh lây... dịch bệnh mối lo ngại hàng đầu Một số dịch bệnh nguy hiểm bệnh rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reproductive and Respiratory SyndromePRRS) vi-rút PRRS gây Bệnh PRRS diễn biến phức tạp, gây. .. TẮT Bệnh rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) vi-rút PRRS gây bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế lớn Tại Việt Nam, việc chẩn đoán phương pháp