Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 1: 62 - 67 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI 62 ứng dụng một số kỹ thuật trong chẩn đoán v phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp trên lợn nái Application of Some Techniques to Diagnose and Isolate Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus from Sows Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An Trng i hc Nụng nghip H Ni a ch email tỏc gi liờn lc: lanjp2000@yahoo.com TểM TT RK thut bnh lý v húa min dch t chc ó c s dng phỏt hin virus cú trong 5 ln nỏi b nghi mc hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome- PRRS). Sau ú, cỏc mu bnh phm gm: phi, hch phi, t cung t cỏc ln nỏi ú ó c s dng phõn lp virus trờn dũng t bo Marc 145. Cỏc chng virus PRRS gõy bnh cho ln nỏi Vit Nam phỏt trin tt trờn mụi tr ng t bo Marc 145 v gõy nờn bnh tớch t bo, bnh tớch t bo xut hin sau 48 gi gõy nhim. RT khúa: Hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (PRRS), ln nỏi, phõn lp, virus. SUMMARY RPathological and immunohistochemical techniques were applied to detect target virus from 5 sows infected with PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). After that, samples of lung, pulmonary lymphnode and uterus of the above sows were used for isolation of PRRS virus in Marc 145 cell line. It was found that the virus causing PRRS in sows in Viet Nam could be isolated and grew well in Marc 145 cell line with cito pathogenic effect (CPE) observed 48h after inoculation in all samples. RKey words: Isolation, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS), sows, virus. R1. ĐặT VấN Đề RHiện nay, ngnh chăn nuôi nớc ta đang ngy cng đợc chú trọng phát triển v giữ một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, trong đó, chăn nuôi lợn đã trở thnh nguồn thu nhập chủ yếu đối với nhiều hộ nông dân. Cùng với sự phát triển của ngnh chăn nuôi, vấn đề dịch bệnh luôn song hnh v gây nhiều tổn thất cho ngời chăn nuôi, đặc biệt, chăn nuôi lợn nái đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn con giống nhng thờng xuyên bị đe dọa bởi dịch bệnh. Hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp (PRRS) l bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loi lợn. Theo Nguyễn Hữu Nam v Nguyễn Thị Lan (2007), PRRS l bệnh phức tạp với các đặc trng l lợn nái sinh sản bị sảy thai, chết thai, thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu. Chủng virus PRRS châu Âu đã đợc phân lập đầu tiên ở H Lan (Wenswooet v cs., 1991) v chủng PRRS Bắc Mỹ đợc tìm thấy ở Mỹ (Benfield v cs., 1992). ở Việt Nam, những nghiên cứu về virus PRRS (PRRSV) nói chung còn rất ít. Theo Nguyễn Bá Hiên v Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007), đích tấn công của virus l các đại thực bo, đây l tế bo duy nhất có điểm cảm thụ (yếu tố cảm thụ) phù hợp với cấu trúc hạt virus. Vì vậy virus hấp thụ v thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bo ny v phá huỷ nó. Tế bo Marc l đại thực b o phế nang của lợn thích hợp cho sự nhân lên của virus (Murakami v cs., 1994; Shimizu v cs., 1994). ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp 63 Vì vậy, môi trờng tế bo Marc 145 đã đợc sử dụng để tiến hnh phân lập virus PRRS trên từ các lợn nái mắc bệnh đợc chẩn đoán bằng các kỹ thuật bệnh lý v hoá miễn dịch nhằm cung cấp thông tin cho các nghiên cứu sâu hơn về PRRSV góp phần vo việc sản xuất kít chẩn đoán v chế vacxin phòng bệnh. 2. NGUYÊN LIệU - PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1. Nguyên liệu - Các lợn nái nghi mắc PRRS (đợc mổ khám v lấy mẫu ở các phủ tạng nh phổi, hạch phổi, tim, gan, lách ). - Tế bo Marc 145 đợc nuôi cấy trên các đĩa lồng. - Hoá chất, dụng cụ sử dụng trong kỹ thuật lm tiêu bản bệnh lý, kỹ thuật hoá mô miễn dịch v kỹ thuật nuôi cấy tế bo. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu - Sử dụng các phơng pháp thí nghiệm thờng quy trong phòng thí nghiệm bệnh lý nh phơng pháp mổ khám, phơng pháp lm tiêu bản bệnh lý v các kỹ thuật mới nh phơng pháp hóa mô miễn dịch, phơng pháp phân lập virus. + Phơng pháp hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC): cho phép chẩn đoán chính xác lợn mắc PRRS. Mẫu bệnh phẩm sau khi đợc cắt thnh tiêu bản bệnh lý sẽ đợc lm sạch parafin. Tiến hnh hoạt hoá enzym bằng cách ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS (Phosphat buffer saline) 1X v hấp ớt ở 121 P 0 P C trong 5 phút. Khử peroxydase nội sinh dùng H B 2 BOB 2 B trong dung môi Methanol (tỉ lệ 1:9). Gắn kháng thể (KT), nhỏ KT kháng PRRSV chuẩn lên tiêu bản, ủ tiêu bản ở tủ ấm 37 P 0 P C trong 1 giờ hoặc 4 P 0 P C qua đêm. Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS (lặp lại 3 lần). Gắn kháng kháng thể (KKT) có gắn enzyme (Dako-Japan) lên tiêu bản, ủ ở 37 P 0 P C trong 1 giờ v rửa lại tiêu bản. Gắn cơ chất, ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB (3,3'-diaminobenzidine) khoảng 3- 8 phút. Tiến hnh nhuộm nhân tế bo bằng Hematoxylin, lm sạch v gắn baume Canada, quan sát kết quả trên kính hiển vi quang học. + Phơng pháp phân lập virus gồm 3 bớc: Bớc 1 chuẩn bị tế bo phân lập: Tế bo Marc 145 đợc đa vo nuôi cấy trong môi trờng v điều kiện thích hợp, môi trờng DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum) lm ấm trong tủ 37 P o P C trong 30 phút trớc khi lấy tế bo mọc vừa kín đáy đĩa lồng thì tiến hnh gây nhiễm virus. Bớc 2 chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu bệnh phẩm đợc nghiền nát bằng chy v cối vô trùng sau đó đợc đồng nhất trong dung dịch DMEM. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc đợc lấy để gây nhiễm vo tế bo Marc 145. Bớc 3 gây nhiễm virus v quan sát kết quả: Từ các đĩa lồng tế bo đã chuẩn bị ở bớc 1 hút bỏ môi trờng nuôi cấy v bổ sung 100 l mẫu đã chuẩn bị ở bớc 2. Tế bo gây nhiễm virus đợc ủ ở 37 P 0 P C với 5% CO B 2 Btrong 30 phút. Bổ sung 1,5 ml môi trờng DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth) vo đĩa lồng v để ở 37 P 0 P C với 5% CO B 2 B.B BHng ngy theo dõi sự phá huỷ tế bo bằng kính hiển vi soi nổi v thu lại virus khi tế bo bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng . 3. KếT QUả 3.1. Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn nái mắc PRRS Trên cơ sở thu thập các mẫu bệnh phẩm từ những lợn nái ở các địa phơng khác nhau có các dấu hiệu đặc trng của PRRS nh: phát ban, khó thở, có nhử mắt, tím tai, sảy thai, viêm vú mất sữa, nghiên cứu ny đã chọn 5 lợn nái có bệnh tích điển hình để nghiên cứu tiếp. Các biến đổi bệnh lý của lợn nái mắc PRRS tập trung chủ yếu ở phổi, hạch lâm ba (HLB) v tử cung (Bảng 1 v 2; các hình 1, 2, 3, 4). Bên cạnh đó, các bệnh tích ở lách, thận v một số cơ quan khác l không đặc trng v phụ thuộc vo tình trạng, diễn biến của bệnh cũng nh sự kế phát của các bệnh khác. Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An 64 RBảng 1. Bệnh tích đại thể chủ yếu của 05 lợn nái mắc PRRS C quan STT Tờn Phi viờm HLB sng Thn xut huyt Lỏch nhi huyt C tim nhóo T cung viờm 1 Nỏi mang thai 1-N1 +++ ++ - - - +++ 2 Nỏi mang thai 2-N2 ++++ +++ +++ - ++ ++++ 3 Nỏi nuụi con 1-N3 ++++ +++ +++ ++ +++ ++ 4 Nỏi nuụi con 2-N4 +++ ++ ++ ++ - ++ 5 Nỏi nuụi con 3-N5 +++ ++ - - - ++ Ghi chỳ: ++++ Rt nng +++ Nng ++Trung bỡnh +Nh - Khụng biu hin RBảng 2. Bệnh tích vi thể chủ yếu của 05 lợn nái mắc PRRS C quan TT Tờn Phi HLB Lỏch Thn T cung 1 N1 - Xut huyt - Vỏch ph nang t nỏt - Xut huyt - Xut huyt - K thn xut huyt - Thõm nhim t bo viờm 2 N2 - Xut huyt - T bo viờm ph nang - S lng lõm ba cu gim - Xut huyt - Vỏch t nỏt - Cu thn viờm - Tng sinh t bo x 3 N3 - Ph nang cú dch viờm v i thc bo - Nang lõm ba teo - Tu trng teo li, vỏch t nỏt - Cu thn viờm, lũng ng rng cú tr trong - Niờm mc t cung t nỏt 4 N4 - Ph qun ph viờm - Xut huyt - Thoỏi hoỏ v ho i t - Xoang bao man gión rng - Thõm nhim t bo viờm 5 N5 - K phi tng sinh t bo x - Xut huyt - Xut huyt - T bo thn b thoỏi hoỏ, hoi t - Khụng cú bin i vi th Hình 1. Phổi viêm Hình 2. Thận xuất huyết Hình 3. Hạch lâm ba xuất huyết (HE x40) Hình 4. Dịch phù trong lòng phế nang (HE x40) ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp 65 3.2. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch Từ các lợn nái nghi mắc PRRS đợc lựa chọn, nghiên cứu ny tiến hnh nhuộm hoá miễn dịch tổ chức với các mẫu phổi, hạch phổi v tử cung của 5 lợn trên để chẩn đoán xác định sự có mặt của virus PRRS lm cơ sở cho việc phân lập virus (Bảng 3). Trên các block phổi, hạch phổi v tử cung của các lợn nái nghiên cứu đợc lựa chọn lm hóa miễn dịch đều cho kết quả dơng tính với PRRSV biểu hiện l những đám tổ chức bắt mu vng nâu trên tiêu bản vi thể của tổ chức phổi, hạch phổi, tử cung của lợn bệnh. Sở dĩ phổi, hạch phổi v tử cung đợc lựa chọn thực hiện kỹ thuật hoá mô miễn dịch vì những biến đổi bệnh lý của lợn nái mắc PRRS đợc quan sát thấy tập trung chủ yếu ở phổi, hạch phổi v tử cung. Virus PRRS có đặc điểm l rất thích hợp với đại thực bo, đặc biệt l đại thực bo vùng phổi. Đây l tế bo duy nhất có điểm cảm thụ phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ v thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bo ny v phá huỷ nó (Hình 5 v 6). 3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trờng tế bo Marc145 5 lợn có các biểu hiện lâm sng đặc trng của PRRS sau khi đợc tiến hnh mổ khám, lấy mẫu, bảo quản, lm tiêu bản vi thể v lm hoá miễn dịch xác định sự có mặt của virus, nghiên cứu đã tiến hnh phân lập virus trên môi trờng tế bo Marc 145 (Bảng 4). Bệnh tích tế bo của virus PRRS đợc biểu hiện l các tế bo co cụm lại với nhau, chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy v khi tế bo bị virus phá hủy hon ton thì bong khỏi đáy bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh tích ny bằng mắt thờng. Tuy nhiên, thể CPE ny cũng rất dễ nhầm lẫn với những tế bo bị chết theo cơ chế Apoptosis nếu không quan sát kỹ. Để quan sát chính xác hơn cũng có thể dùng kính hiển vi điện tử quét để quan sát sự thay đổi hình thái tế bo. Trong tổng số 13 mẫu tiến hnh phân lập virus của 5 lợn nái mắc PRRS, 10 mẫu có bệnh tích tế bo ở mức độ khác nhau, 3 mẫu không có bệnh tích tế bo. Nh vậy, sự có mặt của virus ở các cơ quan, bộ phận của lợn bệnh l không giống nhau. Điều ny cũng giải thích nguyên nhân tại sao khi tiến hnh nhuộm hóa miễn dịch các mẫu block cho kết quả dơng tính m khi phân lập virus lại âm tính. Nh vậy, sự tập trung virus ở các cơ quan v ở mỗi thời điểm bệnh l khác nhau. Trong các mẫu bệnh phẩm phân lập thì bệnh tích tế bo xuất hiện sớm nhất sau 48h phân lập v sau 84h tế bo bị phá hủy hon ton. Mẫu phổi cho khả năng phân lập virus rất cao. Điều ny giải thích cho những biến đổi đại thể chủ yếu ở lợn mắc PRRS l hiện tợng viêm phổi do virus tập trung ở phổi với số lợng lớn v phá hủy nghiêm trọng chức năng của phổi vì đích tấn công của virus l các đại thực bo phế nang, tại đây chúng nhân lên v phá hủy các tế bo ny gây nên bệnh tích đặc trng ở phổi v một lợng lớn tế bo đại thực bo trong nang phổi bị virus xâm nhiễm nên dễ dng quan sát CPE khi phân lập virus từ phổi. Kết quả của nghiên cứu n y cũng phù hợp với nghiên cứu của Murakami v cs. (1994), Shimizu v cs. (1994). Sau khi tiến hnh phân lập đợc virus PRRS, nghiên cứu thực hiện phản ứng hóa miễn dịch tế bo với kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS để khẳng định bệnh tích tế bo thu đợc l do virus PRRS gây nên v kết quả của các mẫu virus thu đợc đều cho kết quả hoá miễn dịch tế bo dơng tính với virus PRRS (Hình 7 v 8). RBảng 3. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch Phi Hch phi T cung STT Kớ hiu Block 1 Block 2 Block 1 Block 2 Block 1 Block 2 1 N1 + + + + + + 2 N2 + + - + + + 3 N3 + + + + - - 4 N4 - + + + - - 5 N5 - + - + - - + Cú virus - Khụng cú virus Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Tiêu Quang An 66 H×nh 5. Virus tËp trung ë phæi H×nh 6. Virus tËp trung ë h¹ch phæi RB¶ng 4. KÕt qu¶ ph©n lËp virus PRRS trªn m«i tr−êng tÕ bμo Marc 145 CPE (Cytopathology effect) STT Kí hiệu Bệnh phẩm 36h* 48h 60h 72h 84h Phổi - 10%** 70% 100% Hạch phổi - 5% 60% 80% 100% 1 N1 Tử cung - - - - - Phổi - 10% 75% 100% Hạch phổi - - - - - 2 N2 Tử cung - 5% 60% 80% 100% Phổi - 15% 90% 100% 3 N3 Hạch phổi - - - - - Phổi - 15% 85% 100% Hạch phổi - 10% 75% 100% 4 N4 Tử cung - 5% 40% 85% 100% Phổi - 5% 50% 80% 100% 5 N5 Hạch phổi - 15% 85% 100% Chú thích : - Không có bệnh tích * : số giờ sau gây nhiễm ** : bệnh tích tế bào so với tổng số diện tích đáy bình H×nh 7 . TÕ bμo Marc 145 b×nh th−êng H×nh 8. CPE tõ mÉu lîn m¾c PRRS ng dng mt s k thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp 67 4. KếT LUậN Kỹ thuật bệnh lý v hoá mô miễn dịch cho phép chẩn đoán chính xác 05 lợn nái mắc hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp. Đã phân lập đợc virus PRRS từ các mẫu bệnh phẩm của lợn nái thu thập đợc. Tế bo Marc 145 l tế bo thích hợp để phân lập virus PRRS, virus nhân lên nhanh trong tế bo v gây bệnh tích điển hình. Bệnh tích tế bo đợc biểu hiện l các tế bo co cụm lại với nhau chồi lên khỏi đáy bình. Tế bo Marc 145 bị PRRSV phá huỷ trung bình sau 48h gây nhiễm, đạt mức độ cao nhất sau 72h v bị phá huỷ muộn nhất l 84h. TI LIệU THAM KHảO Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2007). Một số hiểu biết về virus gây hội chứng rối loạn hô hấp v sinh sản của lợn, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng Đại học Nông nghiệp H Nội. Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007). Hội chứng rối loạn hô hấp v sinh sản, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng Đại học Nông nghiệp H Nội. Benfield D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L., Goyal S.M., Bobinson D., Christianson T.T., Morrison R.B., Gorcyca D., Chladek D., (1992). Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR2332). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 4, pp. 127133. Lunney J.K., Benfield D.A., Rowland R.R., ( T2010)T. HTPorcine reproductive and respiratory syndrome virus: An update on an emerging and re-emerging viral disease of swine. TH TJournal of Virus Research 7, pp. 286 TT. Oct 14.T Murakami Y, Kato A. (1994). Isolation and serological characterization of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus from pigs with reproductive and respiratory disoders in Japan, J Vet Med Sci 56, pp. 891- 894. Shimuzi M, Yamada S. (1994). Isolation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus from Heko Hekeo disease of pigs. J Vet Med Sci 56, pp. 389 - 391. Wensvoort G., Terpstra C., Pol JMA, (1991). Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus, The Veterinary Quarterly, vol. 13, No. 3, pp. 121-130, Jul. Yi J, Liu, C., HTMolecular characterization of porcine circovirus 2 isolated from diseased pigs co-infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. TH TVirol JTT. 2010, 14 :286. T . s 1: 62 - 67 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI 62 ứng dụng một số kỹ thuật trong chẩn đoán v phân lập virus gây hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp trên lợn nái Application of Some Techniques to. sinh sản của lợn, Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng Đại học Nông nghiệp H Nội. Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007). Hội chứng rối loạn hô hấp. thut trong chn oỏn v phõn lp virus gõy hi chng ri lon sinh sn v hụ hp 67 4. KếT LUậN Kỹ thuật bệnh lý v hoá mô miễn dịch cho phép chẩn đoán chính xác 05 lợn nái mắc hội chứng rối loạn sinh sản